專(zhuān)利名稱(chēng)：結(jié)核金標(biāo)快速檢測(cè)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)核抗體金標(biāo)快速檢測(cè)試劑。
背景技術(shù)：
各種資料顯示全球約三分之一人口感染了結(jié)核菌。每年約有800萬(wàn)新病例，年死亡人數(shù)超過(guò)150萬(wàn)。為此結(jié)核病稱(chēng)為20002001年WHO防治傳染病的重點(diǎn)控制對(duì)象。2000 年12月20日衛(wèi)生部公布了第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果我國(guó)結(jié)核病情相當(dāng)嚴(yán)重，在部分地區(qū)甚至有蔓延的趨勢(shì)。據(jù)調(diào)查全國(guó)有1/3以上人口感染了結(jié)核菌，其中有 10%的人已經(jīng)發(fā)?。蝗绮徊扇∮行Т胧?，在未來(lái)十年內(nèi)，可能有3000萬(wàn)人發(fā)生結(jié)核。目前我國(guó)傳染性結(jié)核患病率為157. 8/10萬(wàn)，據(jù)估算，全國(guó)現(xiàn)有傳染性肺結(jié)核患者200萬(wàn)人，西部12 個(gè)省、市、自治區(qū)的病情尤其嚴(yán)重，在西部地區(qū)傳染性肺結(jié)核患病率高達(dá)197人/10萬(wàn)人，且呈蔓延趨勢(shì)，現(xiàn)已有傳染性肺結(jié)核病人65萬(wàn)人?？刂平Y(jié)核病的重點(diǎn)是監(jiān)控痰涂片陽(yáng)性結(jié)核病患者，使發(fā)病患者及早得到治療。對(duì)結(jié)核菌感染者進(jìn)行早期監(jiān)控和治療防止發(fā)病。目前診斷結(jié)核的方法主要有痰涂片結(jié)核菌檢測(cè)、結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD)、結(jié)核桿菌聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和結(jié)核桿菌抗體檢測(cè)等方法。在上述方法中痰涂片方法的特異性最高達(dá)100%，但敏感性低為22.2%。結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)(PPD試驗(yàn))敏感性有所提高，但存在特性差，，易受BCG抗體的影響，而且結(jié)果判定時(shí)間太長(zhǎng)。PCR雖然敏感性高，，但同時(shí)存在特意性差；而且實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備昂貴，對(duì)操作人員和環(huán)境要求高，人為誤差較大。結(jié)核桿菌抗體檢測(cè)的敏感性高達(dá)60-80%，但也同樣存在特異性不高的問(wèn)題。因此，在結(jié)核的診斷中，幾種方法可以相互配合。在上述幾種方法中相比，結(jié)核抗體檢測(cè)方法比較簡(jiǎn)便，快速。有利于結(jié)核早期診斷。目前臨床已經(jīng)應(yīng)用的結(jié)核抗體檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA，但ELISA法，但 ELISA法實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要2-3步，結(jié)果判定需1--2小時(shí)；而且需要專(zhuān)門(mén)實(shí)驗(yàn)設(shè)施和專(zhuān)業(yè)操作人員。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是為了提供一種結(jié)核金標(biāo)快速檢測(cè)試劑，該試劑具有高度的種特異性和高靈敏度，而且速度快、操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專(zhuān)門(mén)設(shè)施。本發(fā)明的另一目的是為了提供一種結(jié)核金標(biāo)快速檢測(cè)試劑的制備方法，該方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性、、重復(fù)性好。本發(fā)明的主要目的可通過(guò)如下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)一種結(jié)核金標(biāo)快速檢測(cè)試劑的制備方法包括金標(biāo)抗體層和檢測(cè)層及具上包被檢測(cè)線和控制線的制備，以及試劑的組裝。所述的金標(biāo)抗體層制備包括1膠體金的制備，在濃度為0. 01-0. 03%的濾金酸中加入其體積的1. 2-1. 8%、濃度為的檸檬酸三鈉，煮沸10-20分鐘，還原成15-50納米的膠體金原子液；ii結(jié)核抗原的制備，取結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株TBRV株培養(yǎng)物溶于生理鹽水離心分離得沉淀物，再將沉淀物溶于生理鹽水后再離心分離，如此反復(fù)洗滌4-8次除去培養(yǎng)基成份； 然后將沉淀物超聲粉碎12-15次，每次30秒，將粉碎物經(jīng)3. 8-4. 5萬(wàn)g高速離心，取上清液過(guò)凝膠層析住，收集結(jié)核抗原活性峰；iii結(jié)核抗原膠體金標(biāo)記，在IOOml膠體金溶液中加入2-10mg上述ii制備的結(jié)核抗原；再在上述膠體金溶液中按0. 1-0. 6g/100m 1加入動(dòng)物血清蛋白；然后又在上述膠體金溶液中按6-12ml加入10%的鹽液；最后離心去沉淀，取上清再離心得沉淀物，將沉淀物按4-10ml溶于0. 02M、PH7. 4Tris_HCl含0. 1-0. 6%動(dòng)物血清白蛋白、0. 02%的疊氮鈉得結(jié)核抗原膠體金溶液；iv將結(jié)核抗原膠體金溶液浸著玻璃纖維或無(wú)紡布，浸入量以浸入液體開(kāi)始向外流出為止，然后在37°C下干燥得金標(biāo)抗體層。所述的凝膠層析住選自S印hardexGlOO、S印hardexG200、S印harclySlOO、 SepharclyS200> SepharclyS300 中的一種。所述的檢測(cè)層的制備，在制備的結(jié)核抗原兔、羊抗結(jié)核桿菌抗體中加入固定劑，然后噴膜機(jī)將結(jié)核抗原和兔、羊抗結(jié)核桿菌抗體噴在纖維素膜上形成檢測(cè)線；再用 0. 01MPH7. OPBS液含10%小牛血清封閉30分鐘漂洗、干燥得檢測(cè)層。所述的固定劑選自甲醛、丙酮中的一樣。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下有點(diǎn)1、本發(fā)明的結(jié)核金標(biāo)快速檢測(cè)試劑采用一步法，具有高度的特異性和高靈敏度， 其檢測(cè)快速，結(jié)果判定在3-15分鐘內(nèi)完成，無(wú)需專(zhuān)門(mén)試驗(yàn)設(shè)施、實(shí)驗(yàn)條件和專(zhuān)門(mén)的操作人員，適合結(jié)核感染人群的初篩和流行病學(xué)調(diào)查。2、本發(fā)明的檢測(cè)試劑的制備方法豬油制作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性，重復(fù)性好。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合抗體金標(biāo)快速檢測(cè)試劑，包括襯板(1)和保護(hù)層O)；其特征在于在襯板 ⑴的兩端分別設(shè)有手持端吸水層⑶和測(cè)試端吸水層⑶；在手持端吸水層⑶和測(cè)試端吸水層⑶之間的襯板⑴上設(shè)有檢測(cè)層⑷；在測(cè)試端吸水層⑶與檢測(cè)層⑷之間設(shè)有結(jié)合抗原金標(biāo)抗體層(7)；在檢測(cè)層(4)上設(shè)有檢測(cè)線(5)和控制線(6)。
2.—種權(quán)利要求1所述的結(jié)合抗體金標(biāo)快速檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于包括金標(biāo)抗體層(7)和檢測(cè)層(4)及其上包被檢測(cè)線( 和控制線(6)的制備，以及測(cè)試條的組裝。
3.如權(quán)利要求2所述的結(jié)核抗體金標(biāo)快速檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于所述的金標(biāo)抗體層(7)的制備包括1膠體金的制備，采用公知方法制備膠體金；ii結(jié)合抗原的制備，取結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株TBRV株培養(yǎng)物溶于生理鹽水離心分離得沉淀物，再將沉淀物溶于生理鹽水后再離心分離，如此反復(fù)洗滌4-8次除去培養(yǎng)基成份；然后將沉淀物超聲粉碎，將粉碎物經(jīng)高速離心，取上清液過(guò)凝膠層析住，手機(jī)結(jié)核抗原活性峰；iii結(jié)核抗原膠體金標(biāo)記， 在IOOml膠體金溶液中加入2-10mg上述ii制備的結(jié)核抗原；再加上述膠體金溶液中按 0. 1-0. 6g/100ml加入動(dòng)物血清白蛋白；然后又在上述膠體金溶液中按6_12ml/100ml加入濃度為10%的眼液最后離心去沉淀，取上清再離心得沉淀物，將沉淀物按4-10ml/100ml 溶于0. 02MH、PH7. 4Tris-HCl (PBS)含0. 1_0. 6%動(dòng)物血清白蛋白、0. 02%的疊氮鈉得結(jié)核抗原膠體金溶液；iv將結(jié)核抗原膠體金溶液浸著玻璃纖維或無(wú)紡布，，浸入量以浸入液體開(kāi)始向外流出為止，，然后在37°C下干燥得金標(biāo)抗體層(7)
4.如權(quán)利要求2或3所述的結(jié)核抗體金標(biāo)快速檢測(cè)試劑，其特征在于所述的凝膠層析住選自 SephardexG 100>SephardexG200>SepharcIyS 100>SepharclyS200>SepharclyS300 中的一種
5.如權(quán)利要求2所述的結(jié)核抗體金標(biāo)快速檢測(cè)試劑，其特征在于所述的檢測(cè)層(4)的制備，在制備的結(jié)核抗原和兔、羊抗結(jié)核桿菌抗體中加入固定劑，然后噴膜機(jī)將結(jié)核抗原和兔、羊抗結(jié)核桿菌抗體噴在纖維素膜上形成檢測(cè)線( 和控制線(6)；再用0.01MPH7.0PBS 液含10%小牛血清封閉30分鐘漂洗、干燥得檢測(cè)層(4)。
6.如權(quán)力要求2或5所述的結(jié)核抗體金標(biāo)快速檢測(cè)試劑，其特征在于所述的固定劑選自甲醛、丙酮中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)核抗體金標(biāo)快速檢測(cè)試劑，包括襯板和保護(hù)層；在襯板的兩端分別粘貼有由濾紙制成的手持端吸水層和測(cè)試端吸水層；在手持端吸水層和測(cè)試端吸水層之間的襯板上設(shè)有纖維素膜制成的檢測(cè)層；在測(cè)試端吸水層與檢測(cè)層之間設(shè)有金標(biāo)抗體層；在檢測(cè)層上設(shè)有檢測(cè)線和控制線；其中檢測(cè)層上包被有結(jié)核抗原和兔、羊抗結(jié)核桿菌形成的檢測(cè)線和控制線；在其金標(biāo)抗體層上由玻璃纖維或無(wú)紡布上浸有膠體金標(biāo)記的結(jié)核抗原；本發(fā)明測(cè)試條具有高度的種特異性和高靈敏度，而且速度快、操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專(zhuān)門(mén)設(shè)施；其制備方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性、重復(fù)性好。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102331496SQ20101022426
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者陳潔 申請(qǐng)人:陳潔