檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的引物與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子育種領(lǐng)域，確切地說，涉及一種檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草 劑基因BnALS3R的引物與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著我國(guó)工業(yè)化和城市化進(jìn)程加快，農(nóng)村勞動(dòng)力大量向城鎮(zhèn)轉(zhuǎn)移，輕簡(jiǎn) 化、機(jī)械化已成為油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方向。有效治理田間雜草是實(shí)現(xiàn)油菜輕簡(jiǎn)化、機(jī)械 化的重要技術(shù)環(huán)節(jié)?；瘜W(xué)除草是當(dāng)前農(nóng)田控制雜草的主要手段。然而，當(dāng)前油菜生產(chǎn)上應(yīng) 用的除草劑僅能有效防治單子葉雜草，對(duì)大多數(shù)雙子葉類的闊葉雜草缺少安全、高效的除 草劑進(jìn)行防除，油菜生產(chǎn)化學(xué)除草面積非常有限。而磺酰脲類除草劑能高效防除雙子葉類 闊葉雜草，具有低用量、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，在我國(guó)水稻、小麥、玉米等單子葉作物中廣泛應(yīng) 用。遺憾的是，油菜為雙子葉作物，對(duì)磺酰脲類除草劑表現(xiàn)敏感，生產(chǎn)上還未開發(fā)出對(duì)油菜 安全、高效的磺酰脲類除草劑，創(chuàng)制對(duì)磺酰脲類除草劑具有選擇抗性的油菜新種質(zhì)，拓寬現(xiàn) 有磺酰脲類除草劑的應(yīng)用范圍，是解決油菜田雜草防除的一個(gè)經(jīng)濟(jì)有效途徑。
[0003] 磺酰脲類除草劑是一類高效、低毒的除草劑，屬于乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS ;EC4. 1. 3. 18)抑制劑類除草劑，其作用靶標(biāo)為植物體內(nèi)的ALS。 ALS 也叫乙酰羥基酸合酶（acetohydroxyacid synthase，AHAS ;EC2. 2. 1. 6)，是 植物和微生物3種支鏈氨基酸生物合成過程中的關(guān)鍵酶（McCourt JA, Duggleby RG. AminoAcids，2006, 31:173 - 210)。該酶負(fù)責(zé)催化兩個(gè)平行反應(yīng)，催化兩分子丙酮酸縮 合形成2-乙酰乳酸放出C02，最終生成纈氨酸和亮氨酸，催化一分子丙酮酸和一分子2-氧 丁酸縮合形成乙酰羥基丁酸，最終生成異亮氨酸（Ronald G D，et al.，PlantPhysiolBi och，2008, 46:309-324)。如果此酶的活力受到抑制或者喪失，會(huì)導(dǎo)致植物纈氨酸、亮氨酸 和異亮氨酸合成受阻，影響蛋白質(zhì)合成，最終導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受阻、直至死亡。磺酰脲類除 草劑作用機(jī)理是除草劑通過與ALS形成復(fù)合物阻斷底物進(jìn)入酶活性位點(diǎn)通路，抑制ALS 活性，導(dǎo)致支鏈氨基酸合成受阻，使植物組織失綠、黃化，最后逐漸死亡（McCourt JA，et al. , PNAS, 2006, 103:569-573) 〇
[0004] 隨著研宄的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)某些特定氨基酸殘基突變能引起ALS對(duì)磺酰脲 類除草劑產(chǎn)生抗性，其中常見易發(fā)生變異的氨基酸殘基是Pr〇197、Ala205和Trp574(參 照擬南芥 ALS 位置；Walter K L，et al.，Pest ManagSci, 2014, 70 (12): 1831-1839; Ghio C，et al.，TheorAppl Genet, 2013, 126(12) :2957-2968;胡茂龍等，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012,45(20):4326-4334)。例如，在中國(guó)甜菜的sur和萵苣的1個(gè)突變體中197位脯氨酸 被組氨酸或絲氨酸所取代；向日葵的Two突變體中205位丙氨酸被纈氨酸所取代；玉米的 XA17 中 574 位色氨酸被亮氨酸所取代（Tan S, et al.，PestManagSci, 2005, 61:246-257)。 通過進(jìn)一步研宄發(fā)現(xiàn)，當(dāng)擬南芥ALS與磺酰脲類除草劑相互作用時(shí)，除草劑結(jié)合在擬南 芥ALS催化位點(diǎn)的活性空腔里，當(dāng)活性空腔內(nèi)的氨基酸殘基發(fā)生突變時(shí)，會(huì)引起除草 劑與ALS結(jié)合方式的變化，導(dǎo)致植物產(chǎn)生對(duì)磺酰脲類除草劑的抗性（Lee H，et al.，PN AS, 2011, 108(21) :8909-8913) 〇
[0005] 2013年，利用EMS誘變和定向選育技術(shù)，我們獲得了甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草 劑突變體M342(公知公用，浦惠明等，專利申請(qǐng)?zhí)?01310054645. 9)。在苯磺隆除草劑雜草 防治的推薦使用濃度下，抗性突變體M342噴藥后無任何藥害癥狀，仍能正常生長(zhǎng)。進(jìn)一步 通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆獲得了抗性突變體M342抗性基因BnALS3R(胡茂龍等，一種甘藍(lán) 型油菜抗磺酰脲類除草劑基因及其應(yīng)用；中國(guó)專利ZL201310111739.5)?？剐曰虻陌l(fā)現(xiàn) 為我國(guó)抗磺酰脲類除草劑油菜品種的培育提供了自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的種質(zhì)資源。利用該抗性種 質(zhì)資源，常規(guī)育種方法是將含BnALS3R基因的M342與生產(chǎn)上推廣的主栽品種進(jìn)行雜交和回 交，然后在每個(gè)分離后代中噴施除草劑進(jìn)行鑒定，最終選擇含抗磺酰脲基因BnALS3R的抗 性單株。在每個(gè)分離后代除草劑鑒定過程中，如果除草劑劑量使用不當(dāng)或噴施不均勻極易 導(dǎo)致誤選。另外，有時(shí)在抗除草劑基因研宄過程中需要保存不抗的材料，用作比較研宄。為 此，若能根據(jù)該基因BnALS3R的突變位點(diǎn)特性，開發(fā)出檢測(cè)抗性基因的功能性標(biāo)記，從而進(jìn) 行標(biāo)記輔助選擇，區(qū)分出育種材料中抗性基因的不同基因型，則可指導(dǎo)田間選育，加快育種 進(jìn)程，為標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行油菜抗除草劑新品種選育提供選擇方法和技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 技術(shù)問題
[0007] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除 草劑基因BnALS3R的分子標(biāo)記引物。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因 BnALS3R分子標(biāo)記引物的應(yīng)用方法。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0011] 一種檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的分子標(biāo)記引物，其核甘酸 序列為：
[0012] SEQ ID NO. 1 :5'-GTTTGCGAGCAGGGCTAAGA-3'
[0013] SEQ ID NO. 2 :5'-GACATCCAACAGGTACGGTCCA-3'
[0014] 所述的分子標(biāo)記引物用于檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的方 法，其特征在于，包括以下步驟：
[0015] 以待測(cè)甘藍(lán)型油菜總DNA為模板，用權(quán)利要求1所述引物的核甘酸序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶BsrDI消化； 將消化的酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)：
[0016] 如果電泳檢測(cè)表明的酶切產(chǎn)物含有分子量為766bp -種條帶時(shí)，則為含抗磺酰脲 類除草劑基因BnALS3R的純合型抗性油菜；
[0017] 如果電泳檢測(cè)表明的酶切產(chǎn)物含有分子量為766bp、570bp和196bp三種條帶時(shí)， 則為含抗性基因BnALS3R雜合型抗性油菜；
[0018] 如果電泳檢測(cè)表明的酶切產(chǎn)物含有分子量為570bp、196bp兩種條帶時(shí)，則為不含 抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的純合型敏感性油菜。
[0019] 所述的分子標(biāo)記引物在輔助選擇選育抗除草劑甘藍(lán)型油菜品種中的應(yīng)用。
[0020] 所述的應(yīng)用，其特征在于，用所述引物的核甘酸序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 對(duì)以恢復(fù)系為母本、以含甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的品種為父本進(jìn)行 雜交的F1單株自交獲得的F2群體中的植株進(jìn)行抗性基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)，將含有分子量 為766bp條帶的可育單株套袋自交，自交后代即為獲得的含有抗磺酰脲類除草劑基因 BnALS3R純合型的含甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的F3種子；在含有分子量 為766bp條帶的可育單株套袋自交后代中選擇可育的單株套袋自交，自交后代即育出抗磺 酰脲類除草劑的MI CMS恢復(fù)系。
[0021] 所述的應(yīng)用，還可以以抗磺酰脲類除草劑油菜為父本，普通油菜為母本雜交獲得 F1，然后以普通油菜為輪回親本，在每次回交世代前，采用本發(fā)明的分子標(biāo)記BsrDI-ALS3R 進(jìn)行基因型檢測(cè)，將含分子量為766bp、570bp和196bp三種條帶的抗性基因雜合型單株與 輪回親本回交，通過多次回交，在最后一代自交的群體中用權(quán)利要求1所述引物的核甘酸 序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2對(duì)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R進(jìn)行分子 標(biāo)記輔助基因型檢測(cè)，選擇含分子量為766bp條帶的抗性基因純合型單株即培育出抗除草 劑油菜。
[0022] 有益效果
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0024] 1、本發(fā)明找到一種檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的CAPS分子 標(biāo)記方法，克服了甘藍(lán)型油菜基因組復(fù)雜、在四倍體油菜中應(yīng)用分子標(biāo)記難度很大的問題。
[0025] 本發(fā)明開展了大量的檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的AS-PCR 分子標(biāo)記、ARMS-PCR分子標(biāo)記、CAPS分子標(biāo)記的開發(fā)研宄，摸索試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)敏感性油菜的 乙酰乳酸合酶III基因正義鏈起始密碼子第一個(gè)核甘酸下游的+1662至+1667位點(diǎn)，該位 點(diǎn)的6個(gè)核甘酸序列為"GCAATG"，能夠被限制性核酸內(nèi)切酶BsrDI酶識(shí)別并剪切，而抗磺酰 脲類除草劑基因BnALS3R在+1662至+1667的對(duì)應(yīng)序列為"GCAATT"，不能被限制性核酸內(nèi) 切酶BsrD I酶識(shí)別并剪切，從而克服了甘藍(lán)型油菜為白菜型油菜（A基因組）和甘藍(lán)（C基 因組）天然雜交自然加倍而來的異源四倍體（2n = 38)，基因組相對(duì)復(fù)雜，二倍體研發(fā)的分 子標(biāo)記在四倍體油菜的應(yīng)用難度很大的問題，找到一種檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑 基因BnALS3R的CAPS分子標(biāo)記方法，
[0026] 2、本發(fā)明提供的分子標(biāo)記檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、容易判斷。
[0027] 本發(fā)明的分子標(biāo)記位于敏感性油菜的乙酰乳酸合酶III基因正義鏈起始密碼子 第一個(gè)核甘酸下游的+1662至+1667位點(diǎn)，該位點(diǎn)的6個(gè)核甘酸序列為"GCAATG"，能夠被限 制性核酸內(nèi)切酶BsrDI酶識(shí)別并剪切，而抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R在+1662至+1667 的對(duì)應(yīng)序列為"GCAATT"，不能被限制性核酸內(nèi)切酶BsrD I酶識(shí)別并剪切。由此，可以開發(fā) 一個(gè)能夠檢測(cè)甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R的CAPS分子標(biāo)記BsrDI-ALS3R。
[0028] 該分子標(biāo)記是一個(gè)共顯性標(biāo)記，操作者僅需要通過簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段 (PCR擴(kuò)增和酶切反應(yīng)）就能對(duì)不同抗性基因型進(jìn)行鑒定，快速、準(zhǔn)確的區(qū)分出抗磺酰脲類 除草劑基因BnALS3R的純合型、雜合型和不抗除草劑的敏感型油菜植株。
[0029] 3、本發(fā)明提供的分子標(biāo)記檢測(cè)方法能有效用于抗磺酰脲類除草劑基因BnALS3R 引起的油菜對(duì)磺酰脲類除草劑抗性的標(biāo)記輔助選擇育種。
[0030] 常規(guī)育種方法是利用含BnALS3R基因的抗性油菜M342與生產(chǎn)上推廣的主栽品種 進(jìn)行雜交和回交，然后在每個(gè)分離后代中噴施除草劑進(jìn)行鑒定，最終選擇含抗磺酰脲類除 草劑BnALS3R的抗性單株。在每個(gè)分離后代除草劑鑒定過程中，如果除草劑劑量使用不當(dāng) 或噴施不均勻極易可能導(dǎo)致誤選或所需要的材料死亡。另外，有時(shí)在抗除草劑基因研宄過 程中需要保存不抗的材料，用作比較研宄。因此，利用與BnALS3R基因直接相關(guān)的PCR分子 標(biāo)記對(duì)植株DNA進(jìn)行檢測(cè)，可以在油菜任何時(shí)期鑒定出抗性基因純合基因型單株以及優(yōu)良 性狀的不抗單株，淘汰其它單株，這樣不僅可以節(jié)約田間育種成本，而且可以大大提高抗除 草劑油菜品種的選擇進(jìn)程。
[0031] 4、本發(fā)