本發(fā)明屬于分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及一種蒙古扁桃特異性微衛(wèi)星位點(diǎn)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蒙古扁桃(amygdalusmongolica)隸屬于薔薇科桃屬，,為國(guó)家三級(jí)瀕危保護(hù)植物，屬于蒙古高原的古老殘遺種。主要生長(zhǎng)在荒漠及荒漠草原區(qū)的低山丘陵地、石質(zhì)坡地及干河床等生境條件較為嚴(yán)酷的地區(qū)。隨著蒙古扁桃的生境島嶼化,分布區(qū)面積不斷縮小,導(dǎo)致其瀕臨滅絕的原因主要為人類采礦、燒柴、土地開發(fā)、工業(yè)化及城市化等活動(dòng)對(duì)其生境的嚴(yán)重干擾和破壞，蒙古扁桃的分布范圍和種群數(shù)量都在減少。
微衛(wèi)星(microsatellite)也稱為ssr(simplesequencerepeats)，是由1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物基因組中。由于其有數(shù)量多、特異的pcr擴(kuò)增、穩(wěn)定性好、在基因組內(nèi)分布均勻、多態(tài)性信息豐富、易于檢測(cè)等特性等諸多優(yōu)點(diǎn)成為近年來(lái)應(yīng)用廣泛的分子標(biāo)記之一。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種蒙古扁桃特異性微衛(wèi)星位點(diǎn)，包括tr10339、tr10936、tr12298、tr12728、tr16484、tr17663、tr17745、tr18640、tr18807、tr20374、tr21328、tr21918、tr23600、tr24122、tr3320、tr27527、tr29327、tr31156、tr31399、tr37605、tr37811、tr41171和tr47552核苷酸序列的一種或幾種，所述核苷酸序列如seqidno1～seqidno23所示序列。
本發(fā)明還提供了上述蒙古扁桃微衛(wèi)星位點(diǎn)的特異性引物對(duì)，所述蒙古扁桃特異性微衛(wèi)星位點(diǎn)的特異性引物對(duì)的核苷酸序列分別為：
tr10339的引物對(duì)序列如seqidno.24和seqidno.25所示；
tr10936的引物對(duì)序列如seqidno.26和seqidno.27所示；
tr12298的引物對(duì)序列如seqidno.28和seqidno.29所示；
tr12728的引物對(duì)序列如seqidno.30和seqidno.31所示；
tr16484的引物對(duì)序列如seqidno.32和seqidno.33所示；
tr17663的引物對(duì)序列如seqidno.34和seqidno.35所示；
tr17745的引物對(duì)序列如seqidno.36和seqidno.37所示；
tr18640的引物對(duì)序列如seqidno.38和seqidno.39所示；
tr18807的引物對(duì)序列如seqidno.40和seqidno.41所示；
tr20374的引物對(duì)序列如seqidno.42和seqidno.43所示；
tr21328的引物對(duì)序列如seqidno.44和seqidno.45所示；
tr21918的引物對(duì)序列如seqidno.46和seqidno.47所示；
tr23600的引物對(duì)序列如seqidno.48和seqidno.49所示；
tr24122的引物對(duì)序列如seqidno.50和seqidno.51所示；
tr3320的引物對(duì)序列如seqidno.52和seqidno.53所示；
tr27527的引物對(duì)序列如seqidno.54和seqidno.55所示；
tr29327的引物對(duì)序列如seqidno.56和seqidno.57所示；
tr31156的引物對(duì)序列如seqidno.58和seqidno.59所示；
tr31399的引物對(duì)序列如seqidno.60和seqidno.61所示；
tr37605的引物對(duì)序列如seqidno.62和seqidno.63所示；
tr37811的引物對(duì)序列如seqidno.64和seqidno.65所示；
tr41171的引物對(duì)序列如seqidno.66和seqidno.67所示；
tr47552的引物對(duì)序列如seqidno.68和seqidno.69所示。
本發(fā)明還提供了用于鑒定蒙古扁桃微衛(wèi)星位點(diǎn)的試劑盒，包括dna聚合酶、dntps、反應(yīng)緩沖液、引物對(duì)與dna模板，其中，所述引物對(duì)為以下引物對(duì)的一種或幾種：
tr10339的引物對(duì)序列如seqidno.24和seqidno.25所示；
tr10936的引物對(duì)序列如seqidno.26和seqidno.27所示；
tr12298的引物對(duì)序列如seqidno.28和seqidno.29所示；
tr12728的引物對(duì)序列如seqidno.30和seqidno.31所示；
tr16484的引物對(duì)序列如seqidno.32和seqidno.33所示；
tr17663的引物對(duì)序列如seqidno.34和seqidno.35所示；
tr17745的引物對(duì)序列如seqidno.36和seqidno.37所示；
tr18640的引物對(duì)序列如seqidno.38和seqidno.39所示；
tr18807的引物對(duì)序列如seqidno.40和seqidno.41所示；
tr20374的引物對(duì)序列如seqidno.42和seqidno.43所示；
tr21328的引物對(duì)序列如seqidno.44和seqidno.45所示；
tr21918的引物對(duì)序列如seqidno.46和seqidno.47所示；
tr23600的引物對(duì)序列如seqidno.48和seqidno.49所示；
tr24122的引物對(duì)序列如seqidno.50和seqidno.51所示；
tr3320的引物對(duì)序列如seqidno.52和seqidno.53所示；
tr27527的引物對(duì)序列如seqidno.54和seqidno.55所示；
tr29327的引物對(duì)序列如seqidno.56和seqidno.57所示；
tr31156的引物對(duì)序列如seqidno.58和seqidno.59所示；
tr31399的引物對(duì)序列如seqidno.60和seqidno.61所示；
tr37605的引物對(duì)序列如seqidno.62和seqidno.63所示；
tr37811的引物對(duì)序列如seqidno.64和seqidno.65所示；
tr41171的引物對(duì)序列如seqidno.66和seqidno.67所示；
tr47552的引物對(duì)序列如seqidno.68和seqidno.69所示。
優(yōu)選地，本發(fā)明用于鑒定蒙古扁桃微衛(wèi)星位點(diǎn)的試劑盒，包括2×easytaqpcrsupermix、引物對(duì)、dna模板以及超純水；更優(yōu)選地，本發(fā)明用于鑒定蒙古扁桃微衛(wèi)星位點(diǎn)的試劑盒中，包括50-100ngdna模板,7.5ul2×easytaqpcrsupermix(transgenbiotech)，10μm引物對(duì)各0.5ul，使用超純水補(bǔ)齊至15ul；更優(yōu)選地，所述試劑盒的pcr條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，適宜退火溫度下退火30sec，72℃延伸30sec，反應(yīng)32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；其中，所述適宜的退火溫度為50℃～61℃；最優(yōu)選地，所述適宜的退火溫度為50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃。
優(yōu)選的，所述蒙古扁桃的鑒定包括以下步驟：以前述試劑盒對(duì)待測(cè)樣品的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與微衛(wèi)星序列進(jìn)行對(duì)比：若含有上述技術(shù)方案所述的至少一種微衛(wèi)星分子標(biāo)記，則判定所述待測(cè)樣品為蒙古扁桃；若不含有上述技術(shù)方案所述的任意一種微衛(wèi)星分子標(biāo)記，則判定所述待測(cè)樣品不是蒙古扁桃。
本發(fā)明的再一方面為提供上述蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點(diǎn)及其特異性引物對(duì)的篩選方法，包括以下步驟：
1)收集蒙古扁桃樣品并提取dna；
2)對(duì)步驟1)獲得的dna，構(gòu)建rna-seqcdna文庫(kù)，并對(duì)所述rna-seqcdna文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序；
3)檢測(cè)微衛(wèi)星位點(diǎn)并設(shè)計(jì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物對(duì)；
4)篩選并檢測(cè)微衛(wèi)星位點(diǎn)及其特異性引物對(duì)。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點(diǎn)及其特異性引物對(duì)的篩選方法中，所述步驟1)中提取dna步驟為ctab法；
優(yōu)選地，在本發(fā)明的蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點(diǎn)及其特異性引物對(duì)的篩選方法中，所述步驟2)中rna-seqcdna文庫(kù)的高通量測(cè)序使用luminahiseq3000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序；
優(yōu)選地，在本發(fā)明的蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點(diǎn)及其特異性引物對(duì)的篩選方法中，所述步驟3)中采用batchprimer3在線分析工具對(duì)所述步驟2)組裝完成的序列檢測(cè)微衛(wèi)星位點(diǎn)序列并在微衛(wèi)星位點(diǎn)的側(cè)翼序列上進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；更優(yōu)選地，所述微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)的條件為重復(fù)單元為2個(gè)堿基時(shí)，重復(fù)次數(shù)需大于等于6；重復(fù)單元為3個(gè)堿基時(shí)，重復(fù)次數(shù)需大于等于5；重復(fù)單元為4、5和6個(gè)堿基時(shí)，重復(fù)次數(shù)需大于等于4；更優(yōu)選地，所述微衛(wèi)星位點(diǎn)的特異性引物設(shè)計(jì)的原則為擴(kuò)增目的片段為100～200bp，引物gc含量為40～60％，上下游引物退火溫度(tm)在50～60℃之間且差異小于5℃。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點(diǎn)及其特異性引物對(duì)的篩選方法中，所述步驟4)中篩選所述微衛(wèi)星特異性引物的方法為：使用蒙古扁桃dna對(duì)步驟3)獲得的特異性引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增并檢測(cè)，篩選能夠穩(wěn)定擴(kuò)增出目標(biāo)條帶并具有多態(tài)性的引物對(duì)；
優(yōu)選地，在本發(fā)明的蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點(diǎn)及其特異性引物對(duì)的篩選方法中，所述步驟4)中檢測(cè)所述微衛(wèi)星特異性引物方法為：使用tamara350熒光分子量標(biāo)準(zhǔn)在abi3730dna測(cè)序儀中使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)篩選出來(lái)的引物對(duì)進(jìn)行基因分型；基因分型的結(jié)果使用genmarker軟件進(jìn)行讀取，并輸入excel文件；使用excelmircosatellitetoolkit程序統(tǒng)計(jì)各微衛(wèi)星位點(diǎn)的期望雜合度(expectedheterozygosity,he)、觀測(cè)雜合度(observedheterozygosity，ho)和多態(tài)性信息含量(polymorphicinformationcontent,pic)，以檢測(cè)所述微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性狀況，篩選出上述三個(gè)多態(tài)性數(shù)值均大于0.5作為微衛(wèi)星位點(diǎn)的特異引物對(duì)。
因此，本發(fā)明提供了蒙古扁桃的微衛(wèi)星位點(diǎn)及其特異性引物在藜科駝絨藜屬植株的基因標(biāo)記、定位與qtl分析、品種鑒定、種群及進(jìn)化研究、分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次公開了蒙古扁桃的23條特異性微衛(wèi)星序列及23對(duì)特異性微衛(wèi)星引物。這些位點(diǎn)在對(duì)蒙古扁桃的遺傳多樣性分析、保護(hù)遺傳學(xué)研究、種質(zhì)資源調(diào)查和輔助育種中起到重要作用，也為研究植物抗旱機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)材料。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明中的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1
1、dna抽提
采集32個(gè)蒙古扁桃樣品，采集自內(nèi)蒙古阿拉善左旗。采下后立即使用硅膠保存，采用ctab法進(jìn)行蒙古扁桃基因組dna抽提。
2、建庫(kù)、高通量測(cè)序及組裝
使用illuminatruseqstrandedtotalrnasampleprepkit(晶能生物技術(shù)(上海)有限公司)構(gòu)建蒙古扁桃的標(biāo)準(zhǔn)rna-seqcdna文庫(kù)；采用illuminahiseq3000測(cè)序平臺(tái)的雙端測(cè)序模式對(duì)構(gòu)建的rna-seqcdna文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制分析后的高質(zhì)量序列進(jìn)行樣本組裝。
序列經(jīng)組裝后共得到103923個(gè)轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體，并定義為73225個(gè)原始序列unigene。
3、微衛(wèi)星序列檢測(cè)和引物設(shè)計(jì)
采用batchprimer3在線分析工具對(duì)所述步驟2組裝完成的序列檢測(cè)微衛(wèi)星位點(diǎn)序列并在微衛(wèi)星位點(diǎn)的側(cè)翼序列上進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；所述微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)的條件為重復(fù)單元為2個(gè)堿基時(shí)，重復(fù)次數(shù)需大于等于6；重復(fù)單元為3個(gè)堿基時(shí)，重復(fù)次數(shù)需大于等于5；重復(fù)單元為4、5和6個(gè)堿基時(shí)，重復(fù)次數(shù)需大于等于4；所述微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)的原則為擴(kuò)增目的片段為100～200bp，引物gc含量為40～60％，上下游引物退火溫度(tm)在50～60℃之間且差異小于5℃。
在此條件下，共檢測(cè)到19498個(gè)微衛(wèi)星序列，設(shè)計(jì)到14586對(duì)引物對(duì)。
4、微衛(wèi)星引物的初步篩選
在14586對(duì)設(shè)計(jì)成功的引物對(duì)中選擇50個(gè)引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增條件確定。選擇的原則是：優(yōu)選重復(fù)堿基單元為2或者3(這類微衛(wèi)星多態(tài)性較高)；優(yōu)選重復(fù)序列無(wú)堿基變異、無(wú)插入或者缺失的；優(yōu)選重復(fù)單元數(shù)目大的(但不超過(guò)50個(gè))。
使用8個(gè)蒙古扁桃樣品的dna為模板，對(duì)這50個(gè)引物對(duì)進(jìn)行梯度pcr擴(kuò)增。梯度pcr反應(yīng)體系如下：50-100ngdna模板,7.5ul2×easytaqpcrsupermix(transgenbiotech)，10μm上下游引物各0.5ul，使用超純水補(bǔ)齊至15ul。梯度pcr反應(yīng)循環(huán)設(shè)置如下：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，45～65℃范圍內(nèi)12個(gè)梯度溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應(yīng)32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。本發(fā)明所述12個(gè)梯度優(yōu)選為50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃。
梯度pcr得到的擴(kuò)增產(chǎn)物使用2％的瓊脂糖-eb凝膠電泳檢測(cè)，選取符合以下條件的引物對(duì)作為初步篩選引物對(duì)：(1)擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶；(2)片段大小符合目的片段大小；(3)在8個(gè)個(gè)體中均擴(kuò)增得到一致結(jié)果。記錄符合上述條件時(shí)的pcr退火溫度，記為該引物對(duì)的最適退火溫度。
在此條件下，共得到25個(gè)初篩引物對(duì)。
4、微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)
對(duì)上述初篩引物對(duì)的上游引物5’端加上熒光標(biāo)記(fam/hex/tamra)，并使用32個(gè)蒙古扁桃樣品的dna進(jìn)行擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系為：50-100ngdna模板，7.5ul2×easytaqpcrsupermix(transgenbiotech)，10μm上下游引物各0.5ul，使用超純水補(bǔ)齊至15ul。循環(huán)設(shè)置為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，最適退火溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
擴(kuò)增產(chǎn)物使用tamara350熒光分子量標(biāo)準(zhǔn)在abi3730dna測(cè)序儀中使用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行基因分型?；蚍治龅慕Y(jié)果使用genmarke軟件進(jìn)行讀取，并輸入excel文件。使用excelmircosatellitetoolkit程序計(jì)算期望雜合度(expectedheterozygosity，he)、觀測(cè)雜合度(observedheterozygosity，ho)和多態(tài)性信息含量(polymorphicinformationcontent,pic)，以檢測(cè)所述微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性狀況，選擇上述三個(gè)多態(tài)性數(shù)值均大于0.5的位點(diǎn)。
最終獲得23個(gè)穩(wěn)定的高多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，所述微衛(wèi)星位點(diǎn)命名為tr10339、tr10936、tr12298、tr12728、tr16484、tr17663、tr17745、tr18640、tr18807、tr20374、tr21328、tr21918、tr23600、tr24122、tr3320、tr27527、tr29327、tr31156、tr31399、tr37605、tr37811、tr41171和tr47552；所述tr10339、tr10936、tr12298、tr12728、tr16484、tr17663、tr17745、tr18640、tr18807、tr20374、tr21328、tr21918、tr23600、tr24122、tr3320、tr27527、tr29327、tr31156、tr31399、tr37605、tr37811、tr41171和tr47552的核苷酸序列分別如seqidno1～seqidno23所示序列。
所述微衛(wèi)星位點(diǎn)tr10339、tr10936、tr12298、tr12728、tr16484、tr17663、tr17745、tr18640、tr18807、tr20374、tr21328、tr21918、tr23600、tr24122、tr3320、tr27527、tr29327、tr31156、tr31399、tr37605、tr37811、tr41171和tr47552的特異性引物對(duì)依次為：
tr10339的引物對(duì)序列如seqidno.24和seqidno.25所示；
tr10936的引物對(duì)序列如seqidno.26和seqidno.27所示；
tr12298的引物對(duì)序列如seqidno.28和seqidno.29所示；
tr12728的引物對(duì)序列如seqidno.30和seqidno.31所示；
tr16484的引物對(duì)序列如seqidno.32和seqidno.33所示；
tr17663的引物對(duì)序列如seqidno.34和seqidno.35所示；
tr17745的引物對(duì)序列如seqidno.36和seqidno.37所示；
tr18640的引物對(duì)序列如seqidno.38和seqidno.39所示；
tr18807的引物對(duì)序列如seqidno.40和seqidno.41所示；
tr20374的引物對(duì)序列如seqidno.42和seqidno.43所示；
tr21328的引物對(duì)序列如seqidno.44和seqidno.45所示；
tr21918的引物對(duì)序列如seqidno.46和seqidno.47所示；
tr23600的引物對(duì)序列如seqidno.48和seqidno.49所示；
tr24122的引物對(duì)序列如seqidno.50和seqidno.51所示；
tr3320的引物對(duì)序列如seqidno.52和seqidno.53所示；
tr27527的引物對(duì)序列如seqidno.54和seqidno.55所示；
tr29327的引物對(duì)序列如seqidno.56和seqidno.57所示；
tr31156的引物對(duì)序列如seqidno.58和seqidno.59所示；
tr31399的引物對(duì)序列如seqidno.60和seqidno.61所示；
tr37605的引物對(duì)序列如seqidno.62和seqidno.63所示；
tr37811的引物對(duì)序列如seqidno.64和seqidno.65所示；
tr41171的引物對(duì)序列如seqidno.66和seqidno.67所示；
tr47552的引物對(duì)序列如seqidno.68和seqidno.69所示。
所述微衛(wèi)星位點(diǎn)tr10339、tr10936、tr12298、tr12728、tr16484、tr17663、tr17745、tr18640、tr18807、tr20374、tr21328、tr21918、tr23600、tr24122、tr3320、tr27527、tr29327、tr31156、tr31399、tr37605、tr37811、tr41171和tr47552微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性數(shù)據(jù)見表1。
表1：微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多樣性檢測(cè)結(jié)果
由表1數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明提供的用于鑒定的微衛(wèi)星位點(diǎn)的分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)均大于0.5，均可以用于遺傳多樣性調(diào)查、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、個(gè)體識(shí)別以及親緣關(guān)系鑒定等遺傳學(xué)分析。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表
<110>內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院
<120>一種蒙古扁桃特異性微衛(wèi)星位點(diǎn)及其應(yīng)用
<160>69
<170>patentinversion3.5
<210>1
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<212>dna
<213>蒙古扁桃
<400>1
tcaatttcttcttgttacaggtaggtaggggctgctcaccttctttttgtcaggattctc60
ttgccagtctctaaagtataacaaaaggtgttgcaagcaaacaataaaaacacccccata120
taaccactagaatagaagcaactcaatcagatctttctccatctttttaactcttctctc180
cattgagtcccatagtcataccaaccaattaattaacctctgtagacttccactcctttg240
ctctctctctctctctctctctctctctctctctctctcttcctaaatttcccagatgag300
gacaattatggccg314
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aaagtagaaacgaaggaaaagaaagaaaatgcaaatagaagagagaagcaaactgcgaag60
gcaaacctctgaaaaaccctaaaaccggcgaatgaaaacatcattcacgaagaagaagaa120
aaatggtaaagaagatagagggatgggagtgttggacctcacgcttcgttagcttggtga180
cgtcagcagagaccgccgtcattgtcttgtcacaagaacctaagtgtgtgtgacagagag240
agagagagagagagagagagagagagagagctgttggctgtttggttttggttgttgcag300
agagggagggggggggggggg321
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tttggtcgtcctatgatgtttgagttattgctggtgtatctcattggctcattggctcac60
cttagaatttgcgaacgtttaaatgcatttctgtccattttcttgttcaacatattaatc120
tatatcagcttagcatatatatatctatgcccaatagccaaaaccctctccacagccact180
ccgtcttcttcacccaaaccccttctctctctctctctctctctctctctctctctctca240
gagacagttaagctctgagacggtgctgtgagaaactcggggagacatagagaaatggaa300
ggcaaatcgtaccagaggctaccgcgggtcaaaatccgtgaaatgcgcgacgactacatg360
aagttcgagctccgcgacaccgacgccagcgtcgccaac399
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<400>4
ggatgctattgaaatctaagcccacgtacatcatgagagagagagagagagagagagaga60
gagagagagaattaagaatggaacgtttaatataaattgcttggcctgattcaggaattg120
gtccttgtattagtgaatatacaagaaaaatctgattatgagttaccagggtgttacagc180
actgtacaaccagttgattagcaacaaggcaattagagaccagcatcatcctcctcctca240
ctggtttttgccactggagtttatcctgatgcctgaaaatgttggactgcaaattaagcc300
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tggcgctacaatagactcaacaatt385
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gacggcaagtcttgaggctcaagcatatgcaaaccgggaatactagtaacatcaccacca60
tgatacttcatatagtaaatataattgaccgtgcaggtttgagtaaaaaaggcagcggac120
gctagaccaaactgtttggctacatccagagcccagggcaaaaatggatcatatattatg180
caattaatagggtggggtgagttgctgtactttgtaatgagctcgattagggttctggag240
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atcacttccaatatttcaaaatcatctcctctacctttttccttcatccctctctctctc60
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taacatttacatataaaagcgtcaaacgcaccgtatcaagcagagatcatgaccatggac180
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tgcagatgtccctatgggctgcctctctgagaatttgttggctcccagcctcacatcttc60
ttctttcccttccatttctctgttctctctctctttctctctctctctctctctctctct120
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ga302
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ttgctcatcaaatcagccccctgatattcgtggatgttgaggcggcggagctgttgctgc60
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attgtttaaagctctcaaaccctaaagcaacaactagagagagagacgcacacagcgaga180
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gtccttaagcagcccagtagagcagccctctctctctctctctctctctctctctctctc60
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cttccatccacacttacatgagagagagagagagagagagagagagagagagagagaaag60
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gcttctcttttagggaagagaaaaggctagagaacaacccctttttcttctttttctctc60
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