小麥染色體組中無芒山羊草染色體的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小麥染色體組中無芒山羊草染色體的鑒定方法，屬于細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 山羊草屬包含23個(gè)物種，其中，11個(gè)為二倍體，其余12個(gè)為多倍體。該屬物種 的基本基因組包括C、D、U、S、M、N和T?；蚪MT僅出現(xiàn)在二倍體物種中，其余基因組 則均同時(shí)出現(xiàn)在在二倍體和多倍體物種中。該屬物種被植物分類學(xué)家分成6個(gè)不同的亞 5^ ：Polyeides、Comopyrum、Cylindropyrum、Sitopsis、Vertebrata熱Amblyopyrum。M 后一個(gè)亞類僅包含無芒山羊草d. 也作皿-個(gè)物種，說 明該物種的獨(dú)特性。無芒山羊草的獨(dú)特性不僅僅是因?yàn)槠洫?dú)特的灌漿期小穗特點(diǎn)（〇hta S, Saruhashi Y. Geographical distribution of B chromosomes inAegilopsmutica Boiss., a wild relative of wheat. Hereditas 1999, 130: 177-183)，更重要的是因 為其基因組是T，而其細(xì)胞質(zhì)具有T和T2兩種不同類型（Kimber G, Tsunewaki K. Genome symbols and plasma types in the wheat group. Proc. 7th Int. Wheat Genet Symp, Cambridge, 1988，1209-1211)。細(xì)胞質(zhì)T可以使植株生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，而細(xì)胞質(zhì)T2則可以 弓|起雄性不育（Maan SS. Cytoplasmic homology betweenAegilopsmuticaBoiss. and Ae.ovateL.Euphytica, 1977, 26:601-613) 〇
[0003] 從上個(gè)世紀(jì)開始，已經(jīng)有少數(shù)幾個(gè)科學(xué)家開始了將無芒山羊草染色體轉(zhuǎn)移給小麥 創(chuàng)制出小麥-無芒山羊草中間材料的研宄（Dover GA, Riley R. Prevention of pairing of hommlogms meiotic chromosomes of wheat by an activity of supernumerary chromosomes ofAegilops.Nature, 1972, 240: 159-161 ；Panayotov I, Tsujimoto H. Fertility restoration and NOR suppression caused byAegilopsmuticachromosomes in alloplasmic hybrids and lines. Euphytica, 1997, 94: 145-149)，獲得了幾份雜交 后代種質(zhì)資源。英國(guó)John Innes Centre的Miller教授課題組也開展了類似工作，獲得了 10多份小麥-無芒山羊草漸滲系(未發(fā)表資料)。上述研宄僅從植株形態(tài)學(xué)或分子生物學(xué)水 平上對(duì)獲得的種質(zhì)進(jìn)行了粗略鑒定。近年來，我們也開展了將無芒山羊草種質(zhì)抗小麥白粉 病轉(zhuǎn)移給小麥中國(guó)春和綿陽(yáng)11的研宄，獲得了一批抗小麥白粉病的小麥-無芒山羊草新種 質(zhì)，并建立了無芒山羊草染色體的候選分子標(biāo)記(劉成，宮文萍，楊足君，李根英，黃承彥，趙 振東.2014.免疫小麥白粉病的小麥-無芒山羊草中間材料的鑒定.第五屆全國(guó)小麥基 因組學(xué)及分子育種大會(huì)P139)，然而。少數(shù)幾個(gè)分子標(biāo)記遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足小麥染色體組中無 芒山羊草染色體的導(dǎo)入數(shù)量及狀態(tài)，而細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)方法可以彌補(bǔ)上述不足，因此，建立 可以鑒定小麥染色體組中無芒山羊草染色體的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)記對(duì)已經(jīng)獲得的群體材料進(jìn) 行精確鑒定，進(jìn)而將其優(yōu)異基因轉(zhuǎn)移給小麥進(jìn)行小麥育種工作至關(guān)重要。
[0004] 物種染色體C帶、染色體核型和原位雜交帶型等均是細(xì)胞遺傳學(xué)的重要研宄內(nèi) 容。無芒山羊草染色體標(biāo)準(zhǔn)C帶的建立（Friebe B, Badaeva ED, Kammer K, GILL BS. Standard karyotypes ofAegilops uniaristata, Ae. mutica, Ae. comosasubspeciescomosaand heldreichii (Poaceae).PI. Syst. Evol. 1996,202:199-210)，使得鑒定小 麥背景中的無芒山羊草成為可能。然而，利用C分帶技術(shù)獲得的無芒山羊草染色體C帶帶 紋非常微弱，因此，在使用上對(duì)該技術(shù)操作要求較高，不易被普遍使用。迄今為止，除無芒山 羊草染色體C分帶外，目前尚未見其它細(xì)胞遺傳標(biāo)記建立方面的報(bào)道。
[0005] 基因組原位雜交（Genomic in situ hybridization, GISH)可用于小麥背景中 外源物種染色體的鑒定工作，但是，該方法涉及外源物種基因組DNA的提取和打斷，封阻 DNA的制備、二者配比條件摸索等步驟，操作步驟繁瑣，操作中還經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)打碎的外源物 種DNA和封阻DNA長(zhǎng)度偏長(zhǎng)或偏短現(xiàn)象(長(zhǎng)度不合適不能用于GISH)，而且很難保證每次 獲得的打碎DNA片段長(zhǎng)度完全一致，因此，相比以多聚核苷酸為探針進(jìn)行的熒光原位雜交 (Fluorescence in situ hybridization, FISH)具有明顯劣勢(shì)，后者具有探針合成容易、無 需封阻DNA、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、熒光信號(hào)清晰可見等優(yōu)點(diǎn)，但是，該方法目前并沒有被用 于小麥背景中無芒山羊草染色體的鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是獲得無芒山羊草細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)記，提供一種小麥染色體組中無芒 山羊草染色體的鑒定方法。
[0007] 技術(shù)方案 一種小麥染色體組中無芒山羊草染色體的鑒定方法， (1) 以小麥_無芒山羊草創(chuàng)新種質(zhì)為材料，制備其染色體標(biāo)本；以多聚核苷酸 01ig〇-pTa535-l和01ig〇-pScll9. 2-1為探針對(duì)染色體標(biāo)本進(jìn)行雙色熒光原位雜交，獲得 雙色FISH圖；將01ig〇-pTa535-l和01ig〇-pScll9. 2-1的信號(hào)洗脫后，再以（GAA)8為探針 對(duì)同一染色體標(biāo)本進(jìn)行單色熒光原位雜交，獲得單色FISH圖；將雙色FISH圖與小麥42條 染色體雙色FISH標(biāo)準(zhǔn)圖比較，找出無芒山羊草的14條染色體；再根據(jù)單色FISH圖，對(duì)無芒 山羊草的14條染色體進(jìn)行區(qū)分配對(duì)；進(jìn)而獲得染色體核型信息； (2) 以多聚核苷酸01ig〇-pTa535-l和01ig〇-pScll9. 2-1為探針對(duì)待測(cè)小麥-無芒山 羊草雜交后代的染色體進(jìn)行雙色熒光原位雜交，獲得雙色FISH圖；將01ig〇-pTa535-l和 01ig〇-pScll9.2-l的信號(hào)洗脫后，再對(duì)同一染色體標(biāo)本以（GAA) 8S探針進(jìn)行單色熒光原 位雜交，獲得單色FISH圖；將本步驟獲得的雙色FISH圖和單色FISH圖分別與步驟（1)的 雙色FISH圖和單色FISH圖比對(duì)，鑒定小麥-無芒山羊草雜交后代的染色體； 或者， (3) 以多聚核苷酸01ig〇-pTa535-l和01ig〇-pScll9. 2-1為探針對(duì)待測(cè)小麥-無芒山 羊草雜交后代的染色體進(jìn)行雙色熒光原位雜交，獲得雙色FISH圖；獲得核型信息；將本步 驟獲得的雙色FISH圖和核型信息分別與步驟（1)的雙色FISH圖和核型信息比對(duì)，鑒定小 麥-無芒山羊草雜交后代的染色體； 其中， 01igo-pScll9. 2-1序列： CCGTTTTGTGGACTATTACTCACCGCTTTGGGGTCCCATAGCTAT，如SEQ ID NO. 1所示；01igo-pTa535_l序列： AAAAACTTGACGCACGTCACGTACAAATTGGACAAACTCTTTCGGAGTATCAGGGTTTC，如 SEQ ID NO. 2 所示； (GAA)8 序列：GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA，如 SEQ ID NO. 3 所示； 所述小麥-無芒山羊草創(chuàng)新種質(zhì)，是由小麥與無芒山羊草雜交獲得雜種h，再由雜種匕 經(jīng)加倍獲得的材料。
[0008] 所述小麥-無芒山羊草交后代，是指小麥-無芒山羊草創(chuàng)新種質(zhì)與小麥的雜交回 交后代。
[0009] 所述小麥42條染色體的FISH標(biāo)準(zhǔn)圖，是以多聚核苷酸01 ig〇-pTa535-l和 01ig〇-pScll9. 2-1為探針對(duì)小麥染色體進(jìn)行雙色熒光原位雜交后獲得的。
[0010] 小麥與無芒山羊草雜交獲得雜種Fi，雜種匕經(jīng)加倍獲得小麥-無芒山羊草創(chuàng)新種 質(zhì)（XX001)。本發(fā)明首先以01ig〇-pTa535-l和01ig〇-pScll9. 2-1為探針對(duì)XX001進(jìn)行雙 色熒光原位雜交，獲得雙色FISH圖；與小麥42條染色體的FISH標(biāo)準(zhǔn)圖進(jìn)行比對(duì)、分析，發(fā) 現(xiàn)：XX001中的20對(duì)小麥染色體的雜交信號(hào)各不相同（小麥的1對(duì)7B染色體丟失)，與14條 無芒山羊草染色體不同。因此，根據(jù)以01ig〇 -pTa535-l和01ig〇-pScll9. 2-1為探針進(jìn)行 的雙色FISH，可以有效識(shí)別小麥染色體組中的無芒山羊草染色體。但是，XX001中的14條 無芒山羊草染色體的雜交信號(hào)并不是7組不同的雜交信號(hào)，而是僅包含三組不同的雜交信 號(hào)。因?yàn)殡p色FISH在無芒山羊草上的信號(hào)具有類似性，因而，僅憑雙色FISH無法將無芒山 羊草的14條染色體進(jìn)行有效配對(duì)、區(qū)分。
[0011] 為了解決該問題，本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步分析研宄。將以01ig〇-pTa535-l和 01ig〇-pScll9. 2-1為探針對(duì)XX001進(jìn)行雙色FISH后的染色體標(biāo)本的01ig〇-pTa535-l和 01ig〇-pScll9.2-l的信號(hào)洗脫后，再以（GAA) 8S探針進(jìn)行單色熒光原位雜交，獲得單色 FISH圖。由于單色FISH與雙色FISH在同一細(xì)胞染色體上進(jìn)行，所以，將單色FISH圖與雙 色FISH圖進(jìn)行比對(duì)，可以直接獲得無芒山羊草的14條染色體的（GAA) 8雜交信息。（GAA) 8 雜交信號(hào)顯示，14條無芒山羊草染色體雜交信號(hào)可分為7類，即可以將14條無芒山羊草染 色體進(jìn)行配對(duì)為7對(duì)(隨機(jī)按照T1-I7編號(hào))。所以，將單色FISH圖與雙色FISH結(jié)合，可以 一次性區(qū)分所有小麥染色體以及無芒山羊草染色體。
[0012] 另外，物種染色體核型可以用于其染色體的識(shí)別與鑒定。由于六倍體小麥染色 體有21對(duì)，部分染色體臂比和無芒山羊草臂比差異不大，因而，僅用無芒山羊草核型信 息無法對(duì)小麥染色體組中的無芒山羊草染色體進(jìn)行