本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及油菜裂角相關(guān)基因及分子標記及在作物遺傳育種及生理上應(yīng)用。

背景技術(shù)：

油菜是我國重要的油料作物，現(xiàn)階段油菜機收落粒問題嚴重限制著油菜機械化生產(chǎn)水平的提高，提高油菜栽培品種的抗裂角性是現(xiàn)階段重要育種目標之一。運用數(shù)量遺傳學和分子生物學手段，通過抗裂角相關(guān)基因定位和克隆，不僅為油菜抗裂角分子機制的研究提供理論依據(jù)，而且為分子標記輔助選擇培育抗裂角品種奠定堅實基礎(chǔ)。目前在油菜中能被利用的抗裂角基因，主要來自于通過轉(zhuǎn)基因獲得的遺傳改良材料，而相關(guān)的材料在品種的審定和推廣中，因為受到很多法規(guī)限制很難真正應(yīng)用于生產(chǎn)。

油菜和擬南芥同屬十字花科，有相同的進化起源，控制擬南芥角果發(fā)育和開裂的基因研究得非常深入。擬南芥中控制角果開裂的基因主要有與果瓣邊緣層(即離層)發(fā)育有關(guān)的fruitfull(ful)(guetal.1998),shatterproof1(shp1)、shatterproof2(shp2)(liljegrenetal.2000)，indehiscent(ind)(liljegrenetal.2004),alcatraz(alc)(rajanietal.2001),replumless(rpl)(roederetal.2003)。而且各基因間存在復雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制(dinnenyandyanofsky2005)。ful基因是第一個鑒定出與離區(qū)延伸有關(guān)的基因，ful基因作為轉(zhuǎn)錄因子能促進角果皮細胞的分化和延伸，liljegren等(2000)證明shp1，shp2能控制離區(qū)的分化，促進臨近細胞的木質(zhì)化，但這兩類基因同源性較高，而且它們存在功能冗余的活性，即單獨突變的突變體不顯示突變性狀，只有當shp1shp2都突變時，突變體的角果才不開裂。同時ful基因負調(diào)控shp基因在離區(qū)表達，擬南芥的ful基因轉(zhuǎn)化芥菜性油菜能增強角果的抗裂角性(etal.2006)。油菜與擬南芥角果結(jié)構(gòu)雖然相似，但也存在明顯的差異，油菜角果胎坐框突出果瓣并有較長的果喙，而擬南芥角果頂端平滑光禿?；谒麄冎g結(jié)構(gòu)上的差異，對應(yīng)得抗裂角基因機制是否一致值得進一步探索。

近年來，隨著油菜分子生物學的迅速發(fā)展，許多控制裂角的qtl已被定位，但對應(yīng)抗裂角qtl位點下的關(guān)鍵基因及功能分子標記還沒有利用的報道，分析和研究已有角果開裂相關(guān)基因的自然遺傳變異，研究其機理并通過分子生物學手段調(diào)整油菜抗裂角性成為油菜遺傳改良的重要突破口。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供了油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9-r2，其序列為seqidno.2所示。

本發(fā)明的另一個目的在于提供了油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9-r2的indel序列，所述序列為seqidno.3所示。

本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種基于油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9-r2中的indel序列設(shè)計的分子標記引物，利用該引物可對具備抗裂角性狀的油菜進行篩選，有益于油菜的遺傳改良，該引物優(yōu)選為

if4：acttgggacatagcctaatgatg

ir4：tcgtaccactttgatttcagaca。

本發(fā)明還有一個目的在于提供了油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9-r2或油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9中的indel序列在制備抗裂角轉(zhuǎn)基因油菜中的應(yīng)用。

本發(fā)明最后一個目的在于提供了基于油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9-r2中的indel序列設(shè)計的分子標記引物在油菜的遺傳育種中的應(yīng)用。

為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9的獲得：

(1)利用油菜品系r1和r2雜交，雜種f1代通過小孢子培養(yǎng)生成dh分離群體。

(2)利用多態(tài)性引物對dh分離群體進行分子標記分析,獲得基因型數(shù)據(jù)。

(3)把dh分離群體的基因型數(shù)據(jù)輸入joinmap4.0軟件，進行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建；

(4)dh群體的基因型數(shù)據(jù)(僅限于定位到遺傳圖譜上的標記)以及兩年的抗裂角性狀數(shù)據(jù)輸入winqtlcart2.5軟件進行qtl定位，其中，位于a9連鎖群上的兩個相鄰但效應(yīng)相反qtl在dh群體兩年中能重復檢測到，而且效應(yīng)值和貢獻率穩(wěn)定。

利用上述技術(shù)措施，最終獲得了油菜抗裂角指數(shù)(sri)性狀的qtl位點qsri.a9.1，利用winqtlcart2.5軟件分析獲得其對油菜抗裂角指數(shù)的平均貢獻率為11.67％,加性效應(yīng)為-0.07～-0.15。利用常規(guī)pcr及反向pcr的方法，分別獲得bnshp1-a9在r1和r2中的全長序列，本發(fā)明將r1中的bnshp1-a9稱為bnshp1-a9-r1，其序列為seqidno.1所示，將r2中的bnshp1-a9稱為bnshp1-a9-r2，其序列為seqidno.2所示。針對r2中indel標記(引物為if4/ir4)可分別在r1中擴增出247bp，在r2中擴增出270bp的條帶。

一種基于油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9-r2中的indel序列設(shè)計的分子標記引物，只要基于seqidno.3設(shè)計的引物均為本發(fā)明的保護范圍，優(yōu)選的，所述的引物如下：

if4：acttgggacatagcctaatgatg

ir4：tcgtaccactttgatttcagaca。

油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9-r2或油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9-r2中的indel序列在制備抗裂角轉(zhuǎn)基因油菜中的應(yīng)用，因為帶有bnshp1-a9-r2基因的油菜，bnshp1-a9基因表達量相對較低，從而提高油菜角果的抗裂角性。因此可以通過轉(zhuǎn)反義基因或rnai實驗抑制bnshp1-a9基因的表達，也能達到相同的作用。

基于油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9-r2中的indel序列設(shè)計的分子標記引物在油菜的遺傳育種中的應(yīng)用，利用所述的引物，對未知的油菜株系進行篩選，可加快油菜抗裂角株系的篩選進度，有利于油菜育種工作。

本發(fā)明通過實驗研究，發(fā)現(xiàn)了一個影響油菜抗裂角性，但不影響油菜角果其他性狀的qtl位點，進一步開發(fā)了鑒定該位點的基因特異indel引物對。應(yīng)用本發(fā)明的indel位點及引物對可以在油菜早期事先鑒定油菜抗裂角性，而不用等到油菜成熟后通過田間表型鑒定抗裂角性。本發(fā)明indel位點及引物對加快了油菜育種進程，在油菜的選擇育種領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

本發(fā)明首次定位到油菜a09上控制抗裂角的負向效應(yīng)qtl位點，可解釋11.26％～12.07％的表型方差。對應(yīng)bnshp1-a9-r1基因的rnai實驗也進一步證明該基因是負向效應(yīng)，即表達受抑制，抗裂角性增強。在常規(guī)育種方法中，角果抗裂角性鑒定要等到成熟期收獲后室內(nèi)鑒定，費時費力且選擇效率低下(抗裂角性會一定程度受到成熟期的影響)。進一步利用r1和r2基因組上的差異開發(fā)一對indel標記(if4/ir4)，通過基因功能標記檢測角果抗裂角不同qtl位點，可以在苗期進行淘汰，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率。本發(fā)明中抗裂角負效qtl點功能基因位置明確，檢測方法方便快速，不受環(huán)境影響。通過檢測抗裂角性狀功能分子標記，即可預測育種材料的抗裂角性，進而準確快速篩選抗裂角油菜株系。

附圖說明

圖1為一種油菜抗裂角品系r1和不抗品系r2構(gòu)建的dh群體在武漢種植時，2013-2014兩年角果抗裂角系數(shù)(sri)的頻率分布圖。

結(jié)果表明2013年角果抗裂角系數(shù)表型呈偏正態(tài)分布，2014年角果抗裂角系數(shù)表型呈正態(tài)分布且變異范圍很寬，證明角果抗裂角性受數(shù)量性狀控制。

圖2為位于a9連鎖群上的一個抗裂角系數(shù)qtl位點lod曲線示意圖。

上坐標圖中橫坐標代表連鎖群，縱坐標代表lod值。

下坐標圖中橫坐標代表連鎖群，縱坐標代表加性效應(yīng)值。

圖3為r1，r2裂角相關(guān)基因bnshp1-a09基因結(jié)構(gòu)差異。

圖4bnshp1-a9indel標記if4-f/r在dh群體(a)和自然群體(b)中檢測結(jié)果。

圖5為一種油菜r1×r2_dh群體a9連鎖群局部分子標記遺傳連鎖圖譜。

圖6為r1，r2不同發(fā)育時期bnshp1-a09表達量的檢測結(jié)果。

(a)1為花蕾(<0.3cm)，2為花蕾(>0.3cm)，3-5分別為初開的花，盛開的花和凋謝的花，6-8為1cm，1.5cm和2cm的雌蕊，(b)分別為角果發(fā)育10天，16天，18天，20天和22天后bnshp1-a09的表達模式。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。其中r1、r2及dh群體在文獻“王會，桑世飛，梅德圣等.甘藍型油菜dh群體抗裂角性的遺傳分析。中國油料作物學報，2014,36(4):437－442”公開過，公眾可以從中國農(nóng)科院油料作物研究所獲得。

實施例1：油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9的獲得：

一、qsri.a9.1定位與克隆

(一)田間實驗與抗裂角指數(shù)表型測定：

田間試驗分別于2013年至2014年秋季在中國農(nóng)科院油料所陽邏實驗站(武漢)，成熟期考察株系或單株的抗裂角指數(shù)(sri)，鑒定方法參考專利201310226680.4。具體為將油菜角果在80℃烘干30min，室溫封閉保存隔夜后，放入圓柱容器，圓柱容器中放置8個鋼珠；采用型號為hq45z搖床，以280rpm轉(zhuǎn)速對圓柱容器進行震蕩處理，每兩分鐘觀察一次，共觀察5次，每份材料重復3次，利用公式：裂角指數(shù)＝∑xi×(6-i)/角果數(shù)×總次數(shù)計算裂角指數(shù)，xi為第i次破損的角果數(shù)，1≤i≤5，抗裂角指數(shù)＝1-裂角指數(shù)。兩年的抗裂角指數(shù)分布見圖1。

(二)基因型鑒定

r1×r2dh群體及親本，分別在5葉期時取葉片提取dna，并分別標記每個單株，對于dh群體株系，則將具有同一基因型的3個單株進行混合葉片取樣，以小區(qū)號進行標記，在田間迅速冷凍保存。每個樣品dna稀釋到10ng/μl左右，設(shè)計目標區(qū)間引物進行pcr擴增，用聚丙烯酰氨凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳進行基因型鑒定。目標基因組區(qū)域序列信息來源于darmor-bzh全基因組測序數(shù)據(jù)，用ssrhunter掃描目標基因組序列中的ssr位點，再利用primer5.0(www.premier5biosoft.com)設(shè)計引物，開發(fā)多態(tài)性標記，用于目標基因組區(qū)域有利重組單株的篩選。

(三)qtl定位分析

利用windowsqtlcartographer(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/wqtlcart.htm)對dh群體群體進行復合區(qū)間qtl作圖定位分析(1000次permutation，p＝0.05水平)。對qsri-a9.1進行初步的定位分析(圖2)。對qsri-a9.1進行分子標記開發(fā)，用以分子標記輔助育種。

實驗結(jié)論：利用dh群體定位到一個影響油菜抗裂角性qtl，其中負效應(yīng)qtl位點qsri.a9.1(抗裂角性基因來源于r2)，影響抗裂角的qtl的lod值為4.76-4.91，能夠解釋11.26-12.07％的表型變異(表1)。

表1：r1×r2dh群體兩年抗裂角性qtl定位

二、序列分析

根據(jù)精細定位結(jié)果，利用生物信息學手段，最終獲得了bnshp1-a9基因序列，bnshp1-a9基因由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，其中，第2-6個外顯子長度較短，第1個外顯子較長、長度超過800bp(圖3)。利用primer5.0設(shè)計覆蓋整個基因的擴增引物，對親本r2及r1中的兩個bnshp1-a9等位基因擴增并進行序列比對分析，結(jié)果顯示：在基因組水平上，r1及r2存在諸多差異，包括不同長度的插入、缺失及一些snp位點；在mrna水平上，與r2相比，r1存在一個12bp缺失(第7外顯子)及分布于整個mrna上的9個snp位點。

在本發(fā)明中，將r2中的bnshp1-a9基因稱為bnshp1-a9-r2，其序列為seqidno.2所示；將bnshp1-a9在r1中的基因稱為bnshp1-a9-r1，其序列為seqidno.1所示。

表2：bnshp1-a9全長擴增及rt-pcr引物

實施例2：對不同發(fā)育時期的r1與r2角果發(fā)育組織相應(yīng)部位取樣進行bnshp1-a9表達差異分析。

先以不同的花蕾到開花，直到形成角果發(fā)育不同時期，以油菜開花的初期為標準，授粉后角果形成10天后每隔2天取樣，根據(jù)角果發(fā)育時期，每個時期每個材料平行選取角果發(fā)育大小均一致的5株作為5個生物學重復，盡量保證切取的角果含有同樣比例的離區(qū)組織。使用rnapreppureplantkit(tiangen)提取總rna，然后用hiscript^@ii1^ststrandcdnasynthesiskit將rna反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cdna，使用2×estaqmastermix(cwbio)、bio-rads1000^tmthermalcycler儀進行rt-pcr反應(yīng)。rt-pcr引物bnshp1.a9-orf設(shè)計于基因編碼框兩側(cè)，擴增長度為906-908bp，使用actin作為內(nèi)標，基因特異性引物序列及內(nèi)標引物序列參見表2。

如圖6所示結(jié)果：r1和r2在蕾期bnshp1-a09表達量相同，都幾乎沒表達。但r2在花期表達量明顯比r1低很多。在角果形成發(fā)育的10天和16天，表達在兩材料間差異不顯著，角果發(fā)育后期的18，20和22天三個時期的r1及r2表達量值差異及顯著，p值分別為0.669，0.290及0.337，即兩材料在花發(fā)育后角果形成18天后該基因的表達量差異顯著，在r1中隨著角果的發(fā)育該基因表達量緩慢減少，但r2中到18天后，該基因基本停止表達，因此抗裂角性的差異主要受目標基因的表達量變化導致。

實施例3：油菜bnshp1-a9-r1抑制表達載體的構(gòu)建及在油菜中的轉(zhuǎn)化

根據(jù)r1材料的bnshp1-a9編碼區(qū)序列，設(shè)計引物擴增部分編碼區(qū)片段(143bp)引物序列為：ttcttttcggtggtttattc和tgacgatttgttgtgttctct。將其反向連接到topo載體上并重組到pearleygate100中。將載體轉(zhuǎn)化到lba4404中準備轉(zhuǎn)化油菜。

油菜的農(nóng)桿菌lba4404轉(zhuǎn)化

a.無菌苗的準備：種子經(jīng)70％乙醇1min，氯化汞(hgcl2)浸泡13-15min，ddh2o洗5次后，平鋪于ms培養(yǎng)基(ph5.8)中，瓊脂濃度0.8％。油菜無菌苗備用。

b.油菜子葉柄轉(zhuǎn)化：接種根癌農(nóng)桿菌lba4404于固體培養(yǎng)基lb上，兩天后挑取單菌落于50mlyep液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g+酵母提取物10g+nacl5g+mgso40.5g)中培養(yǎng)。取4-5天無菌苗子葉柄，于菌液中浸泡5-8min，其間輕搖，而后倒去菌液，以無菌濾紙吸去外植體上殘留菌液。置于共培養(yǎng)基(ms+0.2mg/l6-芐基腺嘌呤(6-ba)+1mg/l2，4-二氯苯氧乙酸(2、4-d)+200um乙酰丁香酮(as)，ph5.8)，上培養(yǎng)2-3天。

c.將共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)入只含青霉素(car)不含kan的分化培養(yǎng)基中，黑暗條件的溫室中進行脫菌與分化培養(yǎng)5-7天。再繼代在添加kan篩選壓的選擇培養(yǎng)基(ms+3mg/l6-ba+0.1mg/lα-萘乙酸(naa)+5mg/l硝酸銀(agno3)+400mg/lcar+15mg/lkan；ph5.8)中，進行篩選，待分化出再生綠芽。

d.待再生芽長至1cm時切取小芽移至生根培養(yǎng)基(ms+0.2mg/lnaa+10mg/lkan+400mg/lcar；ph5.8)上,用加car與kan的固體ms培養(yǎng)基篩選。

e.苗生根后，移栽入室外。10天后移栽下土缽。

轉(zhuǎn)化植株的鑒定

(1)用于pcr的轉(zhuǎn)化植株總dna的提取

a.70％乙醇擦洗葉片，稱取大約100mg

b.加入600ul抽提緩沖液(0.2mtris－cl，0.25nacl，25mmedta，0.5％sds，ph7.5)，室溫快速研磨。

c.1.5mlependorff管中渦旋混勻5-10s。

d.12000rpm，25min，室溫。取上清，加等體積異丙醇，－20攝氏度沉淀過夜。

e.12000rpm，15min，室溫。加入70％乙醇200ul泡洗dna沉淀。

f.12000rpm，15min，室溫。去乙醇。倒置于紙巾上，待乙醇揮發(fā)干凈。

g.加無菌水100ul溶解粗提dna沉淀。用分光光度計測定或電泳估測其濃度。

h.以總dna為模板，進行pcr。

(2)pcr程序

pcr反應(yīng)體系的總體積為20μl，基因組dna模板1ul(約50ng)、1×taq酶反應(yīng)緩沖液、25mmmgcl21.2ul、2mmdntp1.5ul、10um引物各0.2ul、50％甘油2ul、0.3單位rtaq酶(takara公司),加ddh2o至20μl。依據(jù)植物表達載體中目的基因設(shè)計并合成跨內(nèi)含子的pcr引物。(正向引物：ttcttttcggtggtttattc和反向引物tgacgatttgttgtgttctct，反應(yīng)的時間和溫度作如下：94℃3min，94℃45s，59℃45s，72℃2min30s，30cycles，72℃5min。

檢測結(jié)果顯示，陽性對照和大多數(shù)轉(zhuǎn)化植株均能夠擴增出預期大小的電泳條帶，而陰性對照則沒有，表明轉(zhuǎn)基因油菜基因組中已經(jīng)含有外源基因dna片段。

對t1代轉(zhuǎn)基因株系進行表型分析

油菜bnshp1-a9轉(zhuǎn)基因株系及對照完全成熟后收獲，油菜取主花序角果并充分烘干后鑒定抗裂角指數(shù)。最終結(jié)果顯示，與非轉(zhuǎn)基因株系相比，部分轉(zhuǎn)基因株系抗裂角性增加，最大的增幅超過15％。

因此bnshp1-a9-r1為一個負性調(diào)控基因，r2中的indel序列使得bnshp1-a9-r2基因具備抗裂角性。

實施例4：

基于油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9-r2中的indel序列設(shè)計的分子標記引物在油菜的遺傳育種中的應(yīng)用：

基于indel序列(seqidno.3所示)設(shè)計的分子標記引物如下：

if4：acttgggacatagcctaatgatg

ir4：tcgtaccactttgatttcagaca。

該基因indel分子標記定位于該抗裂角區(qū)間(圖5)

(1)田間種植中選r1×r2f2單株套袋自交獲得的f3代種子。

(2)在定苗前對f3單株掛牌取樣，并提取葉片總dna，利用分子標記if4/ir4對其進行qsri.a9.1基因型的判斷，僅保留帶型和r2相同的單株，其余帶型和r1相同以及雜合的單株全部拔掉(因為if4/ir4是共顯性標記，所以保留帶型同r2拔掉帶型為r1和h的單株)。

帶型與r2相同的為僅擴增得到270bp一條帶的單株。

(3)在成熟期收獲f3單株，并對其進行抗裂角鑒定。結(jié)果表明，分子標記if4/ir4基因型和r2相同的單株，其抗裂角性超過r2的比例高達93.4％?？梢娫诿缙谶M行淘汰，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率，進而可以快速篩選出抗裂角性油菜株系用于提高油菜遺傳改良。

實施例5：

油菜裂角相關(guān)基因bnshp1-a9-r2中的indel序列作為分子標記在遺傳育種中的普適性：

一、實驗材料如下：

(1).中油821，中雙4號，中雙9號，浙油50，skipton，皖油12號，oc3237；滬油21，華雙5號，p10，trigold，av-sap，gsl2，浙雙6號，westar，寧油7號，matador，nilla，cibrabra，apomix。

(2).初定位使用的兩個親本材料：r1及r2及其dh群體。

二、基因型檢測引物：

引物if4和ir4。

三、基因型檢測方法

indel標記的擴增體系及檢測程序

分別在5片葉時，提取葉片dna，稀釋到10ng/μl濃度的工作液進行pcr擴增。indel標記(if4-f/r)基于等位基因pcr擴增原理開發(fā)。具體做法為：根據(jù)已知indel位點設(shè)計特異正向引物(if4-f:acttgggacatagcctaatgatg)，反向引物(if4-r:tcgtaccactttgatttcagaca)，3％瓊脂糖凝膠，電壓5v/cm電泳檢測pcr產(chǎn)物。

pcr擴增體系為：2×taqmix5ul,forwardprimer(10um/ul)1μl,reverseprimer(10um/ul)1μl,gdna1μl,ddh2o2μl,total10μl。

pcr反應(yīng)條件：94℃，3min；94℃，30s；58℃，30s，72℃，45s；35個循環(huán)；72℃，10min；4℃，tilluse。

分別擴增獲得bnshp1-a9-r2片段大小為270bp，而bnshp1-a9-r1大小為237bp，用瓊脂糖電泳檢測即可區(qū)分條帶差異，顯示indel結(jié)果。

可以從圖4中看到，中油821，中雙4號，中雙9號，浙油50，skipton，皖油12號，oc3237為具有r1indel標記的7份自交系；滬油21，華雙5號，p10，trigold，av-sap，gsl2，浙雙6號，westar，寧油7號，matador，nilla，cibrabra，apomix則為具有r2indel標記的13份自交系：因此本發(fā)明提供的分子標記在已有的油菜品系中具有普適性，適用于抗裂角油菜篩選。

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所

<120>油菜裂角相關(guān)基因及分子標記及應(yīng)用

<130>油菜裂角相關(guān)基因及分子標記及應(yīng)用

<160>5

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>2737

<212>dna

<213>甘藍型油菜

<400>1

atggatgaaggtgggagtagtcactatgcagagagtagcaagaagataggtagagggaag60

atagagataaagaggatagagaacacaacaaatcgtcaagtaaccttctgcaaacgacgc120

aatggtcttctcaagaaagcttatgagctctctgtcttgtgtgatgcggaagttgccctc180

gttatcttttccactcgtggccgtctttatgagtacgccagcaacaggtatgcttctcct240

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