用于診治癌轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及用于診治癌轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物及其用 途，更具體的涉及rnir-1185-l和/或其成熟miRNA在診治肺腺癌轉(zhuǎn)移中的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 在我國(guó)由于肺癌所致的死亡占全部腫瘤相關(guān)死亡的23 %左右，大約90%的惡 性腫瘤的死亡與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，絕大多數(shù)肺癌患者由于腫瘤細(xì)胞的局部侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn) 移，確診時(shí)己經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，深入了解參與肺癌侵襲及轉(zhuǎn)移的因子及可能的機(jī) 制，對(duì)于肺癌的早期干預(yù)及個(gè)體化治療提供指導(dǎo)，以期能改善肺癌的預(yù)后。肺腺癌（lung adenocarcinoma)屬于非小細(xì)胞肺癌，易發(fā)生于女性及不抽煙者。在肺部的位置常較周邊， 腫瘤擴(kuò)大的速度較慢（倍增時(shí)間約120天）。早期無(wú)征兆，通常診斷出來(lái)時(shí)已經(jīng)是晚期。非 小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的75% -80%。
[0003] miRNA通常由RNA聚合酶II (Pol II)轉(zhuǎn)錄生成。Pol II結(jié)合在以后形成發(fā)夾結(jié) 構(gòu)的頸環(huán)DNA序列附近。生成的轉(zhuǎn)錄本經(jīng)修飾添加5'帽子結(jié)構(gòu)和3'末端多腺苷酸尾巴結(jié) 構(gòu)，并剪切，生成的產(chǎn)物稱為初級(jí)miRNA (pri-miRNA)，該產(chǎn)物可能長(zhǎng)達(dá)數(shù)千或數(shù)百核苷酸， 可能包含多個(gè)miRNA環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0004] 單個(gè)pri-miRNA可能含一到六個(gè)miRNA前體。這些發(fā)夾結(jié)構(gòu)每個(gè)由約70nt左右的 核苷酸組成。每個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)附以部分序列以利于有效剪切處理。pri-miRNA中的雙鏈發(fā)夾 RNA 結(jié)構(gòu)被叫做 DGCR8 的核蛋白（DiGeorge Syndrome Critical Region 8)辨認(rèn)，DGCR8 同 Drosha酶一起形成微處理（microprocessor)復(fù)合體。在該復(fù)合體中，DGCR8組織Drosha 蛋白的RNase III結(jié)構(gòu)域使其在距離發(fā)卡結(jié)構(gòu)約11個(gè)核苷酸處切割pri-miRNA，使其釋放 發(fā)卡結(jié)構(gòu)。釋放的發(fā)卡結(jié)構(gòu)即為前miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA在3'存在兩個(gè)懸空的核 苷酸，pre-miRNA 5'為磷酸集團(tuán)，3'為羥基集團(tuán)。
[0005] 在胞漿中，pre-miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)經(jīng)RNase III Dicer切割處理。這種內(nèi)源性核糖 核酸酶（endoribonuclease)與發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3'相互作用并在環(huán)的3'和5'臂上完成切割， 產(chǎn)生長(zhǎng)約22nt并不完美匹配的miRNA :miRNA*雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0006] miRNA與靶mRNA的典型作用方式主要有兩種。在大多數(shù)情況下，復(fù)合物中的單 鏈miRNA與靶mRNA的3' UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)，阻斷靶基因的翻譯，從而調(diào)芐基因表達(dá)。這 種方式主要影響蛋白表達(dá)水平，并不影響mRNA的穩(wěn)定性。近來(lái)，有研宄對(duì)翻譯抑制理論提 出質(zhì)疑，發(fā)現(xiàn)被抑制的革G mRNAs和miRNAs共同聚集于胞衆(zhòng)中被稱為P小體（processing bodies，P_bodies)的區(qū)域，這個(gè)區(qū)域還濃縮了許多參與mRNA降解的酶類。P小體可能是作 為未翻譯mRNA進(jìn)行暫時(shí)的可逆儲(chǔ)存的容器，減少一些特定P小體組成蛋白的表達(dá)能夠緩和 miRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制作用。P小體是胞漿中的一定區(qū)域，它包含參與多種轉(zhuǎn)錄后過(guò)程 的蛋白質(zhì)，例如：mRNA 降解（mRNA degradation)、無(wú)義介導(dǎo) mRNA 衰退（nonsense-mediated mRNA decay, NMD)，轉(zhuǎn)錄抑制及 RNA 介導(dǎo)的基因沉默（RNA-mediated gene silencing)。
[0007] 另一種作用方式與siRNA類似，當(dāng)miRNA與mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，Ago2蛋白通過(guò) 切割mRNA直接導(dǎo)致其降解，實(shí)現(xiàn)基因沉默。以siRNA參與的RNAi為例：siRNA可與RISC結(jié) 合，作為模板識(shí)別mRNA靶子，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，mRNA與siRNA中的反義鏈結(jié)合，置換 出正義鏈。雙鏈mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下產(chǎn)生22nt左右的siRNA，siRNA 繼續(xù)同RISC形成復(fù)合體，與siRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，使mRNA被RNA酶裂解。這個(gè)過(guò)程也 稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS)。
[0008] 總之，當(dāng)前認(rèn)為miRNA以何種方式與目的基因作用和miRNA與目的基因的配對(duì)程 度有關(guān)。miRNA與目的基因配對(duì)不完全時(shí)，miRNA就以抑制目的基因的表達(dá)發(fā)揮作用；miRNA 與目的基因某段序列配對(duì)完全時(shí)，就可能引起目的基因在互補(bǔ)區(qū)斷裂而導(dǎo)致基因沉默。另 外，miRNAs有時(shí)候也導(dǎo)致組氨酸修飾和啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化，從而影響靶基因的表達(dá)。除 此外，近來(lái)發(fā)現(xiàn)快速脫腺苷酸化（accelerated deadenylation)是miRNA抑制基因表達(dá)的 新機(jī)制。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-125b和let-7能夠促進(jìn)mRNA聚腺苷酸尾巴（polyA tail)的去除。用3'組蛋白莖-環(huán)結(jié)構(gòu)取代聚腺苷酸尾巴，不但可以消除miR-125b對(duì)mRNA 含量的影響，還可以降低對(duì)蛋白質(zhì)合成的作用，可見(jiàn)miRNA能通過(guò)降低翻譯效率和聚腺苷 酸化mRNA的濃度來(lái)抑制基因表達(dá)。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)肺腺癌患者進(jìn)行回顧性分析，將其分成兩組：肺腺癌轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn) 移組，通過(guò)Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析，獲得miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)而進(jìn)行生物信息學(xué)分析， 選取后備miRNA進(jìn)行分子生物學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的miRNA和肺腺癌轉(zhuǎn)移密切相 關(guān)，可用于臨床診斷及預(yù)防檢測(cè)，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供rnir-1185-1和/或其成熟miRNA在制備預(yù)防、診斷和/或 治療肺腺癌轉(zhuǎn)移試劑中的應(yīng)用。mir-1185-l的序列見(jiàn)序列表SEQ ID N0 1。mir-1185-l的 成熟miRNA為miR-1185其序列見(jiàn)序列表SEQ ID NO 2。
[0011] 進(jìn)一步，所述的預(yù)防、診斷肺腺癌轉(zhuǎn)移試劑包括基于高通量測(cè)序方法和/或基于 定量PCR方法和/或基于探針雜交方法檢測(cè)肺腺癌樣本中mir-1185-1和/或miR-1185的 轉(zhuǎn)錄或基于免疫檢測(cè)方法檢測(cè)肺腺癌樣本中miR-1185調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況，優(yōu)選采 用northern雜交方法、miRNA表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球 的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺腺癌樣本中mir-1185-1和/或miR-1185的轉(zhuǎn)錄；采用ELISA和/或 膠體金試紙條檢測(cè)肺腺癌樣本中miR-1185調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。更優(yōu)選的，miR-1185 調(diào)控的靶基因?yàn)锳K3、MMRN1和SLC46A3。
[0012] 優(yōu)選的，所述的基于定量PCR方法包括特異性擴(kuò)增mir-1185-1和/或miR-1185的 引物；所述的基于探針雜交方法包括與mir-1185-1和/或miR-1185的核酸序列雜交的探 針；所述免疫檢測(cè)方法包括與miR-1185調(diào)控基因表達(dá)蛋白特異性結(jié)合的抗體。更優(yōu)選的， miR-1185 調(diào)控的靶基因?yàn)?AK3、MMRN1 和 SLC46A3。
[0013] 進(jìn)一步，所述的治療肺腺癌轉(zhuǎn)移試劑包括抑制劑和/或抑制劑組合物下調(diào) mir-1185-1和/或miR-1185的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷miR-1185的活性。
[0014]優(yōu)選的，采用反義寡核苷酸、antagomiRs、miRNA 海綿、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀點(diǎn)反義寡核苷酸的方法下調(diào)mir-1185-1和/或miR-1185的轉(zhuǎn)錄和/ 或阻斷miR-1185的活性。
[0015] 本發(fā)明的目的還在于提供一種抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于，所述抑制肺腺 癌轉(zhuǎn)移試劑包含：
[0016] (a)抑制劑和/或抑制劑組合物，所述的抑制劑和/或抑制劑組合物下調(diào) mir-1185-l和/或miR-1185的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷miR-1185的活性；
[0017] (b)藥劑學(xué)上能接受的載體。
[0018]優(yōu)選的，采用反義寡核苷酸、antagomiRs、miRNA 海綿、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀點(diǎn)反義寡核苷酸的方法下調(diào)mir-1185-1和/或miR-1185的轉(zhuǎn)錄和/ 或阻斷m