專利名稱：含有Cry3A基因轉基因作物核酸擴增用引物序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種含有Cry3A基因轉基因作物(GMO)核酸擴增用引物序列國內外所有的檢測方法并沒有完全解決轉基因產品的檢測問題，新的檢測方法在不斷出現，并在繼續(xù)完善之中。首先，目前國內外常用的幾套篩選引物，不能完全檢測出目前已商品化的轉基因品種；傳統(tǒng)的的PCR技術較難控制污染的產生；另外，質量不過關的檢測試劑，經常影響檢測結果的判斷和檢測出證工作。
到目前為止，最有發(fā)展前途的檢測技術為實時熒光PCR技術。實時熒光PCR技術具有很多優(yōu)點使用了雜交探針，提高了檢測的準確性；熒光檢測的高靈敏度；不用對PCR產物后期處理，較好地降低了檢測過程中的污染；邊擴增邊檢測，提高了檢測速度；可以使用國際標準品對檢測樣品進行定量。這個技術的核心環(huán)節(jié)是首先要獲得能高效、特異并靈敏地擴增目的片斷DNA的引物。
據國際農業(yè)生物技術應用咨詢服務中心(ISAAA)統(tǒng)計，2001年全世界轉基因作物種植面積為5260萬公頃，十多個國家已種植轉基因作物，其中99％的轉基因作物種植在美國、阿根廷、加拿大和中國，已批準商品化轉基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜、甜菜、香石竹、矮牽牛、亞麻、煙草、西瓜、菊苣等。據估計，用這些轉基因作物生產加工的食品全世界有近萬種。
對轉基因產品的安全性，特別是轉基因食品對人和動物的健康及對生態(tài)環(huán)境的影響，自轉基因技術出現以來，就一直是世界各國及聯合國等國際組織關心的焦點問題，2000年聯合國通過了“生物安全議定書”，該議定書對除了藥物以外的所有進出境活性轉基因生物有關過境、審批、檢測、風險評估和管理、賠償責任等做出了詳細的規(guī)定，其中最重要的措施之一就是對轉基因產品要進行檢驗，以明確其種類，確定是否為已批準的或已獲得許可的轉基因產品，以防止一些具有風險的轉基因產品任意擴散，造成不可挽回的損失。2001年歐盟要求對轉基因食品進行標識管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超過1％的轉基因產品(閾值)則不用標識，這樣轉基因產品檢測不但需要定性，還需要定量檢測。不同國家閾值大小不一樣，從1-5％不等。我國于2001年5月9日公布并實施《農業(yè)轉基因生物安全管理條例》，并于2002年1月5日公布了農業(yè)轉基因生物安全評價、標識和進口安全管理三個配套管理辦法。目前全世界36個國家和地區(qū)出臺了各種轉基因產品有關的法律法規(guī)?？傊?，轉基因產品的研究、生產、銷售都要在政府有關部門的許可和監(jiān)督下，在特定的環(huán)境和地點進行。
事實上，最近幾年已先后發(fā)現轉基因產品研究、生產及進出口過程中出現安全及監(jiān)管事故，存在各種各樣的轉基因產品擴散、污染及安全隱患，加大對轉基因產品的檢測監(jiān)管是非常必要的。
2002年歐盟執(zhí)行新的轉基因產品管理法規(guī)，要求對轉基因產品從生產、運輸、保存、銷售進行全程的“跟蹤”、檢測，以保證轉基因產品不污染非轉基因產品。美國提出了品種“個性保存”方案，所不同的是要求對非轉基因產品從生產、運輸、保存、銷售進行全程的“跟蹤”檢測，以確保非轉基因產品不被轉基因產品污染(事實上完全不被污染是不可能的，但要控制在一定的許可范圍之內)。許多國家對進口非轉基因食品，要求出口商提供經檢測合格的非轉基因產品證明。
綜上所述，轉基因食品從研究、生產、貯存、運輸、銷售、進出口等環(huán)節(jié)都需要檢驗監(jiān)控，不但要求檢測出是否含有轉基因，而且要檢測出轉基因產品的含量。
對轉基因產品的檢測，主要想解決如下幾個方面的問題是否為轉基因產品；如果含有轉基因產品、又是某國已批準商品化的轉基因產品，則要檢測出轉基因產品的含量是否達到允許值；如果是尚未批準的轉基因產品，原則上不允許進口或銷售。所有這些都離不開確實可靠的GMO檢測方法。
一個好的GMO檢測方法首先要有較廣泛的GMO針對性。不同的轉基因作物的獲得性狀多種多樣，Cry3A基因(或其人工改建序列)作為一利抗蟲基因，是一種常見的插入序列，在轉基因作物中普遍存在。因此，Cry3A基因成為GMO檢測的一個重要的DNA序列。
為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案
一種含有Cry3A基因轉基因作物核酸擴增用引物序列，所述的引物序列為由上游引物CryIII418μ，其序列為TCCGGTTACGAGGTTCTT和下游引物CryIIIa483r，其序列為CCATAGATTTGAGCGTCCTTA組成的引物對，在該引物對的上游引物位置前延10個堿基得到CryIIIa408，后延10個堿基得到CryIIIa428，而引物對的下游引物位置前延10個堿基得到CryIIIa473，后延10個堿基得到CryIIIa493，在上述引物對的上下游延伸位置的區(qū)域范圍內得到的引物序列。
一種含有Cry3A基因轉基因作物核酸擴增用引物序列，所述的引物序列為由上游引物CryIIIa339u其序列為CACAGCCAAGGTAGGATCAGA和下游引物CryIIIa483r其序列為CCATAGATTTGAGCGTCCTTA組成的引物對，在該引物對的上游引物位置前延10個堿基，后延10個堿基，而引物對的下游引物位置前延10個堿基，后延10個堿基，在上述引物對的上下游延伸位置的區(qū)域范圍內得到的引物序列。
一種含有Cry3A基因轉基因作物核酸擴增用引物序列，所述的引物序列為由上游引物Cry3a1056u，其序列CTATAGAGCCGTCGCAAACA和下游引物Cry3a1212r其序列GAGGCAATTGGTCGATAGAA組成的引物對，在該引物對的上游引物位置前延10個堿基，后延10個堿基，而引物對的下游引物位置前延10個堿基，后延10個堿基，在上述引物對的上下游延伸位置的區(qū)域范圍內得到的引物序列。
最優(yōu)引物序列如下CryIIIa 418uTCCGGTTACGAGGTTCTTCryIIIa 483rCCATAGATTTGAGCGTCCTTACryIIIa 339uCACAGCCAAGGTAGGATCAGACryIIIa 483rCCATAGATTTGAGCGTCCTTACry3a 1056uCTATAGAGCCGTCGCAAACACry3a 1212rGAGGCAATTGGTCGATAGAA(Cry3A基因全序列見附錄一)
對GMO中選用的多種Cry3A基因序列(包括Cry3A基因的天然序列以及人工改建序列)進行比較，選擇其中缺乏二級結構且保守的基因區(qū)設計多對引物。引物長度一般為20個堿基左右，GC含量為50％-60％，引物內無二級結構和重復性，引物間和引物內無互補序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5℃。根據上述原則設計出的引物如下上游CryIIIa306u，CryIIIa339u，CryIIIa365u.CryIIIa418u，CryIIIa1036u，CryIIIa1056u，CryIIIa1059u，CryIIIa1087u，CryIIIa1112u下游CryIIIa483r，CryIIIa495r，CryIIIa538r，CryIIIa1102r，CryIIIa1113r，CryIIIa1139r，CryIIIa1146r，CryIIIa1188r，CryIIIa1210r最優(yōu)引物序列如下CryIIIa 418uTCCGGTTACGAGGTTCTTCryIIIa 483rCCATAGATTTGAGCGTCCTTACryIIIa 339uCACAGCCAAGGTAGGATCAGACryIIIa 483rCCATAGATTTGAGCGTCCTTACry3a 1056uCTATAGAGCCGTCGCAAACACry3a 1212rGAGGCAATTGGTCGATAGAA反應體系的建立及優(yōu)化反應體系的建立和優(yōu)化中所采用的靶區(qū)域模板以如下方法獲得用已確證的轉入該基因的轉基因土豆為材料，以Promega Purification kit提取基因組核酸，再分別用上述檢測序列區(qū)域中的最長的擴增片段的引物進行PCR擴增。擴增產物用1×TE進行10倍梯度稀釋，選取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共5個稀釋度為系列陽性模板，并取其中Ct值27至29之間者作為以后反應體系優(yōu)化時的模板。
引物的篩選引物篩選實驗中將上述上游引物和下游引物任意配對進行實驗。
根據本公司既往經驗，引物篩選結合特異的探針，采用熒光PCR，并輔以瓊脂糖電泳，熒光PCR儀采用Roche Light-Cycelr。所采用的PCR反應體系如表1所示。
表1.PCR反應體系

PCR條件的選擇依據本公司以往的經驗，PCR條件的選擇如下93℃3min；

40個循環(huán)(60℃末收集熒光)。
在同樣的模板量、同樣的反應條件下，以Cry3A基因序列的特異熒光探針信號所獲得的Ct值和Rn值為指標(這兩者能反映擴增片斷的量和質)，比較不同引物對組合的擴增情況；同時再將同一PCR產物進行瓊脂糖電泳。選擇擴增條帶單一者而且Ct值和Rn值高者，做為待選的DNA/PCR檢測的引物對。見下1中，2為cry3a306/495，Ct29.35；3為cry3a418/483，Ct26.37；10為cry3a306/538，Ct32.43；11為cry3a339/483；Ct32.43；12為cry3a339/495，Ct29.85；16為cry3a365/483，Ct31.15；20為cry3a418/495，Ct29.23。
從

圖1中可以看出Cry3A418/483這對引物的擴增線Ct值比較小(26.37)，其熒光強度Rn也有一定高度，初步選定其做為待用的DNA/PCR檢測的引物對。
最初篩選出能擴增cry3a基因的最佳引物對為上游cryIIIa418和下游cryIIIa483；其Ct值為26.37。為考察此區(qū)域附近其它的引物位置是否具有同樣擴增效果，遂又在此引物對位置(cryIIIa418)的基礎之上，將上游引物前延10個堿基得到cryIIIa408、cryIIIa493。經過與前述同樣條件做熒光PCR的篩選，引物對cryIIIa408/cryIIIa473的Ct值為26.92；引物對cryIIIa428/cryIIIa493的Ct值為27.34。這些結果提示，在初篩最佳引物對的上下游各延伸10個堿基的區(qū)域范圍內，仍能選到很好的cry3a基因的擴增引物。前、后延伸后的兩個上游引物cryIIIa408CTTTGCTATCTCCGGTTACGcryIIIa428AGGTTCTTTTCCTCACTA前、后延伸后的兩個下游引物；cryIIIa473AGCGTCCTTAAGGAGAAACAcryIIIa493CACTCTTCTCCATAGATTTG
用選出的最佳上下游引物對進行PCR反應體系的優(yōu)化a.引物濃度的優(yōu)化實驗中將引物濃度從0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L遞增。對引物不同濃度的配比進行了比較。最佳引物終濃度結果如下

b.鎂離子濃度的優(yōu)化實驗中將鎂離子濃度從1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L遞增。
從多次重復實驗中選定2.5mmol/L MgCl2為試劑盒反應體系鎂離子濃度。
c.Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化Taq酶用量(以單位U計)的優(yōu)化實驗結果，選定2U Taq酶作為試劑盒中使用Taq酶量。
d.dNTPs濃度的優(yōu)化dNTPs濃度的優(yōu)化實驗中選定0.2mmol/L作為試劑盒dNTPs的終濃度。
e.綜合以上反應體系優(yōu)化實驗結果，優(yōu)化后的PCR反應體系見表2。
表2優(yōu)化后的PCR反應體系

4.發(fā)明的效果經過反復篩選，得到Cry3A418/483這對最佳引物對。其用途包括用于常規(guī)PCR(瓊脂糖電泳)、PCR/ELISA檢測或熒光PCR檢測。將其用于做熒光PCR檢測時，以0.1％轉基因土豆提取的DNA做模板，得到的Ct值在31.0-32.0之間，這是目前不同熒光測定儀器的可靠檢測下限；而0.1％的檢測靈敏度已經達到了目前國際同類產品的檢測標準。
實施例1定性檢測選取轉基因及非轉基因的農產品如大豆、玉米、油菜、番茄、土豆，以Promega磁珠法提取基因組DNA，具體為稱重100mg植物材料，置于2ml離心管中；加入500ul Lysis Buffer A和5ul RNase A，與材料混勻；加入250ul Lysis BufferB，混勻，室溫放置10分鐘；加入750ul沉淀緩沖液，混勻后高速離心(13000×g)10分鐘；吸取上清于干凈的2ml離心管中，加入50ul磁粉液，混勻；混合液中加入0.8體積異丙醇，混勻，室溫放置5分鐘；將離心管置于磁架上1分鐘，去澄清液；取出離心管，再加入250ul Lysis Buffer B，混勻后置于磁架上1分鐘，去澄清液；用1ml 70％乙醇清洗磁粉，置于磁架上1分鐘，去澄清液；步驟重復2次；取出離心管，于65℃干浴鍋中干燥5分鐘或室溫下干燥15-30分鐘；離心管中加入100ul去離子水，混勻后于65℃干浴鍋中孵育5分鐘，再移至磁架上1分鐘，吸取澄清液于0.5ml干凈離心管中，做為DNA模板備用。
用Cry3A 418u/Cry3A 483r引物做熒光PCR檢測，具體為20ul反應體系中，含植物基因組DNA 2ul，進行熒光PCR檢測，具體反應條件同前。經檢測，上述轉基因作物如含有Cry3A基因(如轉基因土豆)則陽性擴增，其檢測靈敏度均可達到0.1％；而非轉基因的農產品或不含Cry3A基因的轉基因農產品等均無擴增信號，提示該引物對具有良好的靈敏度和特異性。
實施例2電泳檢測取符合國際標準的轉基因土豆標準品為材料，基因組DNA提取方法同前，用Cry3A 418u/Cry3A 483r引物引物進行PCR擴增，PCR擴增條件如下93℃3min 1個循環(huán)93℃15 sec；60℃30 sec；72℃ 1min 40個循環(huán)取上述擴增產物，采用1％瓊脂糖，2V/CM電泳一小時，EB工作液浸泡15min，紫外燈下觀察結果可見陽性標本均可見一條清晰的擴增帶，而陰性樣品無任何擴增帶，具體見圖2。
圖2中，1)0.0％轉基因土豆標準品2)0.1％轉基因土豆標準品3)0.5％轉基因土豆標準品4)2.0％轉基因土豆標準品M)2000ladder本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明提供的Cry3A引物做熒光PCR檢測，其檢測靈敏度可達0.1％，該引物具有良好的靈敏度和特異性。該引物對做PCR定量檢測時，其檢測效率可達到核酸擴增領域里該項目的國際水平。附錄一Cry3A基因全序列ATGACTGCAGACAACAACACCGAAGCCCTCGACAGTTCTACCACTAAGGATGTTATCCAGAAGGGTATCTCCGTTGTGGGAGACCTCTTGGGCGTGGTTGGATTTCCCTTCGGTGGAGCCCTCGTGAGCTTCTATACAAACTTTCTCAACACCATTTGGCCAAGCGAGGACCCTTGGAAAGCATTCATGGAGCAAGTTGAAGCTCTTATGGATCAGAAGATTGCAGATTATGCCAAGAACAAGGCTTTGGCAGAACTCCAGGGCCTTCAGAACAATGTGGAGGACTACGTGAGTGCATTGTCCAGCTGGCAGAAGAACCCTGTTAGCTCCAGAAATCCTCACAGCCAAGGTAGGATCAGAGAGTTGTTCTCTCAAGCCGAATCCCACTTCAGAAATTCCATGCCTAGCTTTGCTCryIIIa 339uATCTCCGGTTACGAGGTTCTTTTCCTCACTACCTATGCTCAAGCTGCCAACACCCACTTGTTTCTCCTTCryIIIa 418uAAGGACGCTCAAATCTATGGAGAAGAGTGGGGATACGAGAAAGAGGACATTGCTGAGTTCTACAAGCGTCryIIITa 483rCAACTTAAGCTCACCCAAGAGTACACTGACCATTGCGTGAAATGGTATAACGTTGGTCTCGATAAGCTCAGAGGCTCTTCCTACGAGTCTTGGGTGAACTTCAACAGATACAGGAGAGAGATGACCTTGACTGTGCTCGATCTTATCGCACTCTTTCCCTTGTACGATGTGAGACTCTACCCAAAGGAAGTGAAAACTGAGCTTACCAGAGACGTGCTCACTGACCCTATTGTCGGAGTCAACAACCTTAGGGGTTATGGAACTACCTTCAGCAATATCGAAAACTACATTAGGAAACCACATCTCTTCGACTATCTTCACAGAATTCATTCCACACAAGGTTTCAACCAGGATACTATGGTAACGACTCCTTCAACTATTGGTCCGGTAACTATGTTTCCACCAGACCAAGCATTGGATCTAATGACATCATCACATCTCCCTTCTATGGTAACAAGTCCAGTGAACCTGTGCAGAACCTTGAGTTCAACGGCGAGAAAGTCTATAGAGCCGTCGCAAACACCAATCTCGCTGTGTGGCCATCCGCAGTTTCry3a 1056uACTCAGGCGTCACAAAGGTGGAGTTTAGTCAGTATAACGATCAGACCGATGAGGCCAGCACCCAGACTTACGACTCCAAACGTAACGTTGGCGCAGTCTCTTGGGATTCTATCGACCAATTGCCTCCAGAAACCCry3a 1212rACAGACGAACCATTGGAGAAGGGCTACAGCCACCAACTTAACTATGTGATGTGCTTCTTGATGCAAGGTTCCAGAGGGACCATTCCAGTGTTGACCTGGACACACAAGTCCGTGGACTTCTTCAACATGATCGATAGCAAGAAGATCACTCAACTTCCCTTGGTGAAAGCCTACAAGCTGCAATCTGGTGCTTCCGTTGTCGCAGGTCCCAGATTCACTGGAGGTGACATCATCCAGTGCACAGAGAACGGCAGCGCAGCTACTATCTACGTGACACCTGATGTGTCTTACTCTCAGAAGTACAGGGCACGTATTCATTACGCATCTACCAGCCAGATCACCTTCACACTCAGCTTGGATGGAGCACCCTTCAACCAGTATTACTTTGACAAGACCATCAACAAAGGTGACACTCTCACATACAATAGCTTCAACTTGGCAAGTTTCAGCACACCATTTGAACTCTCAGGCAACAATCTTCAGATCGGCGTCACCGGTCTCAGCGCCGGAGACAAAGTCTACATCGACAAGATTGAGTTCATCCCAGTGAAC
序列表<110>深圳市匹基生物工程股份有限公司國家出入境檢驗檢疫局動植物檢疫實驗所<120>含有Cry3A基因轉基因作物核酸擴增用引物序列<130><160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>1tccggttacg aggttctt18<210>2<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>2ccatagattt gagcgtcctt a21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>3cacagccaag gtaggatcag a21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>4ccatagattt gagcgtcctt a21<210>5<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>5ctatagagcc gtcgcaaaca 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>6gaggcaattg gtcgatagaa 20
權利要求
1.一種含有Cry3A基因轉基因作物核酸擴增用引物序列，其特征在于所述的引物序列為由上游引物CryIII418μ，其序列為TCCGGTTACGAGGTTCTT和下游引物CryIIIa483r，其序列為CCATAGATTTGAGCGTCCTTA組成的引物對，在該引物對的上游引物位置前延10個堿基得到CryIIIa408，后延10個堿基得到CryIIIa428，而引物對的下游引物位置前延10個堿基得到CryIIIa473，后延10個堿基得到CryIIIa493，在上述引物對的上下游延伸位置的區(qū)域范圍內得到的引物序列。
2.根據權利要求1所述的一種含有Cry3A基因轉基因作物核酸擴增用引物序列，其特征在于所述的引物序列上游引物序列為TCCGGTTACGAGGTTCTT，下游引物序列為CCATAGATTTGAGCGTCCTTA。
3.一種含有Cry3A基因轉基因作物核酸擴增用引物序列，其特征在于所述的引物序列為由上游引物CryIIIa339u其序列為CACAGCCAAGGTAGGATCAGA和下游引物CryIIIa483r其序列為CCATAGATTTGAGCGTCCTTA組成的引物對，在該引物對的上游引物位置前延10個堿基，后延10個堿基，而引物對的下游引物位置前延10個堿基，后延10個堿基，在上述引物對的上下游延伸位置的區(qū)域范圍內得到的引物序列。
4.根據權利要求3所述的一種含有Cry3A基因轉基因作物核酸擴增用引物序列，其特征在于所述的引物序列上游引物序列為CACAGCCAAGGTAGGATCAGA，下游引物序列為CCATAGATTTGAGCGTCCTTA。
5.一種含有Cry3A基因轉基因作物核酸擴增用引物序列，其特征在于所述的引物序列為由上游引物Cry3a1056u，其序列CTATAGAGCCGTCGCAAACA和下游引物Cry3a1212r其序列GAGGCAATTGGTCGATAGAA組成的引物對，在該引物對的上游引物位置前延10個堿基，后延10個堿基，而引物對的下游引物位置前延10個堿基，后延10個堿基，在上述引物對的上下游延伸位置的區(qū)域范圍內得到的引物序列。
6.根據權利要求5所述的一種含有Cry3A基因轉基因作物核酸擴增用引物序列，其特征在于所述的引物序列上游引物序列為CTATAGAGCCGTCGCAAACA，下游引物序列為GAGGCAATTGGTCGATAGAA。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有Cry3A基因轉基因作物核酸增用引物序列，這些序列分布在三對最優(yōu)引物的延伸區(qū)域范圍內。所述的最優(yōu)三對引物中的每對引物的延伸范圍是指由上游引物和下游引物組成的引物對，在該引物對的上游引物位置前延10個堿基，后延10個堿基。而引物對的下游引物位置前延10個堿基，后延10個堿基，在上述引物對的上下游延伸位置的區(qū)域范圍內得到引物序列。本發(fā)明對位于上述區(qū)域范圍內最優(yōu)引物對做熒光PCR檢測，其檢測靈敏度可達0.1％，該引物是有良好的靈敏度和特異性。該引物對做PCR定量檢測時，其檢測效率可達到核酸擴增領域該項目的國際水平。
文檔編號C12Q1/68GK1470648SQ02125638
公開日2004年1月28日 申請日期2002年7月26日 優(yōu)先權日2002年7月26日
發(fā)明者朱文斯, 黃茜華, 朱水芳 申請人:深圳市匹基生物工程股份有限公司, 國家出入境檢驗檢疫局動植物檢疫實驗所