明首次為我國(guó)抗磺酰脲類除草劑油菜選育提供了 PCR分子標(biāo)記，并成功獲 得應(yīng)用。
[0032] 本發(fā)明首次為我國(guó)抗磺酰脲類除草劑油菜選育提供了 PCR分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記 不是與抗磺酰脲類除草劑BnALS3R連鎖的分子標(biāo)記，而是根據(jù)基因的核苷酸突變特性設(shè)計(jì) 的功能性基因標(biāo)記，能直接反映植株的抗性，不存在由于遺傳交換而造成的錯(cuò)誤鑒定。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1一實(shí)施例1中M342和5個(gè)敏感性油菜及它們各自雜交的F1代植株抗性基因 分子標(biāo)記鑒定圖
[0034] 其中泳道1-5 :抗磺酰脲類除草劑油菜M342的5個(gè)單株P(guān)CR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物， 含分子量為766bp的條帶；泳道6-10 :分別為5個(gè)敏感性油菜N131、N221、N340、N341和寧 油16號(hào)的PCR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為570bp、196bp的條帶；泳道11-15 :M342分 別與5個(gè)敏感性油菜N131、N221、N340、N341和寧油16號(hào)雜交的F1植株P(guān)CR擴(kuò)增后的酶 切產(chǎn)物，含分子量為766bp、570bp、196bp的條帶；M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，片段從小到大依次為 250bp、500bp、750bp、lOOObp。
[0035] 圖2-實(shí)施例1中引物對(duì)SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2擴(kuò)增的油菜乙酰乳酸合酶 III基因的PCR產(chǎn)物序列比對(duì)圖
[0036] 其中Z11524為Genbank登錄的油菜乙酰乳酸合酶I基因的部分核酸序列 (Genbank登錄號(hào)：Z11524) ;Z11526為Genbank登錄的油菜乙酰乳酸合酶IIII基因的部分 核酸序列（Genbank登錄號(hào)：Z11526) ;N131為野生型N131的乙酰乳酸合酶III基因核酸部 分序列；N221為敏感性油菜N221的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；N340為敏感性 油菜N340的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；N341為敏感性油菜N341的乙酰乳酸合 酶III基因核酸部分序列；Ningyou20為敏感性油菜寧油20號(hào)的乙酰乳酸合酶III基因核 酸部分序列；M342XN131為抗性油菜M342與野生型N131雜交F1的乙酰乳酸合酶III基 因核酸部分序列；M342XN221為抗性油菜M342與敏感性油菜N221雜交F1的乙酰乳酸合 酶III基因核酸部分序列；M342XN340為抗性油菜M342與敏感性油菜N340雜交F1的乙 酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；M342XN341為抗性油菜M342與敏感性油菜N341雜交 F1的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；M342XNingyou20為抗性油菜M342與敏感性油 菜Ningyou20雜交F1的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；M342為抗性油菜M342的乙 酰乳酸合酶III基因核酸部分序列。表示野生型乙酰乳酸合酶III基因與抗性突變基 因BnALS3R的單核苷酸差異（G/T)，N表示雜交F1的乙酰乳酸合酶III基因的G/T雜合型。
[0037] 圖3-實(shí)施例2中分子標(biāo)記BsrDI-ALS3R對(duì)F2(M342XN221)群體中抗性基因 BnALS3R的基因型檢測(cè)圖
[0038] 其中泳道1 :抗磺酰脲類除草劑油菜M342的PCR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為 766bp的條帶；泳道2 :敏感性油菜N221的PCR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為570bp、196bp 的條帶；泳道3 :M342與敏感性油菜N221雜交的F1植株P(guān)CR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子 量為766bp、570bp、196bp的條帶；泳道4-8 :F2群體中含有抗性基因BnALS3R的純合型單 株P(guān)CR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為766bp的條帶；泳道9-18 :F2群體中含有抗性基因 BnALS3R的雜合型單株P(guān)CR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為766bp、570bp、196bp的條帶；泳 道9-18 :F2群體中不含有抗性基因BnALS3R的純合型單株P(guān)CR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子 量為570bp、196bp的條帶；M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，片段從小到大依次為250bp、500bp、750bp、 1000bp〇
[0039] 圖4一實(shí)施例2中分子標(biāo)記BsrDI-ALS3R對(duì)BC1[(M342XN221) XM342]群體中抗 性基因BnALS3R的基因型檢測(cè)圖
[0040] 其中泳道1 :抗磺酰脲類除草劑油菜M342的PCR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為 766bp的條帶；泳道2 :敏感性油菜N221的PCR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為570bp、196bp 的條帶；泳道3 :M342與敏感性油菜N221雜交的F1植株P(guān)CR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量 為766bp、570bp、196bp的條帶；泳道4-13 :BC1群體中含有抗性基因BnALS3R的純合型單 株P(guān)CR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為766bp的條帶；泳道14-23 :BC1群體中含有抗性基因 BnALS3R的雜合型單株P(guān)CR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為766bp、570bp、196bp的條帶；M : DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，片段從小到大依次為250bp、500bp、750bp、1000bp。
[0041] 圖5-實(shí)施例2中分子標(biāo)記BsrDI-ALS3R對(duì)BC2[(M342XN221) XN221]群體中抗 性基因BnALS3R的基因型檢測(cè)圖
[0042] 其中泳道1 :抗磺酰脲類除草劑油菜M342的PCR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為 766bp的條帶；泳道2 :敏感性油菜N221的PCR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為570bp、196bp 的條帶；泳道3 :M342與敏感性油菜N221雜交的F1植株P(guān)CR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量 為766匕口、57(^、196匕口的條帶；泳道4-13 12群體中含有抗性基因81^1^31?的雜合型單株 ?〇?擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為766匕口、57(^、196匕口的條帶；泳道14-23觀2群體中不 含有抗性基因BnALS3R的純合型單株P(guān)CR擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物，含分子量為570bp、196bp的 條帶；M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，片段從小到大依次為250bp、500bp、750bp、1000bp。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例中的所有實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō) 明，均為常規(guī)方法，具體實(shí)施步驟如下：
[0044] 實(shí)施例1檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)過(guò)程
[0045] (1)檢測(cè)油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的AS-PCR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)
[0046] 甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R是從EMS誘變的突變體M342 (見(jiàn)浦惠 明等，專利申請(qǐng)?zhí)?01310054645. 9)中克隆獲得。與野生型N131的乙酰乳酸合酶III基因 相比，突變體BnALS3基因發(fā)生1處單堿基突變，即起始密碼子第一個(gè)核苷酸下游的+1667 處鳥(niǎo)嘌呤核苷酸（G)突變成了胸腺嘧啶核苷酸（T)(胡茂龍等，ZL201310111739. 5, 一種甘 藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因及其應(yīng)用），可以基于該位點(diǎn)的單堿基變異開(kāi)發(fā)相關(guān)分子 標(biāo)記檢測(cè)抗性基因BnALS3R。
[0047] 首先，我們根據(jù)前期開(kāi)發(fā)檢測(cè)抗咪唑啉酮類除草劑基因BnALSIR的經(jīng)驗(yàn)（胡茂龍 等，ZL201210291068. 0, 一種檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗咪唑啉酮類除草劑基因的分子標(biāo)記方法）， 擬根據(jù)突變體BnALS3基因發(fā)生的SNP差異，開(kāi)發(fā)抗性基因位點(diǎn)的等位基因特異PCR標(biāo)記 (allele-specific PCR，AS-PCR)，以期快速、準(zhǔn)確檢測(cè)抗性基因 BnALS3R。
[0048] 表1設(shè)計(jì)用于檢測(cè)抗性基因的AP-PCR標(biāo)記引物序列（加粗表示突變堿基，斜體加 粗表示錯(cuò)配堿基）
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因勺引物，其核甘酸序列為： SEQIDNO. 1 :5'-GTTTGCGAGCAGGGCTAAGA-3' SEQIDNO. 2 :5'-GACATCCAACAGGTACGGTCCA-3'。
2. 權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記引物用于檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因 的方法，其特征在于，包括以下步驟： 以待測(cè)甘藍(lán)型油菜總DNA為模板，用權(quán)利要求1所述引物的核甘酸序列SEQIDNo. 1 和SEQIDNo. 2進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶消化；將消 化的酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)： 如果電泳檢測(cè)表明的酶切產(chǎn)物含有分子量為766bp-種條帶時(shí)，則為含抗磺酰脲類除 草劑基因勺純合型抗性油菜； 如果電泳檢測(cè)表明的酶切產(chǎn)物含有分子量為766bp、570bp和196bp三種條帶時(shí)，則 為含抗性基因雜合型抗性油菜； 如果電泳檢測(cè)表明的酶切產(chǎn)物含有分子量為570bp、196bp兩種條帶時(shí)，則為不含抗磺 酰脲類除草劑基因及的純合型敏感性油菜。
3. 權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記引物在輔助選擇選育抗除草劑品種中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，用權(quán)利要求1所述引物的核甘酸序列 SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2對(duì)以恢復(fù)系為母本、以含甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因 及勺品種為父本進(jìn)行雜交的Fl單株自交獲得的F2群體中的植株進(jìn)行抗性基因PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，將含有分子量為766bp條帶的可育單株套袋自交，自交后代即為獲得的含有抗 磺酰脲類除草劑基因純合型的含甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因勺F3 種子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，在含有分子量為766bp條帶的可育單株套 袋自交后代中選擇可育的單株套袋自交，自交后代即育出抗磺酰脲類除草劑的MICMS恢 復(fù)系。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，以普通油菜為母本、抗磺酰脲類除草劑 油菜為父本雜交獲得Fl，然后以普通油菜為輪回親本，在每次回交世代前，采用本發(fā)明的分 子標(biāo)記BsrDI-ALS3R進(jìn)行基因型檢測(cè)，將含分子量為766bp、570bp和196bp三種條帶的抗 性基因雜合型單株與輪回親本回交，通過(guò)多次回交，在最后一代自交的群體中用權(quán)利要求1 所述引物的核甘酸序列SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2對(duì)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基 因行分子標(biāo)記輔助基因型檢測(cè)，選擇含分子量為766bp條帶的抗性基因純合型 單株即培育出抗除草劑油菜。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的引物與應(yīng)用，屬于分子育種領(lǐng)域。引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2用于檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的方法為:以甘藍(lán)型油菜總DNA作為模板，加入引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶BsrDI消化；酶切產(chǎn)物用來(lái)區(qū)分含抗性基因BnALS3R的純合型油菜、含抗性基因BnALS3R的雜合型油菜和不含抗性基因BnALS3R的純合型油菜。本發(fā)明能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)油菜植株是否含有抗性基因BnALS3R，更精確檢測(cè)所含除草劑基因是純合型還是雜合型，從而快速有效地實(shí)現(xiàn)培育抗除草劑油菜新品種的育種目標(biāo)。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開(kāi)號(hào)】CN104789682
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510213846
【發(fā)明人】胡茂龍, 浦惠明, 龍衛(wèi)華, 高建芹, 張潔夫, 陳松, 陳鋒, 付三雄, 周曉嬰, 張維, 彭琦, 王曉東, 戚存扣
【申請(qǐng)人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月29日