一種檢測(cè)荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)動(dòng)物胃微生物的方法，特別是一種檢測(cè)荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing)又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)(〃Next_generat1n〃sequencing technology)，以能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長(zhǎng)較短等為標(biāo)志。
[0003]根據(jù)發(fā)展歷史、影響力、測(cè)序原理和技術(shù)不同等，主要有以下幾種:大規(guī)模平行簽名測(cè)序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(PolonySequencing)、454 焦磷酸測(cè)序(454pyrosequencing)、Illumina(Solexa) sequencing、ABISOLiD sequencing、離子半導(dǎo)體測(cè)序(1n semiconductor sequencing)、DNA 納米球測(cè)序(DNA nanoball sequencing)等。第一、第二代測(cè)序技術(shù)測(cè)序時(shí)間長(zhǎng)，測(cè)量結(jié)果不夠精確，測(cè)序通量較低，操作較為復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是要提供一種快速、全面的檢測(cè)荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法，幫助人們了解荷斯坦奶牛瘤胃中的微生物種類和數(shù)量，尤其是對(duì)不可培養(yǎng)的瘤胃微生物有了較全面的認(rèn)識(shí)。
[0005]本發(fā)明是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:提取荷斯坦奶牛瘤胃液，抽提其中的微生物DNA通過(guò)測(cè)序確定其微生物種類及相對(duì)數(shù)量；按如下操作步驟制備:
[0006](I)基因組DNA抽提:提取荷斯坦奶牛瘤胃液然后進(jìn)行微生物DNA組的提取純化，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA ;
[0007](2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增:按指定測(cè)序區(qū)域，合成帶有條形碼的特異引物；將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用基因組DNA小量試劑盒凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，三氨基甲烷洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)；全部樣品按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)；
[0008](3)熒光定量:參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用熒光計(jì)藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合；
[0009](4)高通量測(cè)序平臺(tái)文庫(kù)構(gòu)建，按以下步驟進(jìn)行:
[0010]①連接“Y”字形接頭；
[0011]②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；
[0012]③利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；
[0013]④氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段；
[0014](5)高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，按以下步驟進(jìn)行:
[0015]①DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；
[0016]②另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋(bridge)”；
[0017]③聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；
[0018]④DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈；
[0019]⑤加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸，每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基；生成“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”；
[0020]⑥用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；
[0021]⑦將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3’端粘性即非平末端，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸；
[0022]⑧統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列；
[0023](6)生物信息分析高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序得到的首尾讀長(zhǎng)首先根據(jù)重疊部分關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，區(qū)分樣品后進(jìn)行波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換器聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換器可以進(jìn)行物種多樣性指數(shù)分析，基于波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換器聚類分析結(jié)果，可以對(duì)波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換器進(jìn)行物種多樣性指數(shù)分析，以及對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè)；基于分類學(xué)信息，可以在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析；
[0024](7)測(cè)序結(jié)果:確定荷斯坦奶牛瘤胃所有微生物的種類相對(duì)數(shù)量。
[0025]有益效果，由于采用了上述方案，結(jié)果能夠快速，全面，高效的檢測(cè)荷斯坦奶牛瘤胃微生物的種類及數(shù)量，以便人們對(duì)其瘤胃微生物種類及數(shù)量的分析，研宄瘤胃微生物對(duì)其攝取營(yíng)養(yǎng)的吸收消化機(jī)制。解決了測(cè)序時(shí)間長(zhǎng)，效率低，結(jié)果精確度低，測(cè)序結(jié)果不全面等問(wèn)題達(dá)到了本發(fā)明的目的。
[0026]優(yōu)點(diǎn):該方法能夠減少檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)結(jié)果精確全面，能夠準(zhǔn)確測(cè)出荷斯坦奶牛瘤胃中所有微生物的種類及相對(duì)數(shù)量。
【附圖說(shuō)明】
:
[0027]圖1是本發(fā)明的制備方法流程圖。
[0028]圖2是本發(fā)明的六頭荷斯坦奶牛瘤胃屬水平下的微生物的種類及相對(duì)數(shù)量圖。
[0029]圖3是六頭荷斯坦奶牛瘤胃目水平下的微生物的種類及相對(duì)數(shù)量圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述
[0031]實(shí)施例1:本發(fā)明的方法為:提取荷斯坦奶牛瘤胃液，抽提其中的微生物DNA通過(guò)測(cè)序確定其微生物種類及相對(duì)數(shù)量；按如下操作步驟制備:
[0032](I)基因組DNA抽提:提取荷斯坦奶牛瘤胃液然后進(jìn)行微生物DNA組的提取純化，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA ;
[0033](2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):按指定測(cè)序區(qū)域，合成帶有條形碼的特異引物；將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用基因組DNA小量試劑盒凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，三氨基甲烷洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)；全部樣品按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)；所述的條形碼英文表達(dá)barcode ;所述的基因組DNA小量試劑盒英文表達(dá)AxyPr印DNA ;所述的三氨基甲烷英文表達(dá)TrisJlCl ;所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)英文表達(dá) PCR ；
[0034](3)熒光定量:參照電泳初步定量結(jié)果，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物用熒光計(jì)藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合；所述的熒光計(jì)的型號(hào)為TBS-380，英文表達(dá)QuantiFluor?-ST ；
[0035](4)高通量測(cè)序平臺(tái)文庫(kù)構(gòu)建，按以下步驟進(jìn)行:
[0036]①連接“Y”字形接頭；
[0037]②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；
[0038]③利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；
[0039]