專利名稱：神經(jīng)酰胺化合物在制備細(xì)胞活化劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有α-糖基神經(jīng)酰胺的NKT細(xì)胞活化劑，自身免疫疾病治療劑和墮胎劑。
背景技術(shù)：
已發(fā)現(xiàn)適當(dāng)表達(dá)T細(xì)胞受體的中間TCR細(xì)胞(TCRint細(xì)胞)，在顯示大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)樣的形態(tài)，經(jīng)常表達(dá)IL-2R β鏈，和具有perforin顆粒等方面是與Natural Killer(NK)細(xì)胞類似的細(xì)胞，但就具有TCR這一點(diǎn)表明是與NK細(xì)胞明顯不同的細(xì)胞(Watannabe，H.等，J.Immunol.，155，2972(1995))。因此，在小鼠中，在白介素12(IL-12)活化的TCRint細(xì)胞中，表達(dá)NK1.1的NK1.1+TCRint(NKT)細(xì)胞被證明是腫瘤向肝臟或肺血原性轉(zhuǎn)移抑制的重要效應(yīng)器細(xì)胞(Hashimoto，W.等，J.Immunol.，154，4333(1995)；Anzai，R.等.，Immunol.，88，82(1996))。由此可見，可認(rèn)為這些NKT細(xì)胞對(duì)于癌細(xì)胞、寄生蟲或原生動(dòng)物，以及李司忒氏菌屬(Listeriamonocytogenes)或結(jié)核菌等細(xì)胞內(nèi)感染細(xì)菌的排除可起到重要的作用(Seki，S.等，J.Immunol.，28，1069(1996))。
另外，已知這些NKT細(xì)胞與骨髓移植引起的急性期排斥反應(yīng)(Yankelevich，B.等，J.Immunol.，142，3423(1989))或輔助T細(xì)胞的Th1/Th2的分化抑制引起的IgE抗體產(chǎn)生的抑制(Yoshimoto，T.等，J.Exp.Med.，179，1285(1994))等密切相關(guān)。因此，這些NKT細(xì)胞，在近些年，作為新的細(xì)胞群是非常引人注目的細(xì)胞群。
Vα14+NKT細(xì)胞是上述NKT細(xì)胞的一個(gè)亞型，大多數(shù)Vα14+NKT細(xì)胞表達(dá)Vα14Jα281mRNA，并將此作為TCRα鏈具有。近年，這些Vα14+NKT細(xì)胞被證明與自身免疫疾病的發(fā)病密切相關(guān)。即，MRLlpr/lpr小鼠，在出生后17-20周齡時(shí)異常淋巴細(xì)胞積聚引起自身免疫疾病(人全身性紅斑狼瘡)的模型小鼠，用該模型小鼠證明，在自身免疫疾病發(fā)病前，Vα14+NKT細(xì)胞選擇性的減少(Mieza，M.A.等，J.Immunol.，156，4035(1996))。
在其它自身免疫疾病模型鼠上也觀察到了類似的現(xiàn)象，例如，gld小鼠或(NZBxNZW)F1小鼠，證明Vα14+NKT細(xì)胞與自身免疫疾病的發(fā)病密切相關(guān)(Makino，Y.等，Clin.Immunol.，28，1487(1996))。
更有意思的是，在人身上也觀察到了類似的現(xiàn)象。即，與小鼠Vα14Jα281鏈相同的人相應(yīng)的Vα24JαQα鏈，在健康人末梢血的CD4-/CD8-T細(xì)胞中的存在量為20-50％，但在硬皮癥患者中幾乎消失了(Sumida，T.等.，J.Exp.Med，.182，1163(1995))。
因此，可知鼠Vα14+NKT細(xì)胞或人Vα24JαQαT細(xì)胞與不同的遺傳因子或遺傳背景引起的各種自身免疫疾病相關(guān)。由此可見，具有上述的NKT細(xì)胞活化作用的IL-12，可被期待用作象人全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosusSEL)或全身性強(qiáng)皮癥(systemicsclerosisSSc)這樣的自身免疫疾病的治療劑。但是，當(dāng)使用IL-12對(duì)MRL lpr/lpr小鼠給藥時(shí)，與未給藥的小鼠相比，脾和淋巴結(jié)中異常淋巴球(CD3+B220+雙陰性T細(xì)胞)有明顯增加(TakenoriTsutsui等.，日本免疫學(xué)會(huì)總會(huì)·學(xué)術(shù)集會(huì)記錄，347(1996))。
但是，在生物體內(nèi)存在各種糖與神經(jīng)酰胺以β-構(gòu)型鍵合而成的β-半乳糖基神經(jīng)酰胺或β-葡萄糖基神經(jīng)酰胺(Svennerholm，L.等.，Biochem.Biophys.Acta，280，626(1972)；Karlsson，K.-A.等.，Biochim.Biophys.Acta，316，317(1973))。一方面，已知α-半乳糖基神經(jīng)酰胺有顯著的免疫賦活作用以及抗腫瘤作用(Morita，M.等.，J.Med.Chem，38，2176(1995))，且α-半乳糖基神經(jīng)酰胺或α-葡萄糖基神經(jīng)酰胺的該作用比β-半乳糖基神經(jīng)酰胺或β-葡萄糖基神經(jīng)酰胺的作用強(qiáng)的多(Motoki，K.等.，Biol.Pharm.Bull.，18，1487(1995))。另外，已知使用具有α-葡萄糖基神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)生物體給藥時(shí)，具有射線防護(hù)作用(Motoki，K.等.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，5，2413(1995))，具有小鼠黑素瘤B16的肺轉(zhuǎn)移抑制作用(Kobayashi，E.等.，Oncology Res.，7，529(1995))，和小鼠大腸癌Colon26或小鼠T淋巴瘤EL-4的肝轉(zhuǎn)移抑制作用(元木一宏等日本癌學(xué)會(huì)總會(huì)記事、523(1996))和增加血小板數(shù)或白血球數(shù)的作用(Motoki，K.等.，biol.Pharm.Bull.，19，952(1996))。
但是，至今沒有報(bào)道指出具有α-葡萄糖基神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)自身免疫疾病有效或具有墮胎作用，以及具有α-葡萄糖基神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)的化合物會(huì)影響NKT細(xì)胞。
發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，α-葡萄糖基神經(jīng)酰胺在RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠(不存在按淋巴球劃分的B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞，但存在大量NKT細(xì)胞的小鼠)中可增強(qiáng)NKT細(xì)胞的對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒素活性，由于α-葡萄糖基神經(jīng)酰胺使得NKT細(xì)胞(特別是小鼠Vα14+NKT細(xì)胞和人Vα24+NKT細(xì)胞)的數(shù)目顯著增加，α-葡萄糖基神經(jīng)酰胺可抑制人全身性紅斑狼瘡的模型小鼠MRLlpr/lpr小鼠腋下和鼠腹股溝的淋巴結(jié)的異常腫脹(異常淋巴球的積聚)，并因此α-葡萄糖基神經(jīng)酰胺可抑制4％DSS誘發(fā)的小鼠結(jié)腸炎的進(jìn)行。
本發(fā)明的發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，α-葡萄糖基神經(jīng)酰胺可抑制實(shí)驗(yàn)的自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病。小鼠的實(shí)驗(yàn)的自身免疫性腦脊髓炎是人多發(fā)性硬化癥的模型。本發(fā)明的發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，在NOD小鼠中，α-葡萄糖基神經(jīng)酰胺可抑制糖尿病的自然發(fā)病。NOD小鼠是人I型糖尿病的模型。
本發(fā)明的發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，α-葡萄糖基神經(jīng)酰胺對(duì)妊娠小鼠具有墮胎效果。
本發(fā)明的目的是提供NKT細(xì)胞活化劑以及活化的NKT細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的是提供自身免疫疾病(例如，全身性紅斑狼瘡，全身性強(qiáng)皮癥，潰瘍性結(jié)腸炎，腦脊髓炎，多發(fā)性硬化癥，和I型糖尿病等)的治療劑。
本發(fā)明的另一目的是提供墮胎劑。
本發(fā)明的NKT細(xì)胞活化劑，自身免疫疾病治療劑和墮胎劑含有下式(I)的化合物或其鹽或其溶劑化物作為有效成分
其中R1是H或OH，X是7～27中的任一整數(shù)，R2選自下列(a)～(e)的取代基(其中，Y是5～17中的任一整數(shù))，(a)-CH2(CH2)YCH3(b)-CH(OH)(CH2)YCH3(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)-CH＝CH(CH2)YCH3(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3、- -且R3～R9是下列i)～ii)中任一定義的取代基i)R3、R6和R8是H時(shí)R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下面(A)～(D)中的取代基
R5是OH，或選自下面(E)或(F)的取代基 R7是OH或選自下面(A)-(D)的取代基 R9是H、CH3、CH2OH、或選自下面(A’)～(D’)的取代基 ii)R3、R6和R7是H時(shí)R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下面(A)～(D)的取代基
R5是OH、或選自下面(E)或(F)的取代基 R8是OH、或選自下面(A)～(D)的取代基 R9是H、CH3、CH2OH或選自下面(A’)～(D’)的取代基。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是KRN7000對(duì)NKT細(xì)胞抵抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性增強(qiáng)活性的示意圖。E/T比表示效應(yīng)細(xì)胞數(shù)(脾臟細(xì)胞數(shù))/靶細(xì)胞數(shù)(YAC-1細(xì)胞數(shù))的比。
圖2顯示的是在脾臟中KRN7000對(duì)NKT細(xì)胞的增加作用。
A表示脾臟淋巴細(xì)胞部分的FACS解析結(jié)果。橫軸表示FITC標(biāo)識(shí)抗TCRαβ單克隆抗體的熒光強(qiáng)度，縱軸表示Cychrome標(biāo)識(shí)的抗NK1.1單克隆抗體的熒光強(qiáng)度。
B表示脾臟淋巴細(xì)胞部分的FACS解析結(jié)果。縱軸表示細(xì)胞數(shù)(相對(duì)細(xì)胞數(shù))，橫軸表示PE標(biāo)識(shí)的Vα14單克隆抗體的熒光強(qiáng)度。白色部分表示用無(wú)標(biāo)識(shí)的Vα14單克隆抗體預(yù)處理后，用PE標(biāo)識(shí)Vα14單克隆抗體進(jìn)行染色時(shí)(非標(biāo)記阻斷)的熒光強(qiáng)度。陰影部分表示對(duì)于使用載體或KRN7000給藥后的Vα14+細(xì)胞，PE標(biāo)識(shí)Vα14單克隆抗體的熒光強(qiáng)度分布。
C表示脾臟淋巴細(xì)胞部分的細(xì)胞數(shù)，和脾臟淋巴細(xì)胞部分中的T細(xì)胞數(shù)、NK細(xì)胞數(shù)和Vα14+NKT細(xì)胞數(shù)隨KRN7000給藥的變化?！馰α14+NKT細(xì)胞、○全細(xì)胞、◇T細(xì)胞、□NK細(xì)胞。
圖3表示使用KRN7000給藥后，經(jīng)時(shí)觀察MRL lpr/lpr小鼠的淋巴腫脹的進(jìn)展的結(jié)果。各淋巴結(jié)按照其大小記為4個(gè)級(jí)別，-(0)、+(1)、++(2)、+++(3)，各小鼠的左右腋下(A)或小鼠腹股溝部的淋巴結(jié)(B)的級(jí)別合計(jì)作為淋巴結(jié)腫脹的指數(shù)。
圖4表示用KRN7000給藥后，MRL lpr/lpr小鼠的生存率。
圖5顯示KRN7000對(duì)4％DSS誘發(fā)小鼠結(jié)腸炎的抑制作用。在試驗(yàn)期間，將4％DSS作為飲用水對(duì)鼠連續(xù)給藥。
A顯示各群小鼠體重的變化。B表示各群小鼠的生存率。
圖6顯示的是KRN7000對(duì)在C57BL/6小鼠中，由髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)(MOG)肽等誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的效果。A載體給藥群，BKRN7000(20μg/kg)給藥群。EAE的癥狀按照下列標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)臨床級(jí)別0正常、1尾部麻痹、2；靜位反射不全、3；后肢麻痹、4前肢麻痹、5死亡。
圖7顯示的是KRN7000在NOD小鼠中對(duì)于自然發(fā)病的糖尿病的效果。
圖8顯示的是KRN7000對(duì)Vα24+NKT細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。使用末梢血單核細(xì)胞作為應(yīng)答細(xì)胞進(jìn)行自身混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)后，回收CD4-CD8-細(xì)胞，用已標(biāo)識(shí)的抗體確定表現(xiàn)型。點(diǎn)線表示用對(duì)照抗體(鼠IgG或大鼠IgM)染色時(shí)的熒光強(qiáng)度分布，實(shí)線表示用抗CD3、CD4、CD8、Vα24、VB11抗體(以上、Immunotech社)、抗NKRP1A抗體(BectonDickinson社)染色時(shí)的熒光強(qiáng)度分布。
圖9顯示的是KRN7000對(duì)Vα24+NKT細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞用KRN7000處理時(shí)，根據(jù)抗原呈遞細(xì)胞的數(shù)目可看到Vα24+NKT細(xì)胞的增殖。
圖10所示的是本發(fā)明使用的α-糖基神經(jīng)酰胺化合物的代表例(KRN7000)的合成反應(yīng)路線示意圖。在反應(yīng)過(guò)程中，pyr代表吡啶，BrPPh3(CH2)12CH3代表十三烷基三苯基溴化鏻，n-BuLi代表正丁基鋰，MsCl代表甲磺酰氯，BnBr代表芐基溴，1-PrOH代表丙醇。
圖11是接續(xù)圖10的合成反應(yīng)路線。反應(yīng)過(guò)程中，WSC-HCl代表1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽，MS4A代表分子篩4A，且Hex4NBr代表四己基溴化銨。
圖12顯示的是實(shí)施例1～3的化合物的結(jié)構(gòu)式。
發(fā)明詳述式(I)化合物上述式(I)化合物中，神經(jīng)酰胺部分的X優(yōu)選是11～25的整數(shù)。
R2中的Y優(yōu)選是9～17的整數(shù)，更優(yōu)選是11～15的整數(shù)。
對(duì)于式(I)的神經(jīng)酰胺部分，X和R2優(yōu)選的組合是，X是21～25的整數(shù)，R2是取代基(b)(式中，Y是11～15)所代表的化合物和X是9～13的整數(shù)，R2是取代基(a)(式中，Y是11～15)所代表的化合物。
對(duì)于式(I)的糖部分，R3～R9優(yōu)選的組合是，R3和R6代表氫，R4表示OH或選自(A)～(D)任一個(gè)的取代基，R5表示OH或(E)或(F)的取代基，R7和R8分別表示H或OH(但R7和R8不表示相同的取代基)，R9表示CH2OH，CH3，H或選自(A’)～(D’)任一個(gè)的取代基所表示的化合物。
更優(yōu)選的組合可列舉的有R3和R6是H，R4和R5是OH，R7和R8分別是H或OH(但R7和R8不表示相同的取代基)，且R9是CH2OH或選自(A’)～(D’)的任一個(gè)取代基所表示的化合物，和R3、R6和R8是H，R4、R5和R7是OH，且R9是CH2OH所表示的化合物。
作為式(I)化合物優(yōu)選的例子可列舉的有X是21～25的整數(shù)，R2是取代基(b)(式中，Y是11～15的整數(shù))，R3和R6是H，R4是OH或選自(A)～(D)的取代基，R5是OH或選自(E)和(F)的取代基，R7和R8分別是H或OH(但二者不表示相同的取代基)，R9是CH2OH或選自(A’)～(D’)的取代基的化合物；X是9～13的整數(shù)，R2是取代基(a)(式中，Y是11～15的整數(shù))，R3和R6是H，R4和R5是OH，R7和R8分別是H或OH(但二者不表示相同的取代基)，R9是H、CH3或CH2OH的化合物；X是21～25的整數(shù)，R2是取代基(b)(式中，Y是11～15的整數(shù))，R3和R6是H，R4和R5是OH，R7和R8分別是H或OH(但二者不表示相同的取代基)，R9是CH2OH或選自(A’)～(D’)的取代基的化合物；X是21～25的整數(shù)，
R2是取代基(b)(式中，Y是11～15的整數(shù))，R3、R6和R8是H，R4、R5和R7是OH，R9是CH2OH的化合物。
作為本發(fā)明治療劑的有效成分，優(yōu)選的化合物可列舉的有(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-二十六烷?；被?3，4-十八烷二醇(KRN 7000)，(2S，3R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-十四烷?；被?3-十八烷醇(AGL-517)，(2S，3R)-1-(α-D-吡喃葡萄糖基氧)-2-十四烷酰基氨基-3-十八烷醇(AGL-563)，(2S，3R)-1-(6’-脫氧-α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-十四烷?；被?3-十八烷醇(AGL-571)，(2S，3R)-1-(β-L-吡喃阿拉伯糖基氧)-2-十四烷?；被?3-十八烷醇(AGL-577)，O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷?；?1，3，4-十八烷三醇(AGL-586)O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-1，3，4-十八烷三醇(AGL-584)O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羥基二十四烷?；鵠-1，3，4-十八烷三醇(S1140B-9)O-β-D-呋喃半乳糖基-(1→3)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羥基二十四烷?；鵠-1，3，4-十八烷三醇(719-7)，和O-(N-乙?；?2-氨基-2-脫氧-α-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-O-[α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羥基二十四烷酰基]-1，3，4-十八烷三醇(STL-8)。
作為本發(fā)明治療劑的有效成分特別優(yōu)選的化合物是(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-二十六烷?；被?3，4-十八烷二醇(KRN 7000)。
式(I)化合物可以是藥學(xué)上允許的非毒性鹽形式。作為式(I)化合物的鹽，可列舉的有，酸加成鹽，例如，無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸，硫酸，硝酸，磷酸)的鹽，或有機(jī)酸(例如，乙酸，丙酸，馬來(lái)酸，油酸，棕櫚酸，檸檬酸，琥珀酸，酒石酸，富馬酸，谷氨酸，泛酸，十二烷基磺酸，甲磺酸和鄰苯二甲酸)。
式(I)化合物可以是溶劑化物(例如，水合物)。
式(I)化合物可使用任何合成α-糖基神經(jīng)酰胺的方法制備。
首先，使用D-來(lái)蘇糖作為起始物合成神經(jīng)酰胺部分，然后向該神經(jīng)酰胺中引入糖，制備式(I)化合物。關(guān)于這樣的α-糖基神經(jīng)酰胺的合成方法，可參照例如，WO93/5055，WO94/2168，WO94/9020和WO94/24142。
另外，式(I)化合物可從天然物(生物等)用柱色譜等分離純化。
式(I)化合物的用途當(dāng)使用本發(fā)明化合物的代表化合物KRN7000對(duì)RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠給藥時(shí)，可看到NKT細(xì)胞對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒素活性的增加(藥理試驗(yàn)例1)。
另外，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)α-糖基神經(jīng)酰胺可使NKT細(xì)胞，特別是Vα14+NKT細(xì)胞或Vα24+NKT細(xì)胞的數(shù)目顯著增加(藥理試驗(yàn)例2、6和9)。已知象在自身免疫疾病模型小鼠中Vα14+NKT細(xì)胞的減少、在強(qiáng)皮癥患者中Vα24+JαQαT細(xì)胞的消失，在I型糖尿病發(fā)展的患者中Vα24+NKT細(xì)胞極端地減少所示的那樣，在遺傳因子或遺傳背景不同的各種自身免疫疾病中，可顯示出與小鼠Vα14+NKT細(xì)胞或人Vα24+NKT細(xì)胞相關(guān)的現(xiàn)象(Mieza，M.A.等.，J.Immunol.，156，4035(1996)；Makino，Y.等，Clin.Immunol.，28，1487(1996)；Sumida，T.等.，J.Exp.Med.，182，1163(1995)；Wilson等.，Nature，391，177(1998))。另外，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在對(duì)認(rèn)為是人全身性紅斑狼瘡的模型小鼠MRL lpr/lpr小鼠(Sakamoto，A.Clin.Immunol.，28，1558(1996))用KRN7000給藥時(shí)，抑制了鼠腋下和鼠腹股溝部的淋巴結(jié)異常腫脹(異常淋巴細(xì)胞的積聚)(藥理試驗(yàn)例3)。淋巴結(jié)的異常腫脹在MRL lpr/lpr鼠中是伴隨年齡增長(zhǎng)觀察到的特征癥狀。
因此，作為本發(fā)明的第一方面，式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物可用作NKT細(xì)胞活化劑。在此“NKT細(xì)胞”，包括人Vα24+NKT細(xì)胞和小鼠Vα14+NKT細(xì)胞。人Vα24+NKT細(xì)胞是人Vα24JαQαT細(xì)胞的亞型，與Vα24+雙負(fù)(CD4-CD8-)T細(xì)胞(Dellabona，P.等，J.Exp.Med.180，117(1994))同義。另外，“NKT細(xì)胞的活化”包括細(xì)胞毒素活性的增強(qiáng)和促進(jìn)NKT細(xì)胞的增殖。
作為本發(fā)明的第二方面，式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物可用作自身免疫疾病治療劑。在本發(fā)明中，作為“自身免疫疾病”，包括全身性紅斑狼瘡、全身性強(qiáng)皮癥、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥、腦脊髓炎、I型糖尿病、慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、斯耶格倫氏綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬變、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性溶血性貧血、重癥肌無(wú)力、交感神經(jīng)性眼炎、古德帕斯徹氏綜合征(例如，腎小球性腎炎)、惡性貧血和橋本氏病。另外，在本發(fā)明的說(shuō)明書中，“治療”包括“預(yù)防”之意。
式(I)化合物和IL-12可促進(jìn)妊娠小鼠的流產(chǎn)(藥理試驗(yàn)例10)。因此，本發(fā)明的第三方面是式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物和IL-12用作墮胎劑。式(I)化合物和IL-12不僅可對(duì)妊娠動(dòng)物給藥，還可以對(duì)有妊娠可能性的動(dòng)物給藥。對(duì)有妊娠可能性的動(dòng)物預(yù)先用式(I)化合物和IL-12給藥可阻止妊娠。因此，“墮胎劑”含有“避孕劑”的意義。
式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物和IL-12，可根據(jù)治療方法，給藥方法，和給藥目的制成適當(dāng)?shù)膭┬?，具體的有，注射劑，懸浮劑，乳化劑，軟膏劑，乳劑，片劑，膠囊劑，顆粒劑，散劑，丸劑，細(xì)粒劑，糖錠，直腸給藥劑，油脂性栓劑和水溶性栓劑等。
以上各種制劑，可使用下述藥學(xué)上可接受的載體等按照常規(guī)方法制備。賦形劑例如，溶劑(例如，水，生理鹽水)，增量劑和填充劑(例如，乳糖，淀粉，結(jié)晶纖維素，甘露糖醇，麥芽糖，磷酸氫鈣，軟質(zhì)硅酸酐，碳酸鈣)；輔助劑，例如，增溶劑(例如，乙醇，聚山梨酸酯)，粘合劑(例如，淀粉，聚乙烯基吡咯烷酮，羥丙基纖維素，乙基纖維素羧甲基纖維素和阿拉伯膠)，崩解劑(例如，淀粉和羧甲基纖維素鈣)，潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂，滑石，硬化油)，穩(wěn)定劑(例如，乳糖，甘露糖醇，麥芽糖，聚山梨酸酯類，聚乙二醇類，聚氧乙烯氫化蓖麻油)，等張劑，潤(rùn)濕劑，潤(rùn)滑劑，分散劑，緩沖劑，溶解輔助劑；添加劑，例如，抗氧化劑，防腐劑，矯味矯臭劑，止痛劑，穩(wěn)定劑，著色劑，和甜味劑。
另外，可根據(jù)需要，向各種制劑中添加甘油，二甲基乙酰胺，70％乳酸鈉，表面活性劑，堿性物質(zhì)(例如，亞乙基二胺，乙醇胺，碳酸鈉，精氨酸，葡甲胺，三氨基甲烷)。
本發(fā)明的式(I)化合物和IL-12，可經(jīng)過(guò)任何符合目的的途徑給藥。具體地說(shuō)，對(duì)于動(dòng)物的場(chǎng)合，可使用腹腔內(nèi)給藥，皮下給藥，向靜脈或動(dòng)脈的血管內(nèi)給藥，用注射局部給藥等。另外，對(duì)于人的場(chǎng)合，可使用靜脈內(nèi)給藥，動(dòng)脈內(nèi)給藥，使用注射局部給藥，向腹腔或胸腔給藥，皮下給藥，肌肉內(nèi)給藥，舌下給藥，透皮吸收或直腸內(nèi)給藥。優(yōu)選靜脈內(nèi)給藥。
本發(fā)明治療劑中的各有效成分，可根據(jù)具體的狀況連續(xù)或間隔給藥。具體的給藥量根據(jù)給藥方法，患者的各種條件，例如，年齡，體重，性別，感受性，給藥時(shí)間，并用藥劑等變化。一般地，式(I)化合物和IL-12的給藥量為，例如，靜脈內(nèi)給藥，對(duì)于成人1日0.01～10mg左右，優(yōu)選0.01～1mg。優(yōu)選將式(I)化合物制成冷凍干燥制劑，在給藥前用注射用蒸餾水等溶解，對(duì)患者給藥。
本發(fā)明提供了自身免疫疾病的治療方法，包括使用式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物給藥。
本發(fā)明還提供了自身免疫疾病的治療方法，包括使用式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物活化NKT細(xì)胞(活化的NKT細(xì)胞)對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物給藥。
活化的NKT細(xì)胞，可通過(guò)在式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物存在下體外培養(yǎng)獲得。另外，也可通過(guò)分離使用式(I)化合物給藥的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的活化NKT細(xì)胞得到。
與式(I)化合物一起在體外培養(yǎng)的NKT細(xì)胞，可以是從健康人分離得到的，或從患者或被懷疑為患者中分離得到的。在對(duì)人治療的場(chǎng)合，NKT細(xì)胞優(yōu)選是人Vα24+NKT細(xì)胞。
使用活化NKT細(xì)胞對(duì)哺乳動(dòng)物給藥，可通過(guò)將活化NKT細(xì)胞移植到哺乳動(dòng)物體內(nèi)，例如，移植到靜脈內(nèi)。
本發(fā)明還提供了NKT細(xì)胞活化的方法，包括在式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物存在下體外培養(yǎng)NKT細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了墮胎的方法，包括使用式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物或IL-12對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物給藥。
實(shí)施例以下的實(shí)施例用以詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
化合物的合成和分離純化實(shí)施例1(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-二十六烷?；被?3，4-十八烷二醇(KRN 7000)的合成合成步驟按照?qǐng)D10和圖11所示。
(1)化合物G1的合成向用氯化鈣干燥過(guò)的D-來(lái)蘇糖(200g，1.33mol)的丙酮溶液(3.0L)中加入硫酸(0.5mL)，將混合物在室溫?cái)嚢?8小時(shí)。加入分子篩4A的粉末(100g)，將反應(yīng)液中和后，用硅藻土過(guò)濾，殘?jiān)帽磧?。將濾液和洗液合并并減壓濃縮，得到G1的粗產(chǎn)物。產(chǎn)量240g(95％)。此產(chǎn)物可不經(jīng)純化直接用于下一步。分析用樣品用硅膠色譜純化，用己烷∶丙酮(9∶1)作為洗脫液。
mp76-78℃；FDMS m/z 191(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ5.45(1H，d，J＝1.8Hz)，4.83(1H，dd，J＝3.7，5.5Hz)，4.64(1H，d，J＝6.1Hz)，4.27-4.30(1H，m)，3.90-3.99(2H，m)，1.48(3H，s)，1.32(3H，s)。
(2)化合物G2的合成向化合物G1(239g，約1.26mmol)的二氯甲烷溶液中(168ml)，加入吡啶(10ml)和三苯甲基氯(39.0g)，將混合物在32℃攪拌4小時(shí)。滴加入乙醇(8ml)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。用飽和氯化銨水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，食鹽水洗凈后，減壓濃縮。殘?jiān)靡宜嵋阴ト芙猓鋮s至0℃結(jié)晶。產(chǎn)量501g(與D-來(lái)蘇糖相比為87％)。
mp174-176℃；FDMS m/z 432M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.49(15H，m)，5.38(1H，d，J＝2.4Hz)，4.75(1H，dd，J＝3.7，6.1Hz)，4.59(1H，d，J＝6.1Hz)，4.31-4.35(1H，m)，3.43(1H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.39(1H，dd，J＝6.7，9.8Hz)，1.29(3H，s)，1.28(3H，s)。
(3)化合物G3的合成在氬氣氛圍下，0℃，向十三烷三苯基溴化鏻(962g，1.16mol；是用1-溴代十三烷，三苯基膦在140℃加熱4.5小時(shí)制備的)的THF溶液(1500ml)中，滴加入正丁基鋰的2.5M己烷溶液(462mL；366mmol)。滴加完成后，攪拌15分鐘，滴加入化合物G2(250g，579mmol)的THF溶液(450ml)。將化合物連續(xù)攪拌18小時(shí)同時(shí)緩慢升溫至室溫。將反應(yīng)液減壓濃縮，向殘?jiān)屑尤爰和椤眉状肌盟?10∶7∶3、1000ml)的混和液，用飽和氯化銨水溶液洗凈。水層用己烷(500ml)萃取，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鎂干燥后，減壓濃縮，得到G3的粗產(chǎn)物。不需純化可直接用于下一步。產(chǎn)量339g(98％)。分析用樣品用硅膠色譜純化，使用己烷∶乙酸乙酯(9∶1)作為洗脫液。
FDMS m/z 598M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.45(15H，m)，5.48-5.59(2H，m)，4.91(0.7H，t，J＝7.3Hz)，4.44(0.3H，t，J＝7.3Hz)，4.26(0.3H，dd，J＝4.3，7.3Hz)，4.21(0.7H，dd，J＝4.3，6.7Hz)，3.75(0.7H，m)，3.69(0.3H，m)，3.24(0.3H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.17(0.7H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.09-3.14[1H，(3.11，dd，J＝4.9，9.2Hz)，H1b Eoverlapped]，1.75-2.03(2H，m)，1.49(3H，s)，1.39 and 1.38(3H，each s)，1.21-1.34(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。
(4)化合物G4的合成向化合物G3(338g，約565mmol)的二氯甲烷溶液(1500ml)中加入吡啶(500ml)，并滴加入甲磺酰氯(49ml，633mmol)，將混合物在31℃攪拌24小時(shí)。滴加入乙醇40ml，將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓濃縮后，向殘?jiān)屑尤爰和椤眉状肌盟?10∶7∶3，1000ml)的混和液，進(jìn)行分液。水層用己烷(200ml)萃取3次，合并有機(jī)層用無(wú)水硫酸鎂干燥后，減壓濃縮，得到G4的粗產(chǎn)物。此產(chǎn)物不需純化可直接用于下一步。產(chǎn)量363g(95％)。分析用樣品用硅膠色譜純化，使用己烷∶乙酸乙酯(9∶1)作為洗脫液。
FDMS m/z 676M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.47(15H，m)，5.41(0.7H，ddd，J＝5.5，9.2，11.0Hz)，5.32(0.7H，bt，J＝11.0Hz)，5.22(0.3H，bdd，J＝9.2，15.0Hz)，5.02(0.3H，dt，Jt＝7.3Hz，Jd＝15.0Hz)，4.8(0.7H，ddd，J＝3.1，5.5，7.9Hz)，4.73(0.7H，dd，J＝5.5，9.8Hz)，4.64-4.67(0.3H，m)，4.61(0.3H，dd，J＝5.5，9.2Hz)，4.48(0.7H，dd，J＝5.5，7.9Hz)，4.22(0.3H，dd，J＝5.5，9.2Hz)，3.55(0.3H，dd，J＝2.4，11.6Hz)，3.45(0.7H，dd，J＝3.2，11.0Hz)，3.06-3.12[4H，(3.12，s)，(3.11，s)，(3.09，dd，J＝3.1，11.0Hz)]，1.66-1.82(2H，m)，1.47 and 1.46(3H，each s)，1.39(3H，s)，1.13-1.35(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.8Hz)。
(5)化合物G5的合成向化合物G4(362g，約536mmol)的二氯甲烷溶液(1500ml)中加入甲醇(350ml)，向其中滴加入濃鹽酸(200ml)，將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。向反應(yīng)液中加入碳酸氫鈉中和后，過(guò)濾。將濾液減壓濃縮，向殘?jiān)屑尤胍宜嵋阴?，用食鹽水洗凈。水層用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鎂干燥后，減壓濃縮。用己烷結(jié)晶。產(chǎn)量161g(與G2相比為70％)。
mp66-67℃；FDMS m/z 377(M-H2O)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ5.86(0.3H，dt，Jt＝7.3Hz，Jd＝14.7Hz)，5.77(0.7H，dt，Jt＝7.3，Jd＝10.4Hz)，5.55(0.3H，br，dd，J＝7.3，14.7Hz)，5.49(0.7H，bt，J＝9.8Hz)，4.91-4.97(1H，m)，4.51(0.7H，bt，J＝9.8Hz)，4.11(0.3H，bt，J＝7.3Hz)，3.94-4.03(2H，m)，3.67-3.73[1H，(3.70，dd，J＝3.1，6.7Hz)，(3.69，dd，J＝3.1，7.3Hz)]，3.20 and 3.19(3H，eachs)，2.05-2.22(2H，m)，1.22-1.43(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。
(6)化合物G6的合成向化合物G5(160g，405mmol)的THF溶液(780ml)中加入5％鈀-硫酸鋇(16g)，將反應(yīng)器用氫氣置換后，在室溫?cái)嚢?0小時(shí)。反應(yīng)液用硅藻土過(guò)濾后，用氯仿∶甲醇的混和液(1∶1)洗凈。合并濾液和洗液，真空濃縮。殘?jiān)靡宜嵋阴ソY(jié)晶。產(chǎn)量146g(91％)。
23D+12°(c1，CHCl3/MeOH＝1∶1)；mp124-126℃；FDMS m/z 397(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3/CD3OD＝1∶1)δ4.93-4.96(1H，m，H2)，3.91(1H，dd，J＝6.7，12.2Hz)，3.85(1H，dd，J＝4.9，12.2Hz)，3.54-3.60(1H，m)，3.50(1H，dd，J＝1.8，8.5Hz)，3.19(3H，s)，1.75-1.83(1H，m)，1.53-1.62(1H，m)，1.21-1.45(24H，m)，0.89(3H，t，J＝6.7Hz)。
(7)化合物G7的合成向化合物G6(145g，365mmol)的DMF溶液(1000ml)中加入疊氮化鈉(47g，730mmol)，將混合物在95℃攪拌4小時(shí)。將反應(yīng)液濃縮，向殘?jiān)屑尤胍宜嵋阴?450ml)，用水洗。水層用乙酸乙酯再次萃取。合并有機(jī)層，用食鹽水洗凈后，用無(wú)水硫酸鎂干燥，減壓濃縮，得到G7的粗產(chǎn)物。產(chǎn)量122g(97％)。該產(chǎn)物不需純化可直接用于下一步。分析用樣品用硅膠色譜純化，使用己烷∶乙酸乙酯(9∶1)作為洗脫劑。
23D+16.5°(c0.5，CHCl3-MeOH，1∶1)；mp92-93℃；FDMS m/z 344(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CD3OD)δ3.91(1H，dd，J＝3.7，11.6Hz)，3.75(1H，dd，J＝7.9，11.6Hz)，3.49-3.61(3H，m)，1.50-1.71(2H，m)，1.22-1.46(24H，m)，0.90(3H，t，J＝6.7Hz)。
(8)化合物G8的合成向化合物G7(121g，約352mmol)的二氯甲烷溶液(750ml)中加入吡啶(250ml)，三苯甲基氯(124g，445mmol)，將混合物在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。滴加入乙醇(30ml)，在室溫?cái)嚢?0分鐘后，用飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和氯化銨水溶液，食鹽水洗凈后，用無(wú)水硫酸鎂干燥，真空濃縮。殘?jiān)霉枘z色譜純化，使用己烷∶乙酸乙酯(10∶1)作為洗脫劑。產(chǎn)量34.4g(與G6相比為52％)。
24D+11.9°(c0.9，CHCl3)，F(xiàn)DMS m/z 585M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ7.24-7.61(15H，m)，3.62-3.66(2H，m)，3.51-3.57(2H，m)，3.42(1H，dd，J＝6.0，10.4Hz)，1.23-1.56(26H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。
(9)化合物G9的合成向化合物G8(33.5g，57.3mmol)的DMF溶液(300ml)中加入60％氫化鈉(5.5g，約138mmol的NaH)，將混合物在室溫?cái)嚢?0分鐘。將反應(yīng)液冷卻至0℃，滴加入芐基溴(15ml，120mmol)。將混合物攪拌18小時(shí)并緩緩升溫至升溫。向反應(yīng)液中加入冰水(100ml)，反應(yīng)停止后，用乙酸乙酯萃取。萃取液用食鹽水洗滌3次，合并有機(jī)層用無(wú)水硫酸鎂干燥后，減壓濃縮，得到G9的粗產(chǎn)物。該產(chǎn)物不需純化可直接用于下一步。產(chǎn)量42.2g(96％)。分析用樣品用硅膠色譜純化，用己烷∶乙酸乙酯(100∶1)作為洗脫液。
24D+9.8°(c1.0，CHCl3)，F(xiàn)DMS m/z 738(M-N2)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.07-7.48(25H，m)，4.57(1H，d，J＝11.6Hz)，4.44(1H，d，J＝11.6Hz)，4.41(2H，s)，3.73-3.79(1H，m)，3.46-3.56(2H，m)，3.37(1H，dd，J＝8.6，10.4Hz)，1.20-1.64(26H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。
(10)化合物G10和G11的合成向化合物G9(41.2g，約54mmol)的1-丙醇溶液(250ml)中加入甲醇(30ml)，并進(jìn)一步加入5％鈀炭(4.1g)，甲酸銨(27.1g，4.3mol)。將混合物在室溫?cái)嚢?6小時(shí)后，用乙酸乙酯稀釋，硅藻土過(guò)濾。將濾液減壓濃縮，剩余物用乙酸乙酯溶解后，用飽和碳酸氫鈉水溶液，食鹽水洗滌3次，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鎂干燥后，真空濃縮，得到G10的粗產(chǎn)物。產(chǎn)量38.9g(98％)。所得G10，不需純化可直接用于下一步。
向化合物G10的二氯甲烷溶液(300ml)中，加入二十六酸(22.4g，56.5mmol)，WSC鹽酸鹽(12.6g，64.6mmol)，將混合物加熱回流2小時(shí)。將混合物冷卻至室溫，減壓濃縮。向殘?jiān)屑尤胍宜嵋阴?500ml)，用0.5M鹽酸水溶液，食鹽水，飽和碳酸氫鈉水溶液，并進(jìn)一步用食鹽水洗凈。合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鎂干燥后，減壓濃縮，得到G11的粗產(chǎn)物。產(chǎn)量53.2g(88％)。所得G11不需純化，可直接用于下一步。分析用樣品用硅膠色譜純化，使用己烷∶乙酸乙酯(100；1)作為洗脫液。
24D+5.3°(c0.4，CHCl3)；FDMS m/z 1118M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.20-7.38(25H，m)，5.57(1H，d，J＝9.1Hz)，4.80(1H，d，J＝11.6Hz)，4.48-4.50(3H，m)，4.24-4.32(1H，m)，3.83(1H，dd，J＝3.0，6.7Hz)，3.43-3.51(2H，m，H1a)，3.29(1H，dd，J＝4.3，9.8Hz)，1.92(2H，t，J＝7.3Hz)，1.28-1.60(72H，m)，0.88(6H，t，J＝6.7Hz)。
(11)化合物G12的合成向化合物G11(52.2g，約47mmol)的二氯甲烷溶液(180ml)中加入甲醇(36ml)，接著滴加入10％鹽酸甲醇溶液(3.0ml)，將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將反應(yīng)液用粉末狀的碳酸氫鈉(18g)中和，硅藻土過(guò)濾。殘?jiān)枚燃淄橄礈?。合并濾液和洗液，用食鹽水洗凈，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鎂干燥后，減壓濃縮。將殘?jiān)诒屑訜崛芙猓鋮s至0℃沉淀純化。產(chǎn)量38.6g(與G9相比為77％)。
24D-29.7°(c0.7，CHCl3)；mp75-76.5℃；FDMS m/z 876M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.30-7.47(10H，m)，6.03(1H，d，J＝7.9Hz)，4.72(1H，d，J＝11.6Hz)，4.66(1H，d，J＝11.6Hz)，4.61(1H，d，J＝11.6Hz)，4.45(1H，d，J＝11.6Hz)，4.12-4.17(1H，m)，4.00(1H，dt，Jt＝4.3，Jd＝7.3Hz)，3.67-3.72(2H，m)，3.61(1H，ddd，J＝4.3，8.6，11.6Hz)，1.94-2.05(2H，m)，1.15-1.69(72H，m)，0.88(6H，t，J＝6.1Hz)。
(12)化合物G13的合成1)將2，3，4，6-四-O-芐基-D-吡喃半乳糖基乙酸酯(79.8g)溶于甲苯(160ml)和異丙醚(520ml)的混和液中，冷卻至-10～0℃。向其中加入含2.0當(dāng)量的HBr的異丙醚溶液(2.8mmol/ml，約100ml)。在-10～0℃攪拌約90分鐘后，向反應(yīng)液中倒入5％碳酸氫鈉水溶液，攪拌，中和過(guò)剩的HBr。將全量移入分液漏斗分液后，丟棄水層，用10％氯化鈉水溶液洗滌2次洗凈。真空濃縮，得到2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基溴化物(GalBr)的漿液。
2)向化合物G12(60.0g，68.6mmol)，四己基溴化銨(89.4g，206mmol)，分子篩4A(60g)的甲苯溶液(420ml)中，加入DMF(140ml)，接著加入GalBr(約137mmol)的甲苯溶液(250ml)，將混合物在室溫?cái)嚢?2小時(shí)。向反應(yīng)液中加入甲醇(12ml)，攪拌2小時(shí)。用硅藻土過(guò)濾后，用飽和碳酸氫鈉水溶液，食鹽水洗凈后，用無(wú)水硫酸鎂干燥，減壓濃縮。向殘?jiān)屑尤胍译?，攪?小時(shí)，得到沉淀。將所得沉淀真空干燥，得到干燥的粉末。將該產(chǎn)物用硅膠色譜純化，用己烷∶乙酸乙酯(8∶1)作為洗脫液。產(chǎn)量70.9g(74％)。
24D+18.8°(c0.9，CHCl3)；mp74-75℃；FDMS m/z 1399(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.37(30H，m)，6.12(1H，d，J＝9.0Hz)，4.91(1H，d，J＝11.6Hz)，4.84(1H，d，J＝3.7Hz)，4.72-4.80(4H，m)，4.35-4.65(7H，m)，4.12-4.18(1H，m)，3.99-4.05(2H，m)，3.84-3.93(4H，m)，3.73(1H，dd，J＝3.7，11.0Hz)，3.47-3.51(2H，m)，3.42(1H，dd，J＝6.1，9.1Hz)，1.87-1.99(2H，m)，1.18-1.70(72H，m)，0.88(6H，t，J＝7.4Hz)。
(13)化合物KRN7000的合成將化合物G13(60.0g，42.9mmol)加入乙醇(960ml)中懸浮，向其中加入20％氫氧化鈀(6.0g)的乙醇懸浮液。然后加入作為氫源的4-甲基環(huán)己烯(120ml，93.5mmol)，將混合物加熱回流4小時(shí)后，過(guò)濾，除去催化劑。殘?jiān)脽嵋掖枷磧?。將濾液在室溫放置，過(guò)濾所得白色沉淀，減壓干燥。將所得粉末懸浮于乙醇∶水(92∶8、3.5L)，邊攪拌邊加熱溶解后，室溫放置，再次沉淀。將沉淀液過(guò)濾，將濾餅真空干燥，得到白色粉末。產(chǎn)量35.0g(95％)。
23D+43.6°(c1.0，吡啶)；mp189.5-190.5℃；負(fù)FABMS m/z 857(M-H)-；IR(cm-1，KBr)3300，2930，2850，1640，1540，1470，1070；1H-NMR(500MHz，C5D5N)δ8.47(1H，d，J＝8.5Hz)，5.58(1H，d，J＝3.7Hz)，5.27(1H，m)，4.63-4.70(2H，m)，4.56(1H，m)，4.52(1H，t，J＝6.1Hz)，4.37-4.47(4H，m)，4.33(2H，m)，2.45(2H，t，J＝7.3Hz)，2.25-2.34(1H，m)，1.87-1.97(2H，m)，1.78-1.85(2H，m)，1.62-1.72(1H，m)，1.26-1.45(66H，m)，0.88(6H，t，J＝6.7Hz)，13C-NMR(125MHz，C5D5N)δ173.2(s)，101.5(d)，76.7(d)，73.0(d)，72.5(d)，71.6(d)，71.0(d)，70.3(d)，68.7(t)，62.7(t)，51.4(d)，36.8(t)，34.4(t)，32.1(t)，30.4(t)，30.2(t)，30.03(t)，30.00(t)，29.93(t)，29.87(t)，29.81(t)，29.76(t)，29.6(t)，26.5(t)，26.4(t)，22.9(t)，14.3(q)。
實(shí)施例2O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羥基二十四烷酰基]-1，3，4-十八烷三醇(S1140B-9)的分離及精制將沖繩縣久米島近海的海底水深15～25m處采摘的海綿的冷凍干燥粉末447.1g用氯仿和甲醇的混和液萃取，將萃取液減壓濃縮得到51.28g的萃取物。將萃取物在乙酸乙酯和水之間分配后，上層和中間層用無(wú)水硫酸鈉后，減壓濃縮，分別得到18.37g和9.44g。將上層得到的部分在10％含水甲醇和正己烷之間分配所得到的醇層，與中間層得到的部分合并并濃縮后，反復(fù)用硅膠色譜純化，在正相TLC上得到單一活性成分169.9mg。進(jìn)一步用ODS-AM柱(YMC制造，250mm×20mm直徑，甲醇，9.0ml/min)反相HPLC純化(保留時(shí)間30.3分鐘)，得到10.2mg純化的標(biāo)題化合物(S1140B-9)。另外，標(biāo)題化合物也可以參照F.Cafieri等，Liebigs Ann.Chem.1995，1477-1481分離純化。
負(fù)FABMS m/z 1007[(M-H)-]；IR；1HNMR(500MHz，C5D5N，24℃)δ(ppm)8.55(1H，d，J＝9.2Hz，NH)，5.60(1H，d，J＝3.7Hz，H1″)，5.57(1H，d，J＝3.7Hz，H1)，5.13(1H，m，H2)，4.75(1H，dd，J＝3.7，10.4Hz，H2″)，4.62(2H，m)，4.54(4H，m)，4.25-4.47(10H，m)，2.17(2H，m)，1.99(1H，m)，1.87(2H，m)，1.75(1H，m)，1.65(2H，m)，1.12-1.49(60H，m)，0.85(6H，m，terminal methyl)；13C NMR(125MHz，C5D5N，45℃)δ(ppm)175.5(s，C1′)，99.5(d，C1)，98.6(d，C1″)，76.7(d，C2″)，76.0(d，C3)，72.8(d，C4)，72.6(d，C5″)，72.6(d，C4″)，72.5(d，C2)，71.3(d，C3)，71.0(d)，70.8(d)，70.5(d，C2)，69.7(d，C3″)，68.6(t，C1)，62.7(t)，62.5(t)，51.2(t，C2)，39.4(t)，35.6(t)，33.7(t)，32.2(t)，30.5(t)，30.3(t)，30.1(t)，30.0(t)，29.7(t)，29.6(t)，26.7(t)，26.0(t)，23.0(t)，22.9(t)，14.3(q，terminal methyl)
實(shí)施例3下面的化合物是根據(jù)右側(cè)的文獻(xiàn)記載的方法制備的。

式(I)化合物與上述實(shí)施例中記載的化合物的對(duì)應(yīng)，列于下列表1中。
表1

生物學(xué)試驗(yàn)藥理試驗(yàn)例1KRN7000對(duì)NKT細(xì)胞抵抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性的增強(qiáng)作用作為本發(fā)明配糖體化合物的代表，使用實(shí)施例1的化合物(KRN7000)進(jìn)行下列試驗(yàn)。
使用載體(含有0.025％ Polysolvate 20的生理鹽水)或KRN7000100μg/kg對(duì)RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠(該小鼠的淋巴細(xì)胞部分不存在B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞，但存在很多NKT細(xì)胞)靜脈內(nèi)給藥，24小時(shí)后分別摘取脾臟，按照常規(guī)方法制備脾臟細(xì)胞。RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠是刪除RAG-1基因，強(qiáng)制表達(dá)Vα14和Vβ8.2基因制作的鼠(Kawano T.等.，Science，278，1626-1629(1997))。該鼠可從千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部谷口克等處獲得。這些脾臟細(xì)胞對(duì)于小鼠淋巴細(xì)胞瘤YAC-1細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性用4小時(shí)-51Cr-釋放法測(cè)定(Kobayashi，E.等.，Oncology Res.，7，529(1995))。結(jié)果列于圖1。
如圖1所示，用KRN7000給藥鼠制備的脾臟細(xì)胞顯示出對(duì)YAC-1細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性明顯高于用載體給藥鼠制備的脾臟細(xì)胞的活性。
考慮到RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞部分中，不存在下B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞，但存在大量NKT細(xì)胞，該結(jié)果顯示KRN7000可增加脾臟NKT細(xì)胞對(duì)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性。
上述結(jié)果表明，KRN7000具有增強(qiáng)NKT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性的作用。
藥理試驗(yàn)例2KRN7000的脾臟NKT細(xì)胞增加作用使用載體(含有0.5％ Polysolvate 20的生理鹽水)或1、10和100ng/kg KRN7000對(duì)C57BL/6小鼠(日本SLC(株))靜脈內(nèi)給藥，24小時(shí)后分別摘取脾臟，按照常規(guī)方法制備脾臟細(xì)胞。將該脾臟細(xì)胞在塑料盤中培養(yǎng)30分鐘，制備浮游的細(xì)胞。除去該浮游細(xì)胞中的B細(xì)胞制備淋巴細(xì)胞部分。該淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞和Vα14+NKT細(xì)胞使用FITC標(biāo)識(shí)抗TCRαβ單克隆抗體(Pharmingen社)、Cychrome標(biāo)識(shí)的抗NK1.1單克隆抗體(Pharmingen社)、和PE標(biāo)識(shí)的抗Vα14單克隆抗體用3-color FACS分析法進(jìn)行分析(圖2)?？筕α14單克隆抗體是通過(guò)將抗Vα14單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤(CMS-1，可從千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部，谷口克等獲得)移植到裸鼠中，回收腹水純化得到的。圖2A和B中，淋巴細(xì)胞部分中的NK1.1細(xì)胞、TCRαβ細(xì)胞和Vα14細(xì)胞的量是用標(biāo)識(shí)的抗體對(duì)這些細(xì)胞的熒光強(qiáng)度表示的。
如圖2A所示，使用100ng/kg KRN7000給藥時(shí)，與用載體給藥相比，可觀察到脾臟淋巴細(xì)胞部分中的NK1.1+TCRαβ+細(xì)胞的比例顯著增加。
另外，如圖2B所示，檢測(cè)NK1.1+TCRαβ+細(xì)胞中的Vα14+細(xì)胞的比例時(shí)，可看到用上述劑量的KRN7000給藥時(shí)與用載體給藥相比，NK1.1+TCRαβ+細(xì)胞中的Vα14+細(xì)胞的比例明顯增加。
另外，如圖2C所示，使用10和100ng/kg的KRN7000給藥的脾臟淋巴細(xì)胞部分中的NK細(xì)胞數(shù)雖然與用載體給藥的小鼠相同，但脾臟淋巴細(xì)胞部分中的細(xì)胞數(shù)和脾臟淋巴細(xì)胞部分中的T細(xì)胞數(shù)與用載體給藥的小鼠相比增加了約2倍。另外，脾臟淋巴細(xì)胞部分中的Vα14-NKT細(xì)胞和Vα14+NKT細(xì)胞數(shù)與用載體給藥的小鼠相比增加了3倍以上(省略數(shù)據(jù))和4倍以上。
另外，再進(jìn)行肝臟中T細(xì)胞、NK細(xì)胞、Vα14-NKT細(xì)胞和Vα14+NKT細(xì)胞的分析，與脾臟細(xì)胞的情況相同，可看到Vα14-NKT細(xì)胞和Vα14+NKT細(xì)胞數(shù)顯著增加(省略數(shù)據(jù))。
以上結(jié)果表明，KRN7000具有增加生物體中NKT細(xì)胞數(shù)，特別是Vα14+NKT細(xì)胞數(shù)的作用。
藥理試驗(yàn)例3KRN7000對(duì)MRL lpr/lpr小鼠的淋巴腫脹抑制作用將雌性MRL lpr/lpr小鼠(Sakamoto，A.Clin.Immunol.，28，1558(1996))10只分為1組進(jìn)行下列試驗(yàn)。對(duì)6周齡時(shí)買入的21只MRL小鼠進(jìn)行觀察，達(dá)到10周齡時(shí)，發(fā)現(xiàn)1只小鼠的腋下淋巴結(jié)腫脹。因此，將其余20只鼠隨機(jī)分為2組。在鼠達(dá)到11周齡時(shí)，開始使用載體(含有0.025％ Polysolvate 20的生理鹽水)或KRN7000(100μg/kg)對(duì)上述兩組鼠一周兩次(星期二和星期五)腹腔內(nèi)給藥。1周兩次，對(duì)腋下和鼠腹股溝部的淋巴結(jié)進(jìn)行診斷，觀察淋巴腫脹隨時(shí)間的進(jìn)展。各淋巴結(jié)按照其大小分為-(0)、+(1)、++(2)、+++(3)四個(gè)級(jí)別，各小鼠的左右腋下和鼠腹股溝部的淋巴結(jié)的級(jí)別合計(jì)作為淋巴腫脹的指數(shù)，列于圖3。
如圖3A所示，KRN7000給藥的MRL小鼠，隨年齡增長(zhǎng)，腋下淋巴腫脹明顯被抑制了。另外，如圖3B所示，MRL小鼠隨年齡增長(zhǎng)，鼠腹股溝部的淋巴腫脹也明顯被抑制了。即，可知KRN7000具有對(duì)MRL小鼠淋巴腫脹抑制作用。
MRL小鼠是人全身性紅斑狼瘡的模型小鼠(Sakamoto，A.Clin.Immunol.，28，1558(1996))。因此，以上結(jié)果顯示，KRN7000對(duì)治療全身性紅斑狼瘡有效。
藥理試驗(yàn)例4KRN7000對(duì)MRL lpr/lpr小鼠生存率的影響將雌性MRL lpr/lpr小鼠10只分為1組進(jìn)行下面的試驗(yàn)。將4周齡時(shí)購(gòu)買的MLR鼠隨機(jī)分為2組(10只/組)，達(dá)到5周齡時(shí)開始，使用載體(含有0.025％ Polysolvate 20的生理鹽水)或KRN7000(100μg/kg)對(duì)上述兩組鼠一周兩次腹腔內(nèi)給藥。每天觀察各鼠的生死。
如圖4所示，載體給藥組，在給藥開始后250天以內(nèi)全部死亡，而KRN7000給藥組，在給藥350天后，仍有3只存活。
藥理試驗(yàn)例5KRN7000對(duì)4％DSS誘發(fā)的小鼠結(jié)腸炎的抑制作用將CDF1小鼠(6周齡，雌性)(日本SLC(株))10只分為1組進(jìn)行下面的試驗(yàn)。將葡聚糖硫酸鈉以4％(w/v)的比例溶于飲用水制得4％DSS溶液作為飲用水開始喂鼠之日定為第0日。將鼠分為使用KRN7000 100μg/鼠第1、5、9日腹腔內(nèi)給藥組，使用IL-12 1μg/鼠第1、3、5、7、9日腹腔內(nèi)給藥組，和無(wú)處理組(對(duì)照組)3組，每天對(duì)各鼠進(jìn)行體重的測(cè)定并觀察生死。各組的體重變化如圖5A所示，生存時(shí)間如圖5B所示。
如圖5A所示，IL-12給藥組與對(duì)照組相比，很早開始就觀察到了體重的減少。但是，KRN7000給藥組與對(duì)照組相比，體重減少的開始時(shí)間明顯延遲了。
另外，如圖5B所示，IL-12給藥組與對(duì)照組相比，鼠的生存期明顯縮短了。但是KRN7000給藥組與對(duì)照組相比，可看到生存期明顯延長(zhǎng)了。
4％DSS誘發(fā)鼠結(jié)腸炎是人潰瘍性結(jié)腸炎的模型(Elson，C.等。，Gastroenterology，109，1344(1995))。因此，以上結(jié)果顯示，KRN7000對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎的治療是有效的。
藥理試驗(yàn)例6具有α-糖基神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)NKT細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用使用藥理試驗(yàn)例1中所示RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠的脾臟細(xì)胞，檢測(cè)具有α-糖基神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)NKT細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。
將RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠的脾臟細(xì)胞按照常規(guī)方法制備脾臟細(xì)胞。將該脾臟細(xì)胞以2×106個(gè)/ml懸浮于添加有10％FCS的1640培養(yǎng)基中，向96穴圓底板中每孔加入100μl。如圖12所示，將10種具有α-糖基神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)的化合物以最終濃度1、10、100ng/ml加入上述板中，培養(yǎng)2天。加入[3H]脫氧胸腺嘧啶核苷(0.5μCi/孔)，16小時(shí)后收集細(xì)胞，用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞內(nèi)攝取的[3H]脫氧胸腺嘧啶核苷的量。結(jié)果列于表2。
表2

如表2所示，上述全部化合物，在100ng/ml的濃度時(shí)與添加載體組相比顯示出具有明顯的NKT細(xì)胞增殖促進(jìn)作用。
以上結(jié)果表明，具有α-糖基神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)的配糖體和糖部分與其它糖結(jié)合的具有α-糖基神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)的配糖體對(duì)于自身免疫疾病的治療是有效的。
藥理試驗(yàn)例7KRN7000對(duì)實(shí)驗(yàn)的自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病的抑制將C57BL/6小鼠(6周齡、雌性)10只分為1組進(jìn)行以下的試驗(yàn)。將200μg的髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)糖蛋白(Myelin OligodendrocyteGlycoprotein)的部分肽(MOG33-55)和500μg的結(jié)核菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra加入不完全的弗氏佐劑制備乳液，在第0日和7日對(duì)各鼠皮下注射進(jìn)行免疫。接著，在第0日和第2日，使用百日咳毒(Pertussis roxin)對(duì)小鼠腹腔內(nèi)給藥，誘發(fā)小鼠的實(shí)驗(yàn)的自身免疫性腦脊髓炎(EAE)。將鼠分為使用KRN 700020μg/kg第1、5、8、12、15日腹腔給藥組和載體(含有0.5％Polysolvate 20)給藥組2組，每天觀察各小鼠的EAE發(fā)病程度。各組各小鼠的EAE發(fā)病程度如圖6所示。
如圖6所示，載體給藥組(圖6A)，從最初的MOG肽免疫開始15天內(nèi)全部鼠都出現(xiàn)了EAE發(fā)病，其中80％的小鼠死亡。但是，KRN7000給藥組(圖6B)，10只小鼠中有4只出現(xiàn)EAE發(fā)病，其中只有2只死亡。
由以上結(jié)果可知，KRN7000可抑制小鼠中EAE的發(fā)病。該EAE是人多發(fā)性硬化癥(MS)的模型(Autoimmune Disease Models，editedby Cohen I.R.& Miller A.Acadenic Press，Inc.(1994)，Chapter1，ppl)。因此，以上結(jié)果顯示，KRN7000對(duì)于多發(fā)性硬化癥的治療是有效的。
藥理試驗(yàn)例8KRN7000對(duì)小鼠糖尿病發(fā)病的抑制作用將NOD/ShiJic(NOD)小鼠(6周齡，雌性)(日本Clea(株))10只1組進(jìn)行下面的試驗(yàn)。NOD小鼠隨著年齡的增長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)糖尿病。將鼠分為KRN7000 100μg/kg對(duì)7周齡的小鼠每周2次腹腔內(nèi)給藥組和無(wú)處理對(duì)照組2組，每周檢查各小鼠有無(wú)糖尿病的發(fā)病。血糖值用Glucometer(Miles三共)測(cè)定，連續(xù)兩次顯示200mg/dL以上則認(rèn)為有糖尿病。各組中糖尿病發(fā)病鼠的比例在圖7中顯示。
如圖7所示，無(wú)處理對(duì)照組，達(dá)到35周齡時(shí)，有80％的小鼠出現(xiàn)糖尿病的發(fā)病，但KRN7000給藥組，在達(dá)到35周齡時(shí)，1只糖尿病發(fā)病鼠也沒有。
從以上結(jié)果可知，KRN7000可抑制NOD小鼠糖尿病的自然發(fā)病。該NOD小鼠是人I型糖尿病的模型(Autoimmune Disease Models，edited by Cohen I.R.& Miller A.Acadenic Press，Inc.(1994)，Chapter 9，pp149)。因此，以上結(jié)果顯示KRN7000對(duì)I型糖尿病的治療是有效的。
藥理試驗(yàn)例9KRN7000對(duì)Vα24+NKT細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用將健康人末梢血單核細(xì)胞用添加10％FCS的AIM培養(yǎng)基，加入GM-CSF(400U/ml)、IL-4(200U/ml)和KRN7000(100ng/ml)培養(yǎng)4天，制備抗原呈遞細(xì)胞。
將該抗原提示細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，同樣的人末梢血單核細(xì)胞作為應(yīng)答細(xì)胞，進(jìn)行自身混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(autologous mixed leukocytereactionMLR)。培養(yǎng)10天后，添加IL-2(5U/ml)，接著，回收細(xì)胞。再進(jìn)一步回收細(xì)胞中的CD4、CD8雙負(fù)細(xì)胞、分析其表現(xiàn)型。表現(xiàn)型的分析，對(duì)于顯示各種表現(xiàn)型的細(xì)胞使用標(biāo)識(shí)的抗體熒光強(qiáng)度表示。其結(jié)果，如圖8所示。
如圖8所示，表明該細(xì)胞群中，存在大量具有CD4-CD8-CD3+Vα24+Vβ11+NKRP1A+表現(xiàn)型的細(xì)胞(Vα24+NKT細(xì)胞的亞型)。
上述細(xì)胞群使用IL-2(5U/ml)培養(yǎng)，增殖Vα24+NKT細(xì)胞，用作下面自身混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的應(yīng)答細(xì)胞。向同樣末梢血單核細(xì)胞添加GM-CSF+IL4和KRN7000 100ng/ml、AGL-583(β-半乳糖基神經(jīng)酰胺、β-GalCer)或0.1％DMSO(載體)，培養(yǎng)4天，制備抗原提示細(xì)胞。將該抗原提示細(xì)胞作為刺激細(xì)胞進(jìn)行自身混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。培養(yǎng)2天后，添加[3H]脫氧胸腺嘧啶核苷(0.5μCi/ml)，8小時(shí)后收集細(xì)胞，用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞內(nèi)攝取的[3H]脫氧胸腺嘧啶苷的量。結(jié)果如圖9所示。
如圖9所示，用載體和β-半乳糖基神經(jīng)酰胺處理的抗原呈遞細(xì)胞對(duì)Vα24+NKT細(xì)胞的增殖沒有任何影響，而用KRN7000處理的抗原提示細(xì)胞，可觀察到顯著的依存于抗原呈遞細(xì)胞的數(shù)目的Vα24+NKT細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用。而且，使用抗CD1a、CD1b、CD1c、CD1d抗體，對(duì)上述用KRN7000處理的抗原呈遞細(xì)胞的Vα24+NKT細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用進(jìn)行阻礙試驗(yàn)時(shí)，只有抗CD1d抗體可阻礙Vα24+NKT細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用(數(shù)據(jù)省略)。
從以上結(jié)果可知，KRN7000對(duì)相當(dāng)于鼠Vα14+NKT細(xì)胞的人Vα24+NKT細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)效果。最近有報(bào)道說(shuō)在I型糖尿病發(fā)展的患者中Vα24+NKT細(xì)胞的數(shù)目極少(Wilson等.，Nature，391，177(1998))，再考慮到藥理試驗(yàn)例3、7和8的結(jié)果，上述結(jié)果強(qiáng)有力地顯示出，KRN7000對(duì)于與人Vα24+NKT細(xì)胞相關(guān)的全身性紅斑狼瘡、全身性強(qiáng)皮癥、多發(fā)性硬化癥或I型糖尿病等自身免疫疾病的預(yù)防和治療中是有效的。
藥理試驗(yàn)例10KRN7000對(duì)流產(chǎn)的促進(jìn)作用使用C57BL/6小鼠(日本SLC(株))進(jìn)行試驗(yàn)。將觀察到陰道塞的日子定為第0日。將妊娠小鼠6只1組，分為用KRN7000 150μg/kg，第7，8，9天靜脈給藥組和PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水)7，8，9天靜脈給藥組。在第12天剖出子宮，觀察胎兒的狀態(tài)。
PBS給藥組，在總共53只胎兒(embryo)中，有3只死亡吸收胎兒，是5.6％的流產(chǎn)率，與C57BL/6小鼠的自然流產(chǎn)率(約5％)很一致。
KRN7000給藥組，在總共36只胎兒中，有12只死亡吸收的胎兒，流產(chǎn)率是33％，與無(wú)處理的對(duì)照組相比具有明顯高的值。另一方面，當(dāng)使用等量的KRN7000以同樣方式對(duì)欠缺Vα14+NKT(Jα281KO)小鼠(Kawano T.等.，Science，278，1626-1629(1997))給藥時(shí)，流產(chǎn)率是5.3％，與PBS給藥組的流產(chǎn)率(5.0％)相同。欠缺Vα14+NKT鼠可從千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部、谷口克等獲得。
考慮到KRN7000具有NKT細(xì)胞活化作用，表明NKT細(xì)胞的活化與流產(chǎn)促進(jìn)作用有良好的相關(guān)關(guān)系。
另外，已知IL-12也具有NKT細(xì)胞活化作用，但使用IL-12以同樣的量，同樣方式對(duì)小鼠((CBA×DBA/2)F1)給藥時(shí)，可看到34％的比例的流產(chǎn)。該結(jié)果強(qiáng)有力地支持了上述相關(guān)關(guān)系。
從以上結(jié)果可知，KRN7000和I L-12具有流產(chǎn)促進(jìn)作用。
藥理試驗(yàn)例11單次給藥的急性毒性試驗(yàn)對(duì)小鼠使用實(shí)施例1的化合物靜脈內(nèi)給藥。其結(jié)果，LD50值是10mg/kg以上。另外，在10mg/kg不顯示特別的癥狀且是低毒性的。
權(quán)利要求
1.式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物在制備NKT細(xì)胞活化劑中的應(yīng)用 其中R1是H或OH，X是7～27中的任一整數(shù)，R2是選自下列(a)～(e)的取代基，其中，Y是5～17中的任一整數(shù)，(a)-CH2(CH2)YCH3(b)-CH(OH)(CH2)YCH3(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)-CH＝CH(CH2)YCH3(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3、且R3～R9是下列i)～ii)中任一定義的取代基i)R3、R6和R8是H時(shí)R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下面(A)～(D)中的取代基R5是OH，或選自下面(E)和(F)的取代基 R7是OH或選自下面(A)～(D)的取代基R9是H、CH3、CH2OH、或選自下面(A’)～(D’)的取代基ii)R3、R6和R7是H時(shí)R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下面(A)～(D)的取代基R5是OH、或選自下面(E)和(F)的取代基 R8是OH、或選自下面(A)～(D)的取代基R9是H、CH3、CH2OH或選自下面(A’)～(D’)的取代基
2.權(quán)利要求1中記載的應(yīng)用，其中式(I)化合物中，R3和R6表示H，R4表示OH或(A)～(D)中的任一取代基，R5表示OH或(E)或(F)表示的取代基，R7和R8分別表示H或OH，但R7和R8不表示同一取代基，R9表示CH2OH、CH3、H、或(A’)～(D’)中任一取代基。
3.權(quán)利要求1中記載的應(yīng)用，其中式(I)化合物中，X是21～25的整數(shù)，R2表示取代基(b)，式中Y是11～15的整數(shù)。
4.權(quán)利要求1中記載的應(yīng)用，其中式(I)化合物中，X是9～13的整數(shù)，R2表示取代基(a)，式中Y是11～15的整數(shù)。
5.權(quán)利要求1中記載的應(yīng)用，其中式(I)化合物是(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-二十六烷酰氨基-3，4-十八烷二醇。
6.活化NKT細(xì)胞的方法，包括在式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物存在下，體外培養(yǎng)包含NKT細(xì)胞的單核細(xì)胞部分 其中R1是H或OH，X是7～27中的任一整數(shù)，R2是選自下列(a)～(e)的取代基，其中，Y是5～17中的任一整數(shù)，(a)-CH2(CH2)YCH3(b)-CH(OH)(CH2)YCH3(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)-CH＝CH(CH2)YCH3(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3、且R3～R9是下列i)～ii)中任一定義的取代基i)R3、R6和R8是H時(shí)R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下面(A)～(D)中的取代基R5是OH，或選自下面(E)和(F)的取代基 R7是OH或選自下面(A)～(D)的取代基R9是H、CH3、CH2OH、或選自下面(A’)～(D’)的取代基ii)R3、R6和R7是H時(shí)R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或選自下面(A)～(D)的取代基R5是OH、或選自下面(E)和(F)的取代基 R8是OH、或選自下面(A)～(D)的取代基R9是H、CH3、CH2OH或選自下面(A’)～(D’)的取代基
7.權(quán)利要求6中記載的方法，其中單核細(xì)胞部分是在抗原呈遞細(xì)胞存在下培養(yǎng)的，所述抗原呈遞細(xì)胞呈遞式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物。
8.權(quán)利要求7中記載的方法，其中單核細(xì)胞部分是在除抗原呈遞細(xì)胞外還存在IL-2的條件下培養(yǎng)的，所述抗原呈遞細(xì)胞呈遞式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物。
9.權(quán)利要求7或8中記載的方法，其進(jìn)一步包括，在培養(yǎng)單核細(xì)胞部分之前，在式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物、GM-CSF和IL-4存在下，通過(guò)體外培養(yǎng)單核細(xì)胞部分，制備呈遞式(I)化合物或其鹽或其溶劑化物的抗原呈遞細(xì)胞。
10.權(quán)利要求6～9中任一項(xiàng)中記載的方法，其中單核細(xì)胞部分是從人外周血得到的。
11.權(quán)利要求6～10中任一項(xiàng)中記載的方法，其中式(I)化合物中，R3和R6表示H，R4表示OH或(A)～(D)中的任一取代基，R5表示OH或(E)或(F)表示的取代基，R7和R8分別表示H或OH，但R7和R8不表示同一取代基，R9表示CH2OH、CH3、H、或(A’)～(D’)中任一取代基。
12.權(quán)利要求6～10中任一項(xiàng)中記載的方法，其中式(I)化合物中，X是21～25的整數(shù)，R2表示取代基(b)，式中Y是11～15的整數(shù)。
13.權(quán)利要求6～10中任一項(xiàng)中記載的方法，其中式(I)化合物中，X是9～13的整數(shù)，R2表示取代基(a)，式中Y是11～15的整數(shù)。
14.權(quán)利要求6～10中任一項(xiàng)中記載的方法，其中式(I)化合物是(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-二十六烷酰氨基-3，4-十八烷二醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了NKT細(xì)胞活化劑，自身免疫疾病(例如，全身性紅斑狼瘡、全身性強(qiáng)皮癥、潰瘍性結(jié)腸炎、腦脊髓炎、多發(fā)性硬化病、和I型糖尿病等)的治療劑，和墮胎劑。按照本發(fā)明的藥劑含有下式(I)的α－糖基神經(jīng)酰胺或其鹽或其溶劑化物作為有效成分。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1768759SQ20051009270
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期1998年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月10日
發(fā)明者谷口克, 河野鐵, 肥塚靖彥 申請(qǐng)人:麒麟麥酒株式會(huì)社