專利名稱：堿基序列檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及堿基序列檢測方法，更詳細地說，涉及SNPs(single nucleotidepolymorphisms)、甲基化胞嘧啶等對單堿基的變異和變化的檢測方法、以及利用此方法的基因的診斷方法。
背景技術(shù)：
人類基因組的解析已經(jīng)結(jié)束，基因組信息在各個領(lǐng)域得到應(yīng)用的時代已經(jīng)來臨。人的個體性和對藥品的敏感性在基因水平上的闡明正不斷推進，其結(jié)果將被應(yīng)用于診斷和治療之中。這其中尤其是基因組序列中的單核苷酸多態(tài)(SNPs)被認(rèn)為起著重要的作用。SNPs的數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建正在進行，并開始應(yīng)用于各種診斷。
對于SNPs的解析提出了以下多種方法DNA序列確定方法，在變異部分插入與該變異對應(yīng)的熒光標(biāo)記核酸后、用凝膠電泳進行檢測的方法，根據(jù)變異部分的有無使用具有活性作用的熒光探針的方法，或如DNA芯片等那樣區(qū)分探針是否和靶點穩(wěn)定雜交的方法，以及利用階段性互補鏈合成來確定序列的方法等。這些方法中很多是為制作SNPs數(shù)據(jù)庫而開發(fā)的技術(shù)，裝置往往龐大且造價高。因此希望使用簡便、運行成本低廉的SNPs的檢測方法。
DNA堿基序列的檢測方法大致可以分為利用熒光的方法和利用化學(xué)發(fā)光的方法等兩種方法。在使用熒光的方法中，由于光源是必需的，因而通常裝置龐大。另一方面，在使用化學(xué)發(fā)光的方法中，以往主要是采用熒光素酶反應(yīng)對ATP進行檢測和對細菌進行檢測(檢測ATP)，但最近使用的是焦磷酸測序技術(shù)(Pyrosequencing)，該技術(shù)利用化學(xué)發(fā)光來確定DNA堿基序列。
在焦磷酸測序技術(shù)中，將DNA互補鏈合成時生成的焦磷酸變成ATP，進行以該ATP為底物的熒光素·熒光素酶反應(yīng)，通過檢測產(chǎn)生的光來確定序列。即，按照順序向反應(yīng)槽中注入核酸底物，進行DNA互補鏈的合成反應(yīng)。如果觀察到光，說明互補鏈合成反應(yīng)已經(jīng)進行，則從注入的核酸底物可以確定被插入位點的堿基。反應(yīng)后，剩余的底物迅速進行酶分解，使得在注入下一個核酸底物時在反應(yīng)槽中幾乎不存在。由于發(fā)光量與互補鏈合成的量成比例，同時插入2個底物時能觀察到2倍的發(fā)光。
但是，人基因組DNA是來源于母親和父親的2個等位基因進行配對，DNA樣品有雜合樣品和純合樣品，其中雜合樣品具有針對特定位點的序列的2種不同的等位基因，而純合樣品具有相同的等位基因。焦磷酸測序技術(shù)的情況下，雜合樣品中得到的信號強度是純合樣品的一半，對于不同樣品，這種一半的信號強度有時會持續(xù)一會。但是，這種情況在正確了解以SNPs為首的序列信息方面存在困難。
另外，在DNA互補鏈合成時，通常使用4種堿基dATP、dCTP、dGTP、dTTP進行互補鏈的合成，但由于發(fā)光底物dATP與ATP的結(jié)構(gòu)相似，也可作為熒光素酶反應(yīng)的反應(yīng)底物。即，為進行互補鏈的合成而加入dATP時，會引發(fā)熒光素酶反應(yīng)，即使不引起DNA互補鏈的合成，也能觀察到發(fā)光。與此相反，國際專利申請98/13523號(特表2001-501092號公報)公開了使用不會成為發(fā)光底物的dATP類似物dATPαS和ddATP類似物進行互補鏈合成的方法，但由于dATPαS價格高而存在運行成本高的問題。
而且，在使用ATP的熒光素酶反應(yīng)中，發(fā)光的同時會生成焦磷酸作為反應(yīng)產(chǎn)物，但焦磷酸再次轉(zhuǎn)換成ATP作為發(fā)光反應(yīng)的底物。即，發(fā)光能一直持續(xù)。與此相反，國際專利申請98/28440號(特表2001-506864號公報)公開了為了在每次加入核酸底物時發(fā)光(信號)，使分解酶三磷酸腺苷雙磷酸酶共存于反應(yīng)液中，從而迅速分解加入的dNTP和ATP。但是，由于三磷酸腺苷雙磷酸酶的用量大時，會妨礙反應(yīng)的進行，而用量小時，會發(fā)生由殘存的dNTP引起的反應(yīng)，因而存在使用困難、價格高的問題。
此外，Science 1987，238，336-341報道了向反應(yīng)槽中一起加入4種熒光標(biāo)記終止劑，通過單核苷酸互補鏈的延伸檢測DNA變異的方法。但是，在此反應(yīng)中，互補鏈延伸后，由于要分離插入的熒光標(biāo)記終止劑產(chǎn)生的熒光和剩余終止劑產(chǎn)生的熒光后進行檢測，所以必須利用凝膠電泳分離生成物再進行檢測。另外，Nucleic Acids Research，2000，Vol.28，Nol.12報道了4種終止劑同時加入反應(yīng)槽中，進行單核苷酸延伸反應(yīng)，再使用質(zhì)量分析儀分析生成物的方法，但是，由于需要價格昂貴的裝置，因而缺乏廣泛應(yīng)用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于解決以往技術(shù)中的問題，提供廉價而且重復(fù)性好、簡便的堿基序列檢測方法，尤其是能在一個反應(yīng)槽中檢測多個單核苷酸變異的堿基序列檢測方法。
為克服上述課題，本發(fā)明提供以化學(xué)發(fā)光檢測方法為基礎(chǔ)的、廉價、重復(fù)性好、簡便的堿基序列檢測方法。在以往的焦磷酸測序技術(shù)中，為了不影響后面的反應(yīng)，用三磷酸腺苷雙磷酸酶分解加入的核酸底物，為降低背景發(fā)光，又必須使用dATPαS等高價樣品。在本發(fā)明的方法中，互補鏈合成反應(yīng)以單個堿基終止，通過使用不能進行1個堿基以上的互補鏈延伸的擬核酸堿基(ddNTP)，解決了這些問題。
即，使用無3’末端延伸能力的4種ddNTP作為互補鏈合成試劑，階段性進行互補鏈合成反應(yīng)，再利用化學(xué)發(fā)光確定靶位點的堿基序列。在本發(fā)明的方法中，由于插入的核酸堿基無延伸能力，所以不必加入三磷酸腺苷雙磷酸酶等分解酶。以往認(rèn)為ddATP與dATP產(chǎn)生同樣背景發(fā)光，因而一直回避使用ddATP。但是，發(fā)明人已證實，ddATP與dATP不同，其作為熒光素酶反應(yīng)的底物的活性低，因此不必使用價格高的dATPαS。而且，本發(fā)明中通過向試劑中加入微量PPase，降低背景化學(xué)發(fā)光，也能高靈敏度地進行堿基序列的檢測。另外，通過使用多個引物，能在1個反應(yīng)槽中檢測多個變異位點。
如果利用本發(fā)明，能利用化學(xué)發(fā)光簡便裝置檢測特定位點的堿基序列和變異的有無。本發(fā)明中使用的核酸底物(ddNTP)沒有3’末端延伸能力，在插入到DNA鏈后，不能進行后面的互補鏈的合成，因而不必使用三磷酸腺苷雙磷酸酶等高價分解酶分解所加入的核酸底物。另外，由于ddNTP不會成為熒光素酶反應(yīng)的底物，因而也不必使用dATPαS等高價試劑。在本發(fā)明的方法中使用的試劑(ddNTP和Ppase等)都是廉價的，又由于能在1個反應(yīng)槽中同時檢測多個變異位點，所以與以往的檢查方法比較，成本和時間都得以降低。


圖1是表示對利用本發(fā)明的方法和焦磷酸測序技術(shù)法的階段反應(yīng)的比較。
圖2是表示本發(fā)明方法(實施例1)中的反應(yīng)式。
圖3是比較利用本發(fā)明得到的發(fā)光類型和焦磷酸測序技術(shù)中得到的發(fā)光類型。
圖4是比較以dATP、dATPαS、ddATP以及ddATPαS作為底物時的熒光素酶反應(yīng)引起的發(fā)光強度的曲線圖。
圖5是表示在本發(fā)明的方法中使用酶PPDK、并以AMP作為底物合成ATP的反應(yīng)式。
圖6是表示3個SNPs的組合和觀察到的發(fā)光類型。
圖7是表示在3個SNPs的檢測中的發(fā)光類型的曲線圖。
圖8是表示按順序注入3種引物檢測多個SNPs的例子中的發(fā)光類型的曲線圖。
圖9是表示實施例2中除去三磷酸腺苷雙磷酸酶進行檢測的情況下(添加PPase 40mU/mL)得到的發(fā)光類型。
其中，101引物102來自父親的等位基因的一側(cè)DNA鏈103來自母親的等位基因的一側(cè)DNA鏈1021多態(tài)位點的堿基(A)1031多態(tài)位點的堿基(B)301添加ddCTP引起的發(fā)光強度的增加302添加ddTTP引起的發(fā)光強度的增加303添加dCTP引起的發(fā)光強度的增加304添加dTTP引起的發(fā)光強度的增加305-308向反應(yīng)槽中加入三磷酸腺苷雙磷酸酶時的發(fā)光強度的變化401ATP引起的發(fā)光402dATP引起的發(fā)光403dATPαS引起的發(fā)光404ddATP引起的發(fā)光405ddATPαS引起的發(fā)光
701加入ddATP時的發(fā)光強度(其他的3倍的強度)702加入ddCTP時的發(fā)光強度703加入ddGTP時的發(fā)光強度704加入ddCTP時的發(fā)光強度801用引物-2測定時加入ddATP時的發(fā)光802用引物-2測定時加入ddGTP時的發(fā)光803，804用引物-3測定時加入ddATP和ddGTP時的發(fā)光具體實施方式
本發(fā)明的方法是堿基序列檢測方法，該方法包括以下工序向有核酸樣品的反應(yīng)槽中加入ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP等4種ddNTP或其衍生物中任一種進行互補鏈合成，使靶位點延伸一個堿基的工序；使所得的焦磷酸生成ATP，并以此為反應(yīng)底物進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的工序；以及利用所述化學(xué)發(fā)光判斷互補鏈合成的有無，確定所述靶位點的堿基序列的工序。
4種ddNTP或其衍生物按順序每次一種加入反應(yīng)槽中，通過只有注入與檢測對象位點互補的核酸堿基才產(chǎn)生的發(fā)光，能夠確定靶位點的堿基種類。ddNTP和其衍生物本身就是互補鏈合成的底物，但是由于其沒有3’末端延伸能力，因而所述互補鏈的合成只限于1個堿基的延伸，所得化學(xué)發(fā)光通常是一個堿基所對應(yīng)的發(fā)光強度。另外，作為ddNTP的衍生物，例如，可以舉出ddATPαS等ddNTPαS。
以ATP作為反應(yīng)底物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可以采用熒光素·熒光素酶體系的酶發(fā)光反應(yīng)。焦磷酸轉(zhuǎn)變成ATP可以利用以往的APS和ATP硫酸化酶反應(yīng)體系，然而，如果使用不會成為熒光素反應(yīng)的底物的AMP和丙酮酸磷酸二激酶反應(yīng)體系，能避免背景發(fā)光的問題。
通過預(yù)先使分解焦磷酸和/或ATP的酶共存于反應(yīng)槽中，可以使熒光素酶反應(yīng)中生成的焦磷酸和ATP馬上分解，因而，收集一定時間內(nèi)(1分鐘)的發(fā)光，可以得到明顯的峰。作為分解焦磷酸和/或ATP的酶，可以使用焦磷酸酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶，但優(yōu)選廉價且活性高的焦磷酸酶。
本發(fā)明的方法能用于檢測包含單堿基取代(SNPs)、癌變所伴隨的堿基變異和甲基化(甲基化胞嘧啶等)、人為的堿基取代等在內(nèi)的所有單堿基的變異和變化?？蓹z測的位點不只限于1個，只要滿足后述的一定條件，就能在1個反應(yīng)槽中簡便地檢測2個或2個以上的靶位點。
檢測多個靶位點的情況下，準(zhǔn)備與各位點對應(yīng)的引物，使用其中2或3種引物，同時進行利用上述4種ddNTP及其衍生物的互補鏈合成和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，由所得結(jié)果確定與上述2或3種引物對應(yīng)的靶位點的堿基序列?；蛘?，利用1種引物，進行利用上述4種ddNTP或其衍生物的互補鏈合成和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，確定對應(yīng)靶位點的堿基序列后，再分解或除去添加到反應(yīng)槽中的ddNTP及其衍生物，也可以按順序利用接下來的引物確定靶位點。另外，也可以反復(fù)進行同時向反應(yīng)槽中添加2種或2種以上引物同時檢測2個或2個以上靶位點的工序。作為分解除去ddNTP的方法，可以舉出上述酶解、和將核酸樣品固定在固相上后用反應(yīng)液沖洗的方法。
本發(fā)明也提供用于上述堿基序列檢測方法的試劑盒。該試劑盒中含有1)對應(yīng)于堿基AGTC的4種ddNTP或其衍生物2)DNA聚合酶3)熒光素和熒光素酶4)AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)以及丙酮酸磷酸二激酶、和/或APS和ATP硫酸化酶。
根據(jù)需要，試劑盒中還可進一步添加分解焦磷酸和/或ATP的酶。
下面利用實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些實施例。
實施例1圖1是比較利用本發(fā)明的方法的階段反應(yīng)與焦磷酸測序技術(shù)的階段反應(yīng)。個體的基因，是來源于父親和來源于母親的2個等位基因配對而成。本實施例中，以雜合樣品為例進行說明，該雜合樣品在某多態(tài)位點具有各一條A/G差異的2個等位基因。
圖1的102和103分別表示多態(tài)A(1021)和多態(tài)G(1031)2個等位基因的一側(cè)DNA鏈。使用通用的引物101，利用本發(fā)明的方法檢測單核苷酸多態(tài)的情形以A表示，利用以往的焦磷酸測序技術(shù)進行檢測的情形用B表示。發(fā)生互補鏈合成反應(yīng)的情況下的發(fā)光強度與互補鏈合成時插入的堿基數(shù)成比例。下面為了方便，將單堿基所對應(yīng)的發(fā)光強度作為“強度單位1(或1個單位)”進行說明。在本發(fā)明的方法中，由于使用ddNTP作為底物，因而延伸的堿基數(shù)常常為1，所得的發(fā)光強度為強度單位1。另一方面，在焦磷酸測序技術(shù)中，由于使用dNTP作為底物，因而合成的堿基的長度會因檢測對象多態(tài)位點的相鄰堿基的種類和狀態(tài)而有所不同，會得到發(fā)光強度為1個單位、2個單位或3個或3個以上單位等各種值。
檢測的方案如下所述。首先擴增作為檢測對象的DNA，使之變成單鏈后加入到反應(yīng)槽中。使設(shè)計的引物與該單鏈DNA雜交，所述引物與作為檢測對象的核酸堿基之前的一個堿基呈3’末端對應(yīng)關(guān)系。即，設(shè)定為由引物引發(fā)的互補鏈合成，使得核酸底物插入到檢測對象位點。在本實施例中應(yīng)該被插入到檢測對象位點的堿基種類是T或C。通過加樣器(dispenser)按順序?qū)?種核酸底物即擬核酸堿基(終止劑)或核酸堿基注入到反應(yīng)槽中。注入的核酸底物的種類和順序，在本發(fā)明的方法的情況下是ddATP→ddCTP→ddGTP→ddTTP，在焦磷酸測序技術(shù)的情況下是dATPαS→dCTP→dGTP→dTTP。注入的核酸堿基種類與檢測對象位點的堿基互補的情況下，互補鏈合成反應(yīng)繼續(xù)，注入的核酸堿基結(jié)合到引物的3’末端。在本實施例中，焦磷酸測序技術(shù)中，因為需要而預(yù)先在反應(yīng)液中加入了三磷酸腺苷雙磷酸酶，因而注入的核酸底物在1分鐘內(nèi)分解，但如后所述，該三磷酸腺苷雙磷酸酶產(chǎn)生的分解作用在本發(fā)明的方法中不一定需要。
最初注入的ddATP或dATPαS由于與檢測對象多態(tài)位點的堿基不互補，因而互補鏈合成反應(yīng)不發(fā)生。接下來如果注入ddCTP或dCTP，只在多態(tài)位點是G的等位基因的DNA鏈103處發(fā)生互補鏈合成反應(yīng)，在本發(fā)明的方法和焦磷酸測序技術(shù)中都觀測到強度單位1的發(fā)光。同樣，接下來的ddGTP或dGTP由于與檢測對象多態(tài)位點的堿基不互補，不引起互補鏈合成反應(yīng)，觀察不到發(fā)光。接下來的ddTTP或dTTP的注入，在多態(tài)位點是A的等位基因的DNA鏈102處發(fā)生互補鏈合成反應(yīng)，從而在本發(fā)明的方法中觀察到強度單位為1的發(fā)光。另一方面，在焦磷酸測序技術(shù)中，DNA鏈102的多態(tài)位點和其鄰位各插入了1個dTTP，同時另一個等位基因在DNA鏈103也插入了1個dTTP，合計觀察到3個堿基對應(yīng)的發(fā)光(強度單位為3)。圖2表示本發(fā)明方法中的一系列的反應(yīng)式。另外，圖3示意性表示在本發(fā)明的方法(A)和焦磷酸測序技術(shù)(B)中觀察到的發(fā)光(信號強度)。
在本發(fā)明的方法中，由于只在變異位點插入與其數(shù)目相對應(yīng)的核酸堿基，因而，對于純合基因型的被檢驗者的DNA樣品，在一處觀察到2個單位的發(fā)光；對于雜合型DNA樣品，則在二處觀察到1個單位的發(fā)光。另一方面，在焦磷酸測序技術(shù)中，由于互補鏈合成持續(xù)發(fā)生，發(fā)光強度的表現(xiàn)方式變得復(fù)雜。
表1表示的是在本實施例中使用的反應(yīng)液組成。在反應(yīng)液中含有DNA聚合酶、ATP生成反應(yīng)中使用的ATP硫酸化酶、APS、發(fā)光反應(yīng)中使用的熒光素酶、熒光素。而且，在焦磷酸測序技術(shù)中由于有必要分解注入的核酸底物，所以反應(yīng)液中添加有分解酶三磷酸腺苷雙磷酸酶。如后所述，由于試劑中常常含有雜質(zhì)焦磷酸等，所以在本發(fā)明的方法中，在加入有擬核酸堿基的試劑中預(yù)先了加入微量的焦磷酸酶(PPase)。
表1反應(yīng)液組成

*Amersham Bioscience公司生產(chǎn)的循環(huán)測序用耐熱性DNA聚合酶。
若加入與模板DNA互補的核酸底物，則進行互補鏈的合成，能觀察到發(fā)光，但互補鏈的合成進行時，會產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸。焦磷酸在APS和ATP硫酸化酶的存在下，生成ATP，但APS本身也能成為熒光素酶反應(yīng)的底物引起發(fā)光反應(yīng)。在焦磷酸測序技術(shù)中為了進行任意階段的互補鏈延伸反應(yīng)，有必要預(yù)先加入足夠的APS，致使背景發(fā)光變大。但是，本發(fā)明的方法中，由于不需要存在與焦磷酸測序技術(shù)同樣大量的APS，所以實質(zhì)上觀察不到APS引起的背景發(fā)光。
ATP在熒光素酶的存在下，與熒光素反應(yīng)發(fā)光，釋放出焦磷酸。由于焦磷酸再次與APS反應(yīng)生成ATP，發(fā)光反應(yīng)持續(xù)到熒光素消耗殆盡或APS用盡。但是，加入了三磷酸腺苷雙磷酸酶的情況下，由于三磷酸腺苷雙磷酸酶也分解ATP，所以發(fā)光在1分鐘左右的較短時間停止。圖4表示這樣在三磷酸腺苷雙磷酸酶存在下觀察到的發(fā)光(信號強度)。在本實施例中，由于PPase的量少，因而如果發(fā)生互補鏈合成，信號強度急劇升高，隨著焦磷酸的緩慢分解，信號強度慢慢減弱(401)。接下來，注入下一個擬核酸堿基，此堿基被插入而引起互補鏈的合成時，由于信號強度再次急劇增加，因而能容易地檢測出。
如上所述，反應(yīng)中使用的各種試劑中往往含有雜質(zhì)焦磷酸(PPi)。焦磷酸在混合反應(yīng)試劑時被轉(zhuǎn)變成ATP，引起發(fā)光反應(yīng)，成為背景發(fā)光的原因。因而，在本實施例中，使微量的Ppase共存于加入有擬核酸堿基的試劑中，從而分解了作為雜質(zhì)的焦磷酸。PPase的加入量如果多，則由于在ATP→PPi→ATP循環(huán)反應(yīng)中焦磷酸減少，發(fā)光反應(yīng)會在短時間內(nèi)停止?；パa鏈合成時生成的焦磷酸轉(zhuǎn)變成ATP的過程也受到影響，發(fā)光(信號強度)也變小，但不妨礙測定。
另外，也可以使用三磷酸腺苷雙磷酸酶代替上述PPase。由于三磷酸腺苷雙磷酸酶分解ATP、dNTP、ddNTP等，因而如前所述，在分解ATP并在短時間內(nèi)收集發(fā)光的同時分解加入的擬核酸堿基(ddNTP)。但是，由于PPase的價格是三磷酸腺苷雙磷酸酶的一半左右，而且必需的使用量是三磷酸腺苷雙磷酸酶的1/10左右，所以使用PPase能使成本降低。
本實施例中，擬核酸堿基使用終止劑ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。圖4表示分別以dATP、dATPαS、ddATP以及ddATPαS作為底物時的熒光素酶反應(yīng)引起的發(fā)光強度(401ATP、402dATP、403dATPαS、404ddATP、405ddATPαS)。dATP作為熒光素酶反應(yīng)的反應(yīng)底物比dATPαS的活性高300倍左右，而ddATP只顯示了與dATPαS大致相同的低活性。由于ddATP的價格約是dATPαS的一半，而且反應(yīng)必需的量是dATPαS的1/10左右，所以使用ddATP的本發(fā)明的方法與以往的方法比較，使檢測成本降低。
在本發(fā)明的方法中，由于只在核酸堿基插入到引物的3’末端時，能觀察到1個單位的發(fā)光，所以所得數(shù)據(jù)(發(fā)光類型)簡單而且明了。通過只有注入與檢測對象位點互補的核酸堿基種類時產(chǎn)生的發(fā)光，能夠簡單地判別靶SNPs。如上，如果利用本發(fā)明的方法，使用廉價的試劑ddATP和PPase能簡便地檢測單核苷酸多態(tài)(SNPs)。
實施例2在實施例1中，在焦磷酸轉(zhuǎn)變成ATP的反應(yīng)中使用了ATP硫酸化酶，由焦磷酸和APS生成ATP。如上所述，APS作為熒光素酶發(fā)光底物的活性低，但是如果大量共存于反應(yīng)槽中，由此引起的發(fā)光將不能忽視，往往使檢測靈敏度下降。所以，在本實施例中，使用不會成為熒光素酶反應(yīng)的底物的AMP作為焦磷酸的反應(yīng)底物，并使用丙酮酸磷酸二激酶(Pyruvate Phosphate DikinasePPDK)進行反應(yīng)，針對該體系進行說明。圖5表示本實施例的反應(yīng)概況。本實施例的方法除ATP生成反應(yīng)以外，幾乎與實施例1相同，但是，由于設(shè)定了所使用的酶PPDK的適用條件，因而所用試劑和反應(yīng)條件有所不同。表2表示本實施例中使用的反應(yīng)液的組成。
表2反應(yīng)液組成

接下頁表2，接上頁

*Amersham Bioscience公司生產(chǎn)的循環(huán)測序用耐熱性DNA聚合酶。
在使用PPDK的反應(yīng)體系中由于背景發(fā)光小，增加熒光素酶的量，能使發(fā)光量增加數(shù)倍。所以即使微量的樣品也能靈敏地測定。
檢測的方案如下所述。按順序向反應(yīng)槽中加入4種ddNTP，進行互補鏈合成反應(yīng)。只有注入與檢測對象位點的堿基互補的擬核酸堿基時，才進行互補鏈的合成，生成焦磷酸(PPi)。Ppi和AMP在PPDK的存在下反應(yīng)生成ATP。ATP成為熒光素酶反應(yīng)的底物，在發(fā)出熒光的同時，生成AMP和PPi。與實施例1相同，生成的PPi與AMP反應(yīng)再次生成ATP。即使在本實施例中，由于利用PPase或三磷酸腺苷雙磷酸酶分解PPi，因而發(fā)光強度緩慢降低。檢測對象樣品的基因型有純合和雜合的兩種情形。純合的情況下，互補鏈合成所伴隨的發(fā)光強度的急劇增加只觀察到1次，但雜合的情況下，則觀察到2次。通過觀察這種發(fā)光強度的變化，能檢測到作為靶的檢測對象位點的變異。
圖9是表2的試劑中除去三磷酸腺苷雙磷酸酶的情況下的實施例。多態(tài)是A/G雜合的情形。已知道，只有注入與多態(tài)對應(yīng)的堿基的情況下，發(fā)光強度才急劇增加。使4種ddNTP或其衍生物按順序反應(yīng)的情況下，純合時能觀察到1次發(fā)光強度的急劇增加，雜合時能觀察到2次。在本實施例中由于不加入三磷酸腺苷雙磷酸酶，而加入40mU/mL PPase，因而延伸時生成的PPi被PPase分解，發(fā)光強度緩慢減弱。其減少量比加入三磷酸腺苷雙磷酸酶的情況下要緩慢。在本發(fā)明中，由于使用ddNTP和其衍生物，延伸堿基數(shù)總保持每次1個堿基，判斷簡便，如本實施例那樣，不加入試劑三磷酸腺苷雙磷酸酶也能判斷堿基的不同。
實施例3本發(fā)明的方法能在1個反應(yīng)容器中檢測多個單核苷酸多態(tài)(SNPs)。首先，作為第一個例子，對檢測對象SNPs是3個的情形進行說明。
SNPs幾乎都是由一般型(野生型)和其一個堿基被其他3種堿基中某一個特定取代而成的類型(變雜合)構(gòu)成。即，可以說SNPs位點的變異通常有2種。因此，同時檢測3個多態(tài)的情況下，應(yīng)確定的堿基的個數(shù)一共為6個(2個×3種)。而且，由于自然界中可能存在的堿基有A、C、G、T 4種，對于3個SNPs，如果不同時測定組合完全相同的SNPs，則6個可采用的堿基的自由度一共為27。因此，完全確定3個SNPs的條件如下所示。
首先，為了使3個SNPs不成為完全相同的組合，有必要選擇檢測對象SNPs。另外，在3個SNPs的可采用堿基，即6個堿基中，有必要使4種堿基ACGT中的任一個都至少存在1個。例如，有必要如(A/G、A/G、T/C)那樣，在3種SNPs中含有2個相同的「A/G」組合；如(A/G、A/C、G/C)那樣，在3種SNPs中不完全含有4種堿基ACGT(此種情況下不含有「T」)。
關(guān)于檢測對象SNPs的組合的這些限定條件，由于單純通過與其對應(yīng)的引物的組合就可設(shè)定，所以不失一般性。下面，以3種檢測對象SNPs(SNP-1、SNP-2、SNP-3)分別是(A/C、A/G、C/T)的情形為例，對本發(fā)明中多個SNPs的檢測方法進行具體說明。
首先，向檢測對象DNA中加入3種引物，配制反應(yīng)液。然后如在實施例1和2中說明的那樣，按順序加入4種ddNTP，觀察發(fā)光強度。加入的堿基不被插入的情況下發(fā)光強度為零，1個檢測對象位點被插入時發(fā)光強度為1。另外，加入的堿基與基因型為純合的1個SNPs對應(yīng)的情況下，或與基因型為雜合的2個SNPs對應(yīng)的情況下，發(fā)光強度都為2。而且，加入ddATP以外的擬核酸堿基時，在對應(yīng)的SNPs等位基因為純合時，得到的發(fā)光強度為2，雜合時發(fā)光強度為1，但純合時，如果具有堿基A的等位基因，則為零。這樣，通過比較對應(yīng)于加入的堿基的發(fā)光強度，能確定全部多態(tài)位點。
圖6表示3種檢測對象SNPs在各種組合時所觀察到的發(fā)光情況。發(fā)光強度合計都是6個單位。這18種組合的發(fā)光類型完全不同，由所得的發(fā)光類型能唯一確定多態(tài)位點。圖7是實際的測定例。這里使用了具有(A/C)、(A/G)、(C/T)3個SNPs的樣品。在測定例中加入T、G和C時，發(fā)光強度為1個單位(702、703、704)，加入A時的發(fā)光強度為3個單位(701)，由此確定樣品的基因型是(AA、AG、CT)。這相當(dāng)于圖6的案例13。
從圖6可知，只要滿足上述條件，利用本發(fā)明的方法對于任何SNPs都能唯一確定至3個。另外，對于檢測對象SNPs存在于1條DNA鏈上的情形和存在于不同DNA鏈上的情形，也同樣處理。
在本發(fā)明的方法中，ddNTP的注入是每次一種核酸堿基，加入的ddNTP即使有殘留，也沒有妨礙測定。因此沒有必要加入試劑中預(yù)先含有的PPase以外的分解酶。為了觀察到呈尖峰狀的發(fā)光信號，在本實施例的反應(yīng)液中加入了三磷酸腺苷雙磷酸酶，但不加進行測定當(dāng)然也可以。
實施例4下面對多個SNPs的檢測例子進行說明。檢測多個SNPs的情形下，按順序在反應(yīng)槽中加入多個引物，再向其中按順序加入4種擬核酸堿基進行測定(圖8)。因此為了不使引物之間發(fā)生部分雜交而阻礙互補鏈合成反應(yīng)，將反應(yīng)溫度升至接近40℃(優(yōu)選32℃～40℃)，并且加入的引物量盡量少。優(yōu)選各引物的量與檢測對象DNA樣品等摩爾。
反應(yīng)槽中不加入引物的情況下，在加入ddNTP時，不產(chǎn)生發(fā)光(圖8最上面的圖)。在多個SNPs位點的檢測中，為了不影響使用下一個引物的檢測，必須除去注入的ddNTP。ddNTP的除去方法有，如上述利用PPase和三磷酸腺苷雙磷酸酶等分解酶的分解法和用反應(yīng)液沖洗的方法。
在使用第一個引物(primer-1)進行第一次測定中，只有加入ddATP時，才能觀察到發(fā)光(信號)(801)。這表示對應(yīng)于加入的引物的位點是基因型(AA)的純合。在加入新的引物進行第二次測定時，由于當(dāng)殘留有以前使用的ddNTP時不好，因而向反應(yīng)槽中加入三磷酸腺苷雙磷酸酶進行分解。在進行利用接下來的引物的測定中，ddNTP只要是在加入相同堿基的循環(huán)結(jié)束前，被分解即可，因而加入的三磷酸腺苷雙磷酸酶的量可以比焦磷酸測序技術(shù)少。
在使用第二個引物(primer-2)進行測定時，雖然能觀察到ddATP的若干發(fā)光(信號)，但由其強度認(rèn)為，是在第一次的測定中插入未反應(yīng)的位點引起的(802)。在此測定中，添加ddGTP時觀察到強發(fā)光(信號)。由此顯示對應(yīng)于第二個引物的位點是基因型(GC)的純合。
在使用第三個引物(primer-3)進行測定中，注入ddATP和ddGTP時，得到幾乎相同強度的發(fā)光(信號)(803)。由此顯示對應(yīng)于第三個引物的位點是基因型(AG)的雜合。
因此對于多個SNPs，通過按順序加入不同的引物進行測定能分別確定SNPs的基因型。在本實施例中，按順序每次加入1個引物，也可以3個一起加入。在此情況下，添加3～4個引物可以確定大于等于10處的SNPs。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的檢測方法能有效地適用于特定位點的堿基序列的檢測、尤其是對含有單核苷酸(SNPs)和甲基化的基因的變異的檢測。
權(quán)利要求
1.一種堿基序列檢測方法，其特征在于，具有在含有核酸樣品的反應(yīng)槽中添加與堿基AGTC相對應(yīng)的4種ddNTP或其衍生物中的至少一種進行互補鏈的合成，使靶位點延伸一個堿基的工序；以由所得的焦磷酸生成的ATP作為反應(yīng)底物進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的工序；和利用上述化學(xué)發(fā)光判斷是否有互補鏈合成，確定上述靶位點的堿基序列的工序。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，按順序每次向反應(yīng)槽中加入一種上述4種ddNTP或其衍生物進行互補鏈的合成。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用丙酮酸磷酸二激酶和AMP由上述互補鏈合成中得到的焦磷酸生成ATP。
4.如權(quán)利要求1～3任一項所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是熒光素酶引起的酶發(fā)光反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求1～4任一項所述的方法，其特征在于，使分解焦磷酸和/或ATP的酶共存于上述反應(yīng)槽中。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用所述的酶分解所述化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中生成的焦磷酸和/或ATP，在一定時間內(nèi)收集發(fā)光。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述酶是焦磷酸酶和/或三磷酸腺苷雙磷酸酶。
8.一種堿基序列的檢測方法，其是使用權(quán)利要求1～7任一項所述的方法檢測2個或2個以上靶位點的方法，其特征在于，準(zhǔn)備與各種所述靶位點對應(yīng)的引物，針對其中的2種或3種引物，同時進行利用上述4種ddNTP或其衍生物的互補鏈合成和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，由其結(jié)果確定與上述2種或3種引物對應(yīng)的靶位點的堿基序列。
9.一種堿基序列的檢測方法，其是使用權(quán)利要求1～7任一項所述的方法檢測2個或2個以上靶位點的方法，其特征在于，準(zhǔn)備與各種所述靶位點對應(yīng)的引物，針對一種引物，進行利用上述4種ddNTP或其衍生物的互補鏈合成和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，確定對應(yīng)的靶位點的堿基序列后，分解或除去反應(yīng)槽中添加的ddNTP或其衍生物，然后按順序利用接下來的引物確定靶位點。
10.一種堿基序列的檢測方法，其是使用權(quán)利要求1～7任一項所述的方法檢測2個或2個以上靶位點的方法，其特征在于，準(zhǔn)備與各種所述靶位點對應(yīng)的引物，同時向反應(yīng)槽中添加2種或2種以上引物，進行利用上述4種ddNTP或其衍生物的互補鏈合成和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，確定對應(yīng)的靶位點的堿基序列后，分解或除去反應(yīng)槽中添加的ddNTP或其衍生物，然后按順序利用下一個或二個或二個以上引物確定靶位點。
11.如權(quán)利要求1～10任一項所述的方法，其特征在于，所述靶位點是單堿基發(fā)生了變異或變化的位點。
12.堿基序列檢測用試劑盒，其包括下列1)～4)1)對應(yīng)于堿基AGTC的4種ddNTP或其衍生物2)DNA聚合酶3)熒光素和熒光素酶4)AMP和磷酸烯醇丙酮酸以及丙酮酸磷酸二激酶、和/或APS和ATP硫酸化酶。
13.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其進一步含有分解焦磷酸和/或ATP的酶。
全文摘要
本發(fā)明提供價格便宜、重復(fù)性好、并且簡便的堿基序列檢測方法，尤其是能在1個反應(yīng)槽中檢測多個變異位點。在含有核酸樣品的反應(yīng)槽中，添加與堿基AGTC相對應(yīng)的4種ddNTP或其衍生物中的至少一種進行互補鏈的合成，使靶位點延伸一個堿基，以由所得的焦磷酸生成的ATP作為反應(yīng)底物進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，利用上述化學(xué)發(fā)光判斷是否有互補鏈合成，確定上述靶位點的堿基序列。
文檔編號C12Q1/68GK1854308SQ20051009309
公開日2006年11月1日 申請日期2005年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者神原秀記, 周國華, 梶山智晴 申請人:株式會社日立制作所