本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種與多種細(xì)胞運(yùn)輸載體相關(guān)的核酸適配體用于制備活體細(xì)胞內(nèi)分子成像和靶向藥物傳輸試劑或者制品上的用途。

背景技術(shù)：

核酸適配體是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,selex)技術(shù)從體外人工篩選得到的，能與相應(yīng)配體專一性緊密結(jié)合的一類rna或單鏈dna(ssdna)分子。核酸適配體通過(guò)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊形成特定的三維空間構(gòu)型，與靶分子高親和性、高特異性地相互作用。

細(xì)胞靶向給藥是提高治療效果減少毒副作用的有效途徑。由于核酸適配體的可控釋，易修飾，載藥性及可工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，將藥物偶聯(lián)于核酸適配體上漸漸成為靶向給藥的主要方法。以核酸適體介導(dǎo)或修飾的藥物及藥物納米制劑，為主動(dòng)靶向細(xì)胞給藥系統(tǒng)構(gòu)建開拓了新方向。目前如sirna,藥物，毒素，酶，熒光基團(tuán)，放射性物質(zhì)已經(jīng)被報(bào)道通過(guò)核酸適配體介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞。

在靶向藥物傳遞中，核酸適配體靶向藥物傳遞體系顯示出了對(duì)疾病組織較高的特定靶向性，而且?guī)缀醪慌c正常細(xì)胞結(jié)合，因此可極大地提高藥效，并降低藥物副作用。但是大部分核酸適配體不能主動(dòng)穿透細(xì)胞，隨著納米生物技術(shù)的不斷提高，polyethyleneglycol(peg)-functionalizedpoly(d,l-lactic-co-glycolicacid)(plga)納米顆粒,脂質(zhì)體納米結(jié)構(gòu),細(xì)胞穿透性多肽cell-penetratingpeptides(cpps)都被用于修飾核酸適配體用于提 高其細(xì)胞穿透性。據(jù)報(bào)道，核酸適配體可以被碳納米管(cnt)包埋，而用于高效地藥物輸送。碳納米管(cnt)作為核酸適配體的載體同時(shí)可以極大的提高其細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用穩(wěn)定性?；谔技{米管和核酸適體的生物傳感器也被用于活體細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)檢測(cè)。

診斷和治療的一體化和同步化將是未來(lái)分子醫(yī)學(xué)的重要發(fā)展方向，設(shè)計(jì)制備更多具有多功能的分子無(wú)疑是這一領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)。目前核酸適配體用于生物醫(yī)學(xué)還處于起步階段，因此開發(fā)出一款可以針對(duì)多種細(xì)胞的通用遞質(zhì)工具的核酸適配體，將極大擴(kuò)寬核酸適配體的應(yīng)用范圍。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供作為多種細(xì)胞運(yùn)輸載體的核酸適配體，以及利用該核酸適配體制備用于活體細(xì)胞內(nèi)分子成像和靶向藥物傳輸試劑或者制品上的用途。核酸適配體c20-1是基于細(xì)胞內(nèi)selex方法篩選出來(lái)的核酸適配體。我的研究發(fā)現(xiàn)，c20-1核酸適配體可以有效的穿透多種活體細(xì)胞如nih3t3(mouseembryonicfibroblastcellline),hff(humanforeskinfibroblast),mef(mouseembryonicfibroblasts)以及raw264.7(mouseleukaemicmonocytemacrophagecellline)。該核酸適配體序列尚未有任何報(bào)道，其將為用于活體細(xì)胞內(nèi)分子成像和靶向藥物傳輸提供新的策略。

核酸適配體c20-1，序列為

c20-1：cagggggtgggtgggtggagtgctgtttcgtcctcccgta

所述的核酸適配體c20-1的用途，用于活體細(xì)胞內(nèi)分子成像和靶向藥物傳輸試劑或者制品。

本發(fā)明的c20-1是一種能廣譜性自主穿透多種活體細(xì)胞膜的核酸適配體，可以在實(shí)驗(yàn)室條件下用做活體細(xì)胞內(nèi)分子成像和靶向藥物傳遞的工具。具有核酸適配體的通用特點(diǎn)，如：高親和力，高特異性，穩(wěn)定性高，無(wú)毒性，免疫原性低。相比于對(duì)照核酸適配體，核酸適配體c20-1能有效進(jìn)入活體細(xì)胞內(nèi)；熒光標(biāo)記的核酸適配體c20-1能穿透多種活體細(xì)胞如nih3t3(mouseembryonicfibroblastcellline),hff(humanforeskinfibroblast),mef(mouseembryonicfibroblasts)以及raw264.7(mouseleukaemicmonocytemacrophagecellline)。綜上，c20-1能主動(dòng)穿透多種活體細(xì)胞膜，將有助于開發(fā)針對(duì)活體細(xì)胞內(nèi)分子成像和靶向藥物傳輸試劑或者制品。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

核酸適配體不但和抗體一樣能與靶分子高效、特異地結(jié)合,而且具有許多抗體無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn),如分子量小、靶分子廣泛(包括毒素、免疫原性弱和不具有免疫原性的物質(zhì))、自身穩(wěn)定性強(qiáng)、變性復(fù)性快速可逆、免疫原性低、體外篩選不依賴動(dòng)物或細(xì)胞和易進(jìn)行多種修飾修與標(biāo)記等。核酸適配體c20-1能主動(dòng)穿透多種活體細(xì)胞膜。上述結(jié)果顯示c20-1是一種新型活體細(xì)胞內(nèi)分子成像和靶向藥物傳輸?shù)墓ぞ?。本發(fā)明對(duì)于活體細(xì)胞內(nèi)成像和靶向醫(yī)療具有重大意義。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

圖1為篩選到的細(xì)胞核酸適配體庫(kù)的高通量測(cè)序結(jié)果。

圖2為采用熒光標(biāo)記的核酸適配體c20-1，對(duì)照核酸適配體d20-1和hff(humanforeskinfibroblast)孵育。

圖3為采用不同細(xì)胞系和熒光標(biāo)記的核酸適配體c20-1孵育。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)具體的介紹，旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

核酸適配體c20-1是采用一種基于細(xì)胞內(nèi)-selex的方法，采用為具有活性的nih3t3細(xì)胞系為篩選對(duì)象。200pmol的單鏈dna文庫(kù)(包含了10¹²～10¹⁵個(gè)不同的寡核苷酸)在緩沖液(pbs包含5mmmgcl2,0.1mg/mltrna,1mg/mlbsa)中加熱到加熱到95℃5分鐘，然后在冰上快速降溫制備。

nih3t3細(xì)胞用pbs洗三次。然后dna庫(kù)加入到nih3t3細(xì)胞孵育60min，，然后細(xì)胞用pbs洗三次，除去未結(jié)合的適配體，分離得到細(xì)胞-適配體復(fù)合物；將確定與細(xì)胞結(jié)合的核酸適配體進(jìn)行pcr擴(kuò)增并富集純化，篩選出能夠和細(xì)胞特異性結(jié)合的核酸適配體。通過(guò)2輪重復(fù)的篩選后，第三輪篩選開始，dna適配體庫(kù)先和細(xì)胞孵育60min，然后細(xì)胞用0.05％胰蛋白酶在37℃處理10分鐘，收集細(xì)胞，pbs洗三次，離心(1500轉(zhuǎn)/分，5分鐘)，然后利用相同的方法pcr擴(kuò)增，然后此方法重復(fù)兩輪篩選。篩選結(jié)束后，我通過(guò)高通量測(cè)序的選擇了篩選論數(shù)1，3和5。通過(guò)分析高通量測(cè)序結(jié)果，結(jié)果如圖1所示，在后來(lái)的選擇輪數(shù)中，尤其是在第五輪中，重復(fù)序列的百分比增加，說(shuō)明通過(guò)此篩選富積了某些核酸適配體，其中c20-1是富積頻率較高的候選核酸序列。

c20-1是通過(guò)dna合成儀按照它們的序列順序合成，然后通過(guò)高效液相色譜(hplc)或者是變性電泳(ultrapage)純化，最后通過(guò)離心濃縮干燥而制備。

優(yōu)選的，為了明確篩選的核酸適配體c20-1對(duì)自主進(jìn)入活體細(xì)胞內(nèi)是特異 性地，而不是由于細(xì)胞的一種非選擇性的吞噬。我選取了熒光標(biāo)記的對(duì)照核酸適配體和活的hff細(xì)胞進(jìn)行孵育，通過(guò)三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果如圖2所示，相比于對(duì)照核酸d20-1，發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記的c20-1能更自主有效地進(jìn)入hff(humanforeskinfibroblast)細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)一步采用fitc熒光標(biāo)記的核酸適配體c20-1和不同活細(xì)胞反應(yīng)(nih3t3(mouseembryonicfibroblastcellline),hff(humanforeskinfibroblast),mef(mouseembryonicfibroblasts)以及raw264.7(mouseleukaemicmonocytemacrophagecellline),經(jīng)過(guò)三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)后，結(jié)果如圖3所示，核酸適配體c20-1均能自主有效地進(jìn)入這些活細(xì)胞內(nèi)。

結(jié)論：

1)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)selex方法可以篩選得到自主進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的核酸適配體。

2)核酸適配體c20-1自主進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)是特異性地。

3)核酸適配體c20-1能進(jìn)入不同的活細(xì)胞內(nèi)：(nih3t3(mouseembryonicfibroblastcellline),hff(humanforeskinfibroblast),mef(mouseembryonicfibroblasts)以及raw264.7(mouseleukaemicmonocytemacrophagecellline)。