專利名稱：一種單鏈dna快速制備技術(shù)及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單鏈DNA快速制備技術(shù)及試劑盒的制備方法。該技術(shù)快速、靈敏、純度高，制備方法簡便、成本低，適合不同核酸樣品的DNA各種規(guī)模測序和探針制備，可廣泛地用于生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、動植物學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、食品與衛(wèi)生、能源與化工、環(huán)境監(jiān)測以及醫(yī)學(xué)診斷與檢測等領(lǐng)域。
固相吸附、分離與合成技術(shù)在水質(zhì)、水源、生物材料、生物體液(如血液、血清、血漿、腦脊液、尿液，淚液、汗液、消化液、精液、分泌液、組織液、滲出液、嘔吐物、糞便)、組織/細(xì)胞和微生物裂解液、不同來源的蛋白、核酸等生物、化學(xué)分子以及藥物等的分析檢測、分離和純化以及寡核苷酸、多肽、先導(dǎo)化合物和藥物的合成等方面被廣為應(yīng)用。
生物固相化技術(shù)主要是利用不溶的固相基質(zhì)材料，通過表面吸附或結(jié)合以捕獲液相被分析物和被純化物中的靶分子或固定新合成的靶分子，借助重力、壓力、離心、過濾、磁力、流體等，經(jīng)過一步或多步操作很方便的將未結(jié)合的分子(液相、游離相或流動相)與結(jié)合分子(固相)分離，以便獲得純的目的分子，或?qū)蟹肿訌膹?fù)雜的樣品混合物或懸液中分離出來，用于進(jìn)一步的分析研究。
在生物醫(yī)藥等的研究開發(fā)中，為合成反義寡核苷酸藥物、探測基因表達(dá)的有無以及測定基因的堿基序列，了解遺傳信息、判斷基因有無突變等，經(jīng)常需要快速制備一定數(shù)量的單鏈DNA和探針。通常的策略是先將待測的靶基因序列插入重組擴增載體，如M13噬菌體等，然后轉(zhuǎn)化宿主菌；通過培養(yǎng)細(xì)菌以擴增靶基因序列；單鏈DNA的分離提取與純化。顯然上述方法非常煩瑣復(fù)雜，不僅周期長、費用高，而且效率低。采用不對稱PCR技術(shù)，雖然可以獲得較高比例的單鏈DNA，但反應(yīng)中的寡核苷酸引物、dNTPs和DNA聚合酶以及擴增產(chǎn)生的雙鏈DNA依然存在，還必須設(shè)法去除。為解決此問題，本發(fā)明把DNA固相擴增技術(shù)與固相分離技術(shù)相結(jié)合，用于DNA單鏈的快速擴增制備和測序，具有操作簡便、快速高效、成本低等特點。
本發(fā)明的主要技術(shù)特征是，將PCR擴增的成對引物中的一條引物，通過固相合成或化學(xué)偶聯(lián)等方法固定在固相基質(zhì)微粒的表面獲得固相引物，以靶核酸為模板在固相基質(zhì)的表面進(jìn)行固相PCR擴增，擴增的DNA產(chǎn)物經(jīng)加熱變性，使雙鏈DNA中的一條因解鏈脫離固相基質(zhì)，而另一條由固相引物延伸獲得的DNA單鏈仍然保留在固相基質(zhì)的表面；分離固/液相獲得兩條互補的DNA單鏈。運用本發(fā)明制備的單鏈DNA和RNA可廣泛應(yīng)用于核酸的測序，反義寡核苷酸藥物、單鏈探針的制備以及SELEX分子文庫的構(gòu)建等技術(shù)領(lǐng)域。
本項發(fā)明同時還提供了基于本項技術(shù)發(fā)明制備試劑盒的方法，其主要技術(shù)特征在于試劑盒由裝有一定數(shù)量的、表面帶有某種特定序列核酸或化學(xué)活性基團(tuán)的生物微粒與各種配套試劑組成；利用試劑盒中所提供的生物微粒和試劑可方便、快速地進(jìn)行DNA、RNA等單鏈核酸分子的制備、標(biāo)記以及序列測定，使單鏈核酸的制備、標(biāo)記與測序等操作步驟大大簡化，縮短了操作時間，降低了工作強度，提高了工作效率；更提高了單鏈核酸制品的純度、結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，使用更方便，操作更快捷；本發(fā)明可廣泛地應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、疾病診斷、新藥開發(fā)與篩選、疫苗研究、生物分子的相互作用、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和功能組學(xué)等技術(shù)、研究領(lǐng)域。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案其基本特征在于單鏈DNA的快速制備技術(shù)和試劑盒，至少包括下述步驟①提供一種生物微粒，在模板的擴增反應(yīng)中作為固相引物，其固相基質(zhì)表面連接的寡核苷酸分子的序列與模板核酸分子互補；②將生物微粒與模板核酸分子，非固相引物、dNTPs、DNA聚合酶，如耐熱DNA聚合酶、測序酶、經(jīng)基因重組或修飾的DNA聚合酶及其酶活性片段等混合，在生物微粒表面，通過固相聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對模板核酸分子進(jìn)行擴增；其中非固相引物或dNTPs中有一個可以是同位素、熒光素、生物素、半抗原、多肽、糖、寡糖或多糖等指示分子的標(biāo)記物或被修飾的核苷酸；擴增反應(yīng)至少完成一個循環(huán)，此循環(huán)包括a)加熱變性，使模板DNA雙鏈解鏈或消除單鏈核酸模板DNA形成的自身環(huán)化或發(fā)卡等二級結(jié)構(gòu)；b)退火，使固/液相引物與模板的互補序列復(fù)性或雜交；c)在DNA聚合酶的作用下，使引物的寡核苷酸鏈序列延長，并固定在微粒表面；每經(jīng)過一個反應(yīng)循環(huán)，模板核酸靶序列的分子數(shù)量便增加1倍；③離心漂洗數(shù)次以去除殘留的模板核酸分子、非固相引物、dNTPs與DNA聚合酶等；④加熱變性，使擴增的雙鏈DNA的正負(fù)鏈解鏈，獲得互補的、分別位于固相和液相的單鏈DNA分子；⑤用分離器將固/液相分離，分別獲得兩條不同的、序列互補的固相和液相單鏈DNA；本發(fā)明的特征還在于單鏈RNA的快速制備技術(shù)和試劑盒，至少包括下述步驟①提供一種生物微粒，其固相基質(zhì)表面連接有雙鏈DNA分子，在單鏈RNA的制備中作為固相DNA模板參與RNA的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；雙鏈分子可以是通過a.固相PCR擴增反應(yīng)；b.基質(zhì)微粒連接分子層的表面活性基團(tuán)與核酸分子的連接反應(yīng)；或c.抗原與抗體，配基配體等的特異性結(jié)合反應(yīng)固定在基質(zhì)微粒的表面；②加入轉(zhuǎn)錄緩沖液、rNTPs、DNA依賴的RNA聚合酶等，在適當(dāng)條件下反應(yīng)；其中至少有一種rNTP為熒光素、生物素、半抗原、糖、多糖或寡糖、金屬鰲合劑等指示分子的標(biāo)記物；③用固液相分離器將DNA固相模板與液相RNA等分離；④收集液相去除酶、rNTPs、DTT、BSA和RNA酶抑制劑等殘留物獲得純化單鏈RNA；本發(fā)明的特征還在于單鏈核酸的快速制備技術(shù)與試劑盒至少包括下述步驟①提供一種固/液相分離器和生物微粒，在生物微粒固相基質(zhì)的表面連接有一種生物分子，如親合素、鏈親合素、抗體、凝集素、金屬鰲合劑等或活性基團(tuán)，如環(huán)氧乙基、環(huán)化亞胺碳酸鹽基團(tuán)以及氰酸酯、吖內(nèi)酯等，可與各種核酸或寡核苷酸分子上的抗原或半抗原，糖、寡糖或多糖，生物素，金屬或金屬顆粒等指示分子結(jié)合或與5’末端的氨基等活性基團(tuán)發(fā)生連接反應(yīng)，使之固定或附著在固相基質(zhì)的表面；生物微粒也可預(yù)裝填在分離器內(nèi)；②經(jīng)標(biāo)記的單鏈DNA或RNA與生物微粒表面的生物分子結(jié)合或與基質(zhì)微粒表面的活性基團(tuán)發(fā)生連接反應(yīng)，使之被固定在基質(zhì)微粒的表面，分離固/液相，獲得單鏈DNA或RNA；其中標(biāo)記的單鏈DNA或RNA可以是下述任何一種形式或通過下述任何一種方式獲得的單鏈核酸分子a.模板核酸分子與引物、dNTP、DNA聚合酶等混合，通過液相聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對模板核酸分子進(jìn)行擴增；其中至少有一種dNTP成分或一條引物用生物素、半抗原、同位素、熒光素、糖、寡糖或多糖、金屬或金屬顆粒、凝集原等指示分子標(biāo)記或5’末端被氨基化或為被修飾的核苷酸；擴增反應(yīng)至少完成一個循環(huán)，此循環(huán)包括a)加熱變性；b)退火；c)在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸引物延長；b.以RNA或mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的被指示分子標(biāo)記的cDNA；c.用權(quán)利要求1和2所述方法獲得的液相單鏈DNA和RNA；d.通過任何方式獲得或以任何形式存在的、經(jīng)加熱變性可獲得的、被指示分子標(biāo)記的單鏈核酸分子；本發(fā)明的特征還在于不同長度單鏈DNA的制備和試劑盒，可以用下述步驟和方法①提供一種生物微粒，其固相基質(zhì)表面連接的單鏈核苷酸分子中有一段未知的堿基序列，在測序中作為擴增反應(yīng)的靶核酸分子模板；單鏈核苷酸分子可以是通過a.固相PCR擴增反應(yīng)；或b.基質(zhì)微粒連接分子層的表面活性基團(tuán)與核酸分子的連接反應(yīng)，被固定在基質(zhì)微粒的表面，經(jīng)加熱變性，分離去除液相部分獲得；其未知序列的上下游序列中可帶有克隆載體多位點接頭；②生物微粒與寡核苷酸引物、dNTPs、ddNTPs(或ddNTP)及DNA聚合酶等混合，在固相基質(zhì)表面進(jìn)行熟循環(huán)測序反應(yīng)；其中引物或dNTPs、ddNTPs中至少有一個是同位素、熒光素、生物素等的標(biāo)記物；熟循環(huán)測序反應(yīng)包括a)加熱變性；b)退火；c)在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸引物延伸；延伸的引物在ddNTP處終止，形成以固相單鏈DNA為模板，不同長度的引物延伸鏈；③加熱變性，使擴增的引物延伸鏈與固相模板解鏈；④離心取液相進(jìn)行凝膠電泳，檢測DNA帶形、分析并解讀靶核酸序列。
本發(fā)明的特征還在于生物微?？梢允窍率鋈魏我环N形式①表面具有由不同活性基團(tuán)，如環(huán)氧乙基、碘乙酰、酰肼基、環(huán)化亞胺碳酸鹽基團(tuán)以及氰酸酯、吖內(nèi)酯等組成的連接分子層的基質(zhì)微粒，借助活性基團(tuán)可將核酸、寡核苷酸、抗體、親合素或鏈親合素、凝集素、金屬鰲合劑等生物分子連接并固定在固相基質(zhì)的表面；②以基質(zhì)微粒為固相載體，在其表面直接進(jìn)行固相合成，獲得與模板DNA片段的末端序列互補的寡核苷酸鏈，作為PCR反應(yīng)的固相引物；③基質(zhì)微粒及其表面通過連接分子層的活性基團(tuán)連接或固定的，與模板DNA或RNA片段的末端序列互補的，可作為各種固相PCR反應(yīng)的固相引物的寡核苷酸鏈；④固相基質(zhì)微粒通過各種固相PCR擴增反應(yīng)獲得的，保留在其表面的雙鏈DNA片段，在RNA的轉(zhuǎn)錄合成中作為轉(zhuǎn)錄模板；⑤固相基質(zhì)微粒及通過連接分子層的活性基團(tuán)連接或固定在其表面的雙鏈DNA片段，在RNA的轉(zhuǎn)錄合成中作為轉(zhuǎn)錄模板；⑥固相基質(zhì)微粒及其表面連接或固定的抗體、親合素或鏈親合素、凝集素、金屬鰲合劑等活性分子；⑦基質(zhì)微粒以及通過其表面的抗體、親合素或鏈親合素、凝集素、金屬鰲合劑等活性分子結(jié)合并固定在其表面的生物素、半抗原等指示分子標(biāo)記的核酸分子；
本發(fā)明的特征還在于基質(zhì)微粒為任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的，有熒光或無熒光的，硬質(zhì)或軟質(zhì)，磁性或非磁性、有機或無機、單體或復(fù)合材料，經(jīng)加工而成的、不同外觀形狀，大小均一的空心體、多孔或?qū)嵭捏w的固相基質(zhì)，如玻璃、塑料、葡聚糖、聚蔗糖、瓊脂糖、高分子合成材料、纖維素、乳膠、硅膠、層析基質(zhì)、陶瓷、磁性或順磁性材料、非金屬或金屬及其鰲合劑或復(fù)合材料；經(jīng)處理可在其表面獲得具有不同活性基團(tuán)，如環(huán)氧乙基、碘乙酰、酰肼基、環(huán)化亞胺碳酸鹽基團(tuán)以及氰酸酯、吖內(nèi)酯等組成的連接分子層，借助這些活性基團(tuán)可進(jìn)一步與不同長度和序列的核酸、寡核苷酸或抗體親合素等生物分子連接，使之固定在微粒表面制成各種生物微粒。
本發(fā)明的特征還在于固相引物是指，與靶核酸鏈模板末端的堿基序列互補，通過下述方法之一固定在固相基質(zhì)微粒表面的一段寡核苷酸鏈①通過DNA合成儀或其它固相合成技術(shù)，以基質(zhì)微粒為固相直接合成，并保留在基質(zhì)微粒表面的，具有游離的活性3’末端的寡核苷酸鏈；②用任何方法合成的，借助5’端的末端修飾氨基等活性基團(tuán)與固相微粒表面連接分子層的活性基團(tuán)反應(yīng)，被固定在固相微粒表面，保留游離的活性3’末端的寡核苷酸鏈；本發(fā)明的特征還在于各種PCR擴增反應(yīng)，可以是下述任何一種①以DNA片段為模板，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使引物的寡核苷酸鏈得以延伸，并使模板DNA片段得以擴增；PCR反應(yīng)循環(huán)包括a)加熱變性；b)退火；c)在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸引物延伸；每經(jīng)過一個反應(yīng)循環(huán)，模板核酸靶序列的分子數(shù)量便增加1倍；在模板核酸靶序列中可以含有限制性內(nèi)切酶多酶位點人工接頭或RNA聚合酶的啟動子；如進(jìn)行固相PCR反應(yīng)，其中至少有一條寡核苷酸鏈應(yīng)固定在固相微粒表面作為固相引物；②以微粒表面的寡核苷酸分子為固相化鉚接物，以已知序列的特異性核酸分子為模板，與游離的寡核苷酸分子配對引物，在微粒表面通過鉚鏈聚合酶鏈反應(yīng)(RCR)使寡核苷酸鏈延伸并進(jìn)一步擴增；擴增產(chǎn)物通過固相化鉚接物固定在基質(zhì)微粒表面，RCR反應(yīng)循環(huán)周期包括a)加熱變性；b)退火；c)DNA聚合酶延伸靶核苷酸鏈序列；d)DNA連接酶連接；每經(jīng)過一個反應(yīng)循環(huán)，固著在基質(zhì)微粒表面的模板核酸靶序列的分子數(shù)量便增加1倍；③以mRNA為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA為模板，以上下游兩末端互補寡核苷酸分子為引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，使模板mRNA得以擴增；如進(jìn)行固相PCR擴增，其中至少應(yīng)有一個寡核苷酸鏈被固定在固相微粒表面作為固相引物；④不對稱PCR反應(yīng)，在此反應(yīng)中，配對引物中有一條引物的數(shù)量或濃度明顯高于另一條引物，經(jīng)過幾輪循環(huán)后，其中數(shù)量較少的引物被耗盡，而數(shù)量多的引物繼續(xù)延伸、擴增，使擴增產(chǎn)物中的一條核酸單鏈的數(shù)量明顯高于另一條互補核酸單鏈；如進(jìn)行固相不對稱PCR擴增，則其中至少應(yīng)有一個寡核苷酸鏈被固定在固相微粒表面作為固相引物；⑤連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，以寡核苷酸分子為固相引物，以已知序列的特定核酸分子為模板，通過LCR循環(huán)反應(yīng)延長寡核苷酸鏈并進(jìn)一步擴增，LCR反應(yīng)循環(huán)周期包括a)加熱變性；b)退火；c)DNA連接酶連接固相和液相引物，以使靶核苷酸鏈序列延長；如進(jìn)行固相LCR擴增反應(yīng)，則其中至少應(yīng)有一個寡核苷酸鏈被固定在固相微粒表面作為固相引物；
本發(fā)明的特征還在于固液相分離及分離器，是指所用的下述任何一種固液相分離方式及其用品①一種雙層微型離心管，由內(nèi)層的固/液相分離管和外層的離心管組成，在分離管的下端是微孔膜或篩網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)可允許液體通過，加入解鏈的單鏈DNA混合物離心，使固相基質(zhì)微粒滯留在分離管內(nèi)，通過的液體被收集在離心管中；②一種微分離柱，由柱體、出液口和篩網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)組成，篩網(wǎng)允許液體流過而將固相微粒滯留在柱體內(nèi)，加入解鏈的單鏈DNA混合物，使液相與固相完全分離；③一種微分離柱，由柱體和出液口組成；在一定強度的磁場中，磁性固相基質(zhì)微粒附著在柱體的內(nèi)表面而滯留在柱體內(nèi)，使液相與固相完全分離；為增加固相微粒的回收率可以在柱體內(nèi)增加高順磁性填充物，以提高磁場的均一性并擴大固相微粒的附著表面；將分離柱脫離磁場，加壓沖洗可收集固相微粒；④一種微型過濾器，由濾器和微孔濾膜組成；解鏈的單鏈DNA混合物經(jīng)過濾器過濾；液相DNA單鏈通過過濾器，收集于試管內(nèi)，固相則滯留在過濾器內(nèi)；⑤一種微量離心管或PCR反應(yīng)管，完成最后一輪PCR循環(huán)反應(yīng)后，加熱使DNA變性解鏈，離心使基質(zhì)微粒沉淀，分別收集固相和液相部分。
⑥將生物微粒預(yù)裝填入上述5種分離器中的任何一種分離裝置內(nèi)；解鏈的單鏈核酸分子借助指示分子標(biāo)記物，與固相微粒表面的活性分子結(jié)合；分離固/液相獲得純化單鏈分子。
本發(fā)明的特征還在于試劑盒至少裝有一管生物微?；蚬滔嗷|(zhì)，其固相基質(zhì)表面具有化學(xué)活性基團(tuán)或生物活性分子；并與下述成分分別或共同組成不同的試劑盒①至少有一管為測序酶，耐熱或不耐熱的DNA聚合酶或其酶活性的片段、基因重組產(chǎn)物或其酶修飾物等，用于PCR擴增反應(yīng)或核酸的測序；②至少有一管為反轉(zhuǎn)錄酶，用于cDNA的合成；③至少有一管為核酸鏈接酶，用于DNA分子鏈的連接；④至少有一管為dNTP或rNTP，其中至少有一種成分為指示分子的標(biāo)記物或被修飾的核苷酸，在PCR擴增反應(yīng)或轉(zhuǎn)錄合成中作為酶的底物；⑤至少有一管為非固相寡核苷酸引物，其5’末端可被氨基化或用生物素、半抗原或熒光素等標(biāo)記；⑥至少有一種可用于固/液相分離的分離器；⑦至少有一管為電泳樣品緩沖液，用于核酸電泳樣品的處理；⑧至少有一管為ddNTPs，其中至少有一種成分為指示分子的標(biāo)記物，用于鏈延伸一鏈終止等測序反應(yīng)；⑨至少有一管為RNA聚合酶，用于RNA的轉(zhuǎn)錄合成；⑩至少有一管為緩沖液，用于PCR擴增、轉(zhuǎn)錄合成或?qū)嶒炛械母鞣N漂洗等，如Tris-HCl緩沖液、TE，磷酸緩沖液、碳酸緩沖液等。
本發(fā)明具有以下特點1操作簡便、效率高。靶核苷酸的擴增反應(yīng)在固相微粒的表面進(jìn)行，使擴增產(chǎn)物與酶及其底物等的分離以及兩條互補單鏈的分離操作簡便易行，省略了基因重組、克隆化、轉(zhuǎn)化細(xì)菌以及后續(xù)的培養(yǎng)，靶核酸的分離純化等操作步驟；2.易于制備、成本低。本發(fā)明所述的固相引物可通過固相合成直接獲得，通過各種PCR反應(yīng)可直接獲得DNA和RNA單鏈核酸分子，并完成探針的標(biāo)記；此外固相單鏈核酸分子作為模板可以多次重復(fù)使用，省略了模板、探針標(biāo)記和制備中繁雜的分離純化過程，大大簡化了制備工藝；3.操作簡便，節(jié)省樣品與試劑。操作均可在微柱或微管等微型反應(yīng)容器中進(jìn)行，單鏈核酸分子的合成、標(biāo)記以及結(jié)合、漂洗、分離與純化等反應(yīng)均在同一個容器中進(jìn)行，解決了傳統(tǒng)和現(xiàn)有單鏈核酸分子制備技術(shù)中操作步驟繁瑣、試劑種類繁多、試劑用量大等問題；同時還解決了因樣品不易獲得和標(biāo)記物價格昂貴等所帶來的困擾；全部操作可在多孔微量PCR反應(yīng)板中進(jìn)行，易于實現(xiàn)大規(guī)模制備和全自動化操作；4.結(jié)果易于分析。由于固相微粒和液相單鏈核酸分子均可分別進(jìn)行不同的標(biāo)記，適當(dāng)大小的固相微?；蚝袩晒夥肿蛹{米微粒上的單鏈核酸分子可作為探針直接用于各種生物檢測；因此，配合固/液相分離技術(shù)，使獲得的固相和液相單鏈分子的分析鑒定極其簡單易行，如通過對液相互補鏈的分析可以明確獲得固相互補鏈的分子大小、堿基序列、純度等，反之亦然；5.用途廣泛。本發(fā)明不僅可用于新藥的研究開發(fā)和基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、功能組學(xué)等現(xiàn)代生命科學(xué)的研究與開發(fā)；而且還可直接用于鑲嵌式生物芯片生物微球和探針的制備、疾病的診斷，基因克隆、核苷酸序列分析，以及用于藥物篩選、藥物靶標(biāo)分子或蛋白—核酸相互作用中單鏈核酸結(jié)合物的分子量、等電點、結(jié)構(gòu)、功能、親和力、組織/細(xì)胞及亞微或超微結(jié)構(gòu)定位等進(jìn)一步分析，甚至還可直接用于對結(jié)合物的不同解吸附條件與分離純化等的分析研究。
下面結(jié)合附圖作進(jìn)一步的說明

圖1.DNA單鏈和單鏈探針的制備流程與原理示意中活性基團(tuán)2在固相基質(zhì)微粒1的表面形成連接分子層，將固相引物寡核苷酸3固定在微粒表面；與加熱變性后的模板核酸分子6和液相引物4等共同退火，在DNA聚合酶的催化下，固液相引物3和4的寡核苷酸分子鏈延伸，獲得延長的引物單鏈核酸分子7和8；再變性退火，使單鏈核酸分子7和8與模板解鏈，并作為模板與引物分子復(fù)性；在DNA聚合酶的催化下，固液相引物3和4的寡核苷酸分子鏈延伸，獲得新的延長引物單鏈核酸分子7和8；每完成一次反應(yīng)循環(huán)，單鏈分子7和8的數(shù)量(即靶核酸的數(shù)量)增加1倍；反應(yīng)完成后，再加熱變性，使單鏈核酸分子7和8解鏈，分離固液相，獲得大量的固相單鏈DNA分子7和液相單鏈分子8；液相引物4末端用指示分子熒光素5標(biāo)記可用作探針；用經(jīng)過修飾的dNTP作為底物可以制備反義寡核苷酸藥物；檢測液相的熒光強度可進(jìn)行定量分析；如液相引物4末端用指示分子生物素、半抗原等標(biāo)記，則可進(jìn)一步用鏈親合素或抗體柱等分離純化，獲得新的固相單鏈分子。圖2.單鏈RNA的制備流程與原理示意中，活性基團(tuán)2在固相基質(zhì)微粒1的表面形成連接分子層，通過固相PCR擴增反應(yīng)或末端的活性氨基將雙鏈DNA模板10固定在固相基質(zhì)微粒1的表面；RNA聚合酶11識別DNA模板10中的啟動子，催化以雙鏈DNA分子10為模板的RNA單鏈12的合成，分離固液相，獲得大量的指示性分子熒光素(或同位素)13等標(biāo)記的液相單鏈RNA分子12作為生物探針；或用經(jīng)過修飾的rNTP作為底物以制備反義RNA藥物；或在rNTPs中加入適量的生物素或糖或寡糖等標(biāo)記的rNTP，則可以用于RNA的分離純化。分離的固相可以重新作為模板用于RNA單鏈12的合成。圖3.單鏈核酸和探針的固相分離和制備流程與原理示意中寡核苷酸分子引物14和15與變性模板16共退火，其中引物15的末端帶有指示性標(biāo)記分子生物素18，在DNA聚合酶的作用下，引物14和15延伸，獲得單鏈DNA分子19和20；再變性使單鏈核酸分子19和20與模板解鏈，并作為模板與引物分子退火復(fù)性；在DNA聚合酶的催化下，引物14和15的寡核苷酸分子鏈延長，獲得新的延長引物單鏈核酸分子19和20；每完成一次反應(yīng)循環(huán)，單鏈分子19和20的數(shù)量(即靶核酸的數(shù)量)增加1倍；反應(yīng)完成后，加熱變性，使單鏈核酸分子19和20解鏈，生物素分子18與固相基質(zhì)微粒表面的親合素21(也可以是鏈親合素或抗生物素抗體)結(jié)合，使單鏈核酸分子20被吸附在基質(zhì)微粒的表面，分離固液相分別獲得單鏈分子19(液相)和單鏈分子20(固相)；為避免殘留的標(biāo)記引物15與合成的單鏈DNA分子20競爭結(jié)合固相微粒表面的親合素或抗體等，實施中可采用不對稱合成，使引物15的濃度低于引物14，在反應(yīng)完成前引物15被耗盡，全部摻入單鏈DNA分子20中。
圖4.幾種常用固液相分離器的外觀結(jié)構(gòu)與工作原理示意中4A.示一種微分離柱，由柱體23、出液口25和篩網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)24組成，篩網(wǎng)24允許液體流過而將固相的生物微粒22滯留在柱體內(nèi)，加入經(jīng)解鏈處理的單鏈DNA混合物，使液相26與固相22完全分離，并液相26被收集在試管27中；圖中4B.一種雙層微型離心管，由內(nèi)層的固/液相分離管28和外層的離心管30組成，在分離管的下端是微孔膜或篩網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)29可允許液體通過，加入解鏈處理的單鏈DNA混合物離心，使固相的生物微粒22滯留在分離管28內(nèi)，通過的液體被收集在離心管30中；圖中4C.一種微分離柱，由柱體31和出液口25組成；在一定強度的磁場中，磁性固相基質(zhì)微粒附著在柱體的內(nèi)表面而滯留在柱體內(nèi)，使液相與固相完全分離；為增加固相微粒的回收率可以在柱體內(nèi)增加高順磁性填充物32，以提高磁場的均一性并擴大固相微粒的附著表面；將分離柱脫離磁場，加壓沖洗可回收固相微粒；圖中4D.一種微型過濾器，由微孔濾膜33、濾膜支板34和濾器35組成；解鏈的單鏈DNA混合物經(jīng)過濾器過濾；液相DNA單鏈26通過過濾器，收集于試管27內(nèi)，固相生物微粒22則滯留在過濾器內(nèi)；打開濾器35沖洗濾膜可回收固相微粒22。微孔濾膜33可以有不同規(guī)格，以適應(yīng)對固液相的分離和對不同分子量的生物大分子的分離。
圖5.制備測序單鏈DNA的流程與原理示意中固相基質(zhì)微粒1表面的活性基團(tuán)2，將固相引物寡核苷酸3固定在微粒表面；與變性的靶核酸分子模板6以及液相引物4等退火，在DNA聚合酶的催化下，固液相引物3和4的寡核苷酸分子鏈延長，獲得延長引物單鏈核酸分子7和8；再變性退火，使單鏈核酸分子7和8與模板解鏈，并作為模板與引物分子3和4復(fù)性；在DNA聚合酶的催化下，固液相引物3和4的寡核苷酸分子鏈延長，獲得新的延長引物單鏈核酸分子7和8；反應(yīng)完成后，漂洗去除液相中的反應(yīng)殘留物；加熱變性使單鏈核酸分子7和8解鏈，分離固液相，獲得大量的固相單鏈DNA分子7和液相單鏈分子8；液相引物4末端用指示分子熒光素5標(biāo)記，借此可監(jiān)測分離效果和固相單鏈純度，檢測液相的熒光強度可以定量，將液相單鏈分子電泳可鑒定擴增靶核酸分子的純度和分子量大小；以固相單鏈分子為模板，加入dNTPs和適量的ddNTP以及指示分子38標(biāo)記的引物37，經(jīng)多次退火、鏈延伸—鏈終止反應(yīng)，獲得大量不同長度的單鏈DNA分子39，分離液相并電泳，即可解讀靶核酸分子的堿基序列。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。1.單鏈cDNA探針的制備1)固相引物的制備在固相基質(zhì)表面合成特定序列的寡核苷酸分子；為獲得在PCR反應(yīng)中可以利用的固相引物(PCR引物延伸方向為5’→3’，固相合成寡核苷酸延伸方向為3’→5’)，固相微粒表面的合成起始堿基通過核苷酸的側(cè)鏈與基質(zhì)表面連接分子層的活性基團(tuán)連接，以保留3’端活性基團(tuán)，用于PCR引物延伸反應(yīng)。2)固相PCR擴增將固相引物與模板核酸分子，非固相引物、dNTPs、適量Cy5-dCTP與耐熱DNA聚合酶等混合，短暫離心后將反應(yīng)管置PCR儀按下列程序，在固相基質(zhì)表面通過固相聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對模板核酸分子進(jìn)行擴增
3)固液相分離反應(yīng)完成后將反應(yīng)混合液加熱變性(97℃)，使DNA雙鏈解鏈，移入雙層離心管微分離器的分離管中，5000-10000rpm離心30-60秒，在分離管中加入50-300ul緩沖液，重復(fù)離心，分別收集固相(分離管)和液相(離心管)；4)固相單鏈DNA的分離純化取出分離管置另一離心管中加入緩沖液離心漂洗，反復(fù)3-5次；收集固相微粒獲得固相單鏈DNA，測定熒光強度計算固相單鏈DNA探針的合成量與重量或體積克分子比；用于鑲嵌式生物芯片的制備；5)液相單鏈DNA的分離純化將液相部分用酚—氯仿抽提以去除聚合酶等蛋白成分，水相部分乙醇沉淀，離心去除液體，將沉淀重溶于TE(pH7.6)，加入微型過濾器，濾器采用截留分子量大于30000的微孔濾膜，加壓或離心過濾以除去液相引物和殘留的dDNP及Cy5-dCTP等；打開濾器取下濾膜將截留物溶于緩沖液中；電泳測定DNA單鏈探針的分子量；測定熒光強度計算液相單鏈DNA探針的合成量，必要時乙醇沉淀，重溶于適量TE中，以調(diào)整液相探針的濃度。2.單鏈RNA探針的制備1)固相引物的制備在固相基質(zhì)表面合成特定序列的寡核苷酸分子，作為固相引物用于PCR延伸反應(yīng)。2)固相PCR擴增以含有特定噬菌體啟動子及其下游的外源靶序列為模板，將固相引物與非固相引物、dNTPs與耐熱DNA聚合酶等混合，短暫離心后將反應(yīng)管置PGR儀按預(yù)定程序，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴增。3)固/液相分離反應(yīng)完成后，混合液5000-10000rpm離心30-60秒，棄去上清液，加入緩沖液混勻，重復(fù)離心3-5次，保留固相獲得固相長鏈線狀雙鏈DNA模板。4)RNA的固相合成將rNTPs，生物素標(biāo)記的rGTP，BSA，亞精胺，RNA酶抑制劑和DNA依賴的RNA聚合酶等與固相DNA模板混合，37℃(T3和T7噬菌體RNA聚合酶)或40℃(SP6噬菌體RNA聚合酶)溫育1-3小時。5)單鏈RNA的分離與純化反應(yīng)完成后，混合液離心，收集上清液用乙醇沉淀，離心去除液體以及殘留的rNTPs和生物素標(biāo)記的rGTP，將沉淀用乙醇漂洗后重溶于DEPC水或TE(pH7.6)緩沖液中；離心管中的固相部分加入緩沖液混勻，重復(fù)離心3-5次，可用于RNA的再次合成。酚—氯仿抽提以去除聚合酶等蛋白成分，水相部分上述實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的適用范圍與領(lǐng)域。實施例中未注明具體實驗條件和實驗方法及其組合形式的，可參照相關(guān)實驗技術(shù)手冊或文獻(xiàn)資料，以及制造廠商所建議的條件實施或進(jìn)行。本發(fā)明在此將《生物分子固定化技術(shù)及應(yīng)用》(蔣中華等，1998年，化學(xué)出版社)，《核酸探針的合成、標(biāo)記及應(yīng)用》(Edge R.Wang，1998，科學(xué)出版社)，《最新分子生物學(xué)實驗技術(shù)》(梁國棟，2001年，科學(xué)出版社)，《分子克隆實驗指南》(薩姆布魯克，1995，科學(xué)出版社)及中國專利申請?zhí)枮?2121325.9和02123775.1的專利引為主要參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明涉及一種單鏈DNA快速制備技術(shù)及試劑盒的制備方法。該技術(shù)快速、靈敏、純度高，制備方法簡便、成本低，適合不同核酸樣品的DNA各種規(guī)模測序和探針制備，可廣泛地用于生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、動植物學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、食品與衛(wèi)生、能源與化工、環(huán)境監(jiān)測以及醫(yī)學(xué)診斷與檢測等領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種單鏈DNA快速制備技術(shù)和試劑盒，至少包括下述步驟①提供一種生物微粒，在模板的擴增反應(yīng)中作為固相引物；其固相基質(zhì)表面連接的寡核苷酸分子的序列與模板核酸分子互補；②將生物微粒與模板核酸分子，非固相引物、dNTPs與DNA聚合酶等混合，在生物微粒表面，通過固相聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對模板核酸分子進(jìn)行擴增；其中非固相引物或dNTPs中有一個可以是同位素、熒光素、生物素、半抗原、糖或多糖等的標(biāo)記物；擴增反應(yīng)至少完成一個循環(huán)，此循環(huán)包括a)加熱變性；b)退火；c)在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸引物延伸，并固定在微粒表面；③離心漂洗數(shù)次去除殘留的模板核酸分子、非固相引物、dNTPs與DNA聚合酶等；④加熱變性，使擴增的DNA互補雙鏈解鏈；⑤用分離器將固/液相分離，獲得不同的分別位于固相和液相的單鏈DNA。
2.一種單鏈RNA快速制備技術(shù)和試劑盒，至少包括下述步驟①提供一種生物微粒，其固相基質(zhì)表面連接有雙鏈DNA分子；雙鏈分子DNA分子可以是通過a.固相PCR擴增反應(yīng)；b.基質(zhì)微粒連接分子層的表面活性基團(tuán)與核酸分子的連接反應(yīng)；或c.抗原與抗體，配基配體等不同方式的特異性結(jié)合反應(yīng)固定在基質(zhì)微粒的表面；②加入轉(zhuǎn)錄緩沖液、rNTPs、DNA依賴的RNA聚合酶等，在適當(dāng)條件下反應(yīng)；其中至少有一種rNTP為熒光素等指示分子的標(biāo)記物；③用分離器將固/液相分離；④收集液相去除酶和rNTPs等殘留物獲得單鏈RNA。
3.一種單鏈核酸DNA的快速制備技術(shù)與試劑盒，至少包括下述步驟①提供一種固液相分離器和生物微粒，在生物微粒固相基質(zhì)的表面連接有一種生物分子或活性基團(tuán)；生物微粒也可預(yù)裝填在分離器內(nèi)；②經(jīng)標(biāo)記的單鏈DNA或RNA與生物微粒表面的生物分子結(jié)合或與其活性基團(tuán)發(fā)生連接反應(yīng)，分離固/液相，獲得單鏈DNA或RNA；其中標(biāo)記的DNA或RNA單鏈可以是下述任何一種形式或通過下述任何一種方式獲得的單鏈核酸分子a.模板核酸分子與引物、dNTPs、核酸酶等混合，通過液相PCR反應(yīng)對模板核酸分子進(jìn)行擴增；其中至少有一種dNTP成分或一條引物用生物素、半抗原、熒光素等指示分子標(biāo)記或5’末端被氨基化；擴增反應(yīng)至少完成一個循環(huán)，此循環(huán)包括a)加熱變性；b)退火；c)在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸引物延伸；反應(yīng)完成后，加熱變性使雙鏈解鏈；b.以RNA或mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的被指示分子標(biāo)記的cDNA；c.用權(quán)利要求1和2所述方法獲得的液相單鏈DNA和RNA；d.通過任何方式獲得或以任何形式存在的、經(jīng)加熱變性可獲得的、指示分子標(biāo)記的單鏈核酸分子；
4.一種不同長度單鏈DNA的制備方法與試劑盒，至少可包括下述步驟①提供一種生物微粒，其固相基質(zhì)表面連接的單鏈核苷酸分子中有一段未知的堿基序列，在測序中作為擴增反應(yīng)的靶核酸分子模板；②與寡核苷酸引物、dNTPs、ddNTPs及DNA聚合酶等混合，在固相基質(zhì)表面進(jìn)行測序循環(huán)反應(yīng)；其中引物或dNTPs、ddNTPs中至少有一個是同位素、熒光素、生物素等的標(biāo)記物；測序循環(huán)反應(yīng)包括a)加熱變性；b)退火；c)在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸引物延伸；延伸的引物在ddNTP處終止，形成以固相單鏈DNA為模板，不同長度的引物延伸鏈；③加熱變性，使擴增的引物延伸鏈與模板解鏈；④離心取液相進(jìn)行凝膠電泳、DNA帶形檢測和分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2和3及權(quán)利要求4所述的生物微粒，可以是下述任何一種形式①由不同活性基團(tuán)組成其表面連接分子層的固相基質(zhì)微粒；②以基質(zhì)微粒為固相載體，在其表面直接進(jìn)行固相合成，并保留在其表面；③基質(zhì)微粒及其表面通過連接分子層的活性基團(tuán)連接或固定的寡核苷酸鏈；④基質(zhì)微粒及通過各種固相PCR擴增反應(yīng)獲得、并保留在其表面的單/雙鏈DNA分子；⑤基質(zhì)微粒及通過連接分子層的活性基團(tuán)連接或固定在其表面的雙鏈或單鏈DNA分子；⑥基質(zhì)微粒及固定在其表面的抗體、親合素或鏈親合素、凝集素、金屬鰲合劑等；⑦基質(zhì)微粒以及通過其表面的抗體、親合素或鏈親合素、凝集素、金屬鰲合劑等活性分子結(jié)合并固定在其表面的生物素、半抗原等指示分子標(biāo)記的核酸分子；
6.根據(jù)權(quán)利要求1和2和3和4和5所述的基質(zhì)微粒，為任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的，有熒光或無熒光的，硬質(zhì)或軟質(zhì)、磁性和非磁性、有機或無機、單體或復(fù)合材料，經(jīng)加工而成的、不同外觀形狀，大小均一的空心體、多孔或?qū)嵭捏w的固相基質(zhì)；經(jīng)處理可在其表面獲得具有不同活性基團(tuán)的連接分子層，借助活性基團(tuán)可進(jìn)一步與不同長度和序列的核酸、寡核苷酸或抗體等生物分子連接，使之固定在微粒表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和2和3和4所述的固相引物是指，與模板靶核酸鏈的堿基序列互補，通過下述方法之一固定在固相基質(zhì)微粒表面的一段寡核苷酸鏈①通過DNA合成儀或其它固相合成技術(shù)，以基質(zhì)微粒為固相載體直接合成，并保留在基質(zhì)微粒表面的，具有游離的活性3’末端的寡核苷酸鏈；②用任何方法合成的，借助5’端的末端氨基等活性基團(tuán)與固相微粒表面連接分子層的活性基團(tuán)反應(yīng)，被固定在固相微粒表面，保留游離的活性3’末端的寡核苷酸鏈；
8.根據(jù)權(quán)利要求1和2和3和4和5所述的各種PCR擴增反應(yīng)，可以是下述任何一種方法①以DNA片段為模板，通過至少一個循環(huán)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使引物的寡核苷酸鏈延伸，并使模板DNA片段得以擴增；PCR反應(yīng)循環(huán)包括a)加熱變性；b)退火；c)在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸引物延伸；在模板核酸靶序列中可以含有限制性內(nèi)切酶位點或RNA聚合酶的啟動子；在進(jìn)行固相PCR反應(yīng)時，配對引物中至少有一條為固相引物；②以微粒表面的寡核苷酸分子為固相化鉚接物，以已知序列的特異性核酸分子為模板，與游離的寡核苷酸分子配對引物，在微粒表面通過鉚鏈聚合酶鏈反應(yīng)(RCR)使寡核苷酸鏈延伸并進(jìn)一步擴增；RCR反應(yīng)循環(huán)周期包括a)加熱變性；b)退火；c)DNA聚合酶延伸靶核苷酸鏈序列；d)DNA連接酶連接；③以mRNA為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA為模板，以寡核苷酸分子為引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，使模板mRNA得以擴增；在固相RT-PCR反應(yīng)中，至少有一條寡核苷酸為固相引物；④不對稱PCR，在PCR反應(yīng)中，配對引物中有一條引物的數(shù)量或濃度明顯高于另一條引物，使擴增產(chǎn)物的其中一條核酸單鏈的數(shù)量明顯高于另一條互補核酸單鏈；⑤連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，以寡核苷酸分子為固相引物，以已知序列的特定核酸分子為模板，通過LCR循環(huán)反應(yīng)延伸寡核苷酸鏈并進(jìn)一步擴增，LCR反應(yīng)循環(huán)周期包括a)加熱變性；b)退火；c)DNA連接酶連接固相和液相引物，以使靶核苷酸鏈序列延伸；
9.根據(jù)權(quán)利要求1和2和3和4所述的固液相分離及分離器，可以是下述任何一種固液相分離方式及其用品①一種雙層微型離心管，由內(nèi)層的固/液相分離管和外層的離心管組成，在分離管的下端是微孔膜或篩網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)，使基質(zhì)微粒滯留在分離管內(nèi)，將流過的液體收集在離心管中；②一種微分離柱，由柱體、出液口和篩網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)組成，篩網(wǎng)允許液體流過而將固相微粒滯留在柱體內(nèi)，使液相與固相分離；③一種微分離柱，由柱體和出液口組成，在柱體內(nèi)可添加高順磁性填充物；磁性固相基質(zhì)微粒流經(jīng)對，附著在柱體的內(nèi)表面并滯留在柱體內(nèi)，使液相與固相完全分離；④一種微型過濾器，由濾器和不同孔徑的微孔濾膜組成；⑤一種微量離心管或PCR反應(yīng)管，完成最后一輪PCR循環(huán)反應(yīng)后，加熱使DNA變性解鏈，離心分離沉淀和上清液部分；⑥預(yù)裝填生物微粒的上述5種分離器中的任何一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求1和2和3和4所述的試劑盒，至少裝有一管生物微?；蚬滔嗷|(zhì)，其固相基質(zhì)表面具有化學(xué)活性基團(tuán)或生物分子；并與下述成分分別或共同組成不同的試劑盒①至少有一管為DNA聚合酶或其酶活性的片段、基因重組產(chǎn)物或酶修飾物等；②至少有一管為反轉(zhuǎn)錄酶；③至少有一管為核酸連接酶；④至少有一管為dNTP或rNTP，其中至少有一種成分為指示分子的標(biāo)記物；⑤至少有一管為非固相寡核苷酸引物；⑥至少有一種可用于固/液相分離的分離器；⑦至少有一管為電泳樣品緩沖液；⑧至少有一管為ddNTPs，其中至少可有一種成分為指示分子的標(biāo)記物；⑨至少有一管為DNA依賴的RNA聚合酶⑩至少有一管為緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單鏈DNA快速制備技術(shù)及試劑盒的制備方法。該技術(shù)快速、靈敏、純度高，制備方法簡便、成本低，適合各種規(guī)模不同核酸樣品的DNA測序和探針制備。主要特征在于將一條引物通過固相合成或化學(xué)偶聯(lián)等方法固定在固相基質(zhì)微粒的表面獲得固相引物，以靶核酸為模板在固相基質(zhì)的表面進(jìn)行固相PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)加熱變性，使DNA雙鏈解鏈，而由固相引物延伸獲得的DNA單鏈仍然保留在固相基質(zhì)的表面；分離固/液相獲得兩條互補的DNA單鏈。運用本發(fā)明制備的單鏈DNA和RNA可用于核酸的測序，反義寡核苷酸藥物的合成、單鏈探針的制備以及SELEX分子文庫的構(gòu)建等，可廣泛地用于生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、疾病預(yù)防、農(nóng)牧業(yè)、食品與衛(wèi)生、能源與化工、環(huán)境監(jiān)測以及醫(yī)學(xué)診斷與檢測等領(lǐng)域。
文檔編號C12P19/00GK1475576SQ0212576
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者趙翀, 趙 申請人:趙翀, 趙