本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及一種外泌體快速分離和純化的試劑盒。
背景技術(shù)：
：外泌體(exosome)是由多種活細(xì)胞分泌的囊泡小體，其中含有蛋白質(zhì)和rna等多種組分，直徑大多介于30～100nm之間。在電子顯微鏡下，可見外泌體由雙層磷脂分子包裹，形態(tài)呈扁形或球形小體，有些為杯狀；其在體液中的存在形式以球形結(jié)構(gòu)為主，通?？稍谡崽敲芏忍荻热芤褐忻芏?．13～1.19g／ml的范圍獲得富集。目前認(rèn)為外泌體可由各種類型的細(xì)胞分泌，發(fā)源于細(xì)胞內(nèi)吞系統(tǒng)中的晚期內(nèi)體。外泌體在外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等體液中具有很高的豐度，而不同組織來源的外泌體在組成和功能方面存在差異，同時(shí)這種差異受到細(xì)胞外基質(zhì)和微環(huán)境的動(dòng)態(tài)調(diào)控。腫瘤來源或腫瘤相關(guān)的外泌體是調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，對(duì)腫瘤外泌體的分析和檢測(cè)可以輔助腫瘤的早期診斷、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后分析。此外，外泌體及其修飾加工產(chǎn)物還可以作為基因或藥物的有效載體，用于腫瘤治療。最常用的外泌體純化手段是超離法，采用低速離心、高速離心交替進(jìn)行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡(jiǎn)單，獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎，但過程比較費(fèi)時(shí)(20小時(shí)以上)，且回收率不穩(wěn)定，純度也受到質(zhì)疑；此外，重復(fù)離心操作還有可能對(duì)囊泡造成損害，從而降低其質(zhì)量。本專利的外泌體分離純化試劑盒通過高分子過濾柱的原理而制備，是一款可以快速高效地從血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取exosome的試劑盒，該試劑盒具有如下特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，無需超速離心，1~2小時(shí)內(nèi)即可完成抽提和純化；純度高，富集量大，從2~4ml細(xì)胞上清液中可獲得200~400ng外泌體蛋白或50-200ng外泌體rna；成本低，穩(wěn)定性好，便于運(yùn)輸，便于保存；適用于血清、尿液、唾沫、積水等體液以及細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行外泌體的抽提和純化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：一種外泌體快速分離和純化的試劑盒，包括溶液ⅰ、ⅱ、ⅲ和純化柱，共四部分組成，每種組成的體系或者數(shù)量如下：規(guī)格10rnx40rnx溶液i2.5ml10ml溶液ii2.5ml10ml溶液iii10ml20mlx2純化柱10個(gè)40個(gè)溶液ⅰ、ⅱ、ⅲ按照下文所描述的操作后可以有效的分離外泌體，再通過純化柱純化，可以獲得高純度的外泌體顆粒。本發(fā)明試劑盒可用于血液、尿液、唾液、積液等體液以及細(xì)胞培養(yǎng)液的外泌體提起和純化。本發(fā)明試劑盒可用于人源、大鼠、小鼠、兔子等哺乳動(dòng)物體液的外泌體提起和純化。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。1.樣品前處理：為避免血清中雜蛋白的干擾，建議使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后再收集細(xì)胞上清液。對(duì)于增殖速度較快的細(xì)胞，建議對(duì)收集后的細(xì)胞上清液用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行1:2的稀釋。如需對(duì)大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)（例如懸浮細(xì)胞），建議先稀釋至1*10^5cells/ml，再取樣進(jìn)行檢測(cè)。2.操作步驟1)收集2ml細(xì)胞上清液；2)以3,000×g，4°c離心15min，以去除殘留細(xì)胞或細(xì)胞碎片；3)將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的10ml玻璃管中，并至于冰上備用；4)另取一支干凈的10ml玻璃管，按照如下比例配制溶液ⅰ、ⅱ、ⅲ的混合液；培養(yǎng)上清液體積混合液總體積溶液i溶液ii溶液iii2ml0.75ml0.125ml0.125ml0.5ml3ml1.125ml0.187ml0.187ml0.75ml4ml1.5ml0.25ml0.25ml1ml5)震蕩5~10s，混勻；6)向每2ml上清液中加入0.75ml的上述混合液；7)蓋好管蓋，于振蕩器上劇烈震蕩30s，4℃孵育30min；經(jīng)處理的樣品通常會(huì)形成3層或2層溶液，吸掉上層或下層溶液8)將剩余樣品轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管中，以5000xg離心3min，樣品將繼續(xù)呈現(xiàn)出3層，棄掉上清與下層溶液；9)將剩余樣品轉(zhuǎn)入0.5ml的離心管中，重復(fù)上述步驟8一次；10)打開離心管蓋，放置10min待自然晾干；11)加入4倍沉淀體積的1×pbs，反復(fù)吹打重懸沉淀，使其完全分散，于水平搖床上孵育10min（高速，中途可以再進(jìn)行一次反復(fù)吹打）；12)以5000xg離心5min，將上清液吸出來至于純化柱中（小心操作，不要吸到沉淀），剩余沉淀于4℃保留；13)將純化柱以1000xg離心5min，收集得到的濾過液；14)上述13所得到的溶液即為溶于pbs的外泌體，可繼續(xù)用于后續(xù)試驗(yàn)或于4℃暫存，如需長期保存請(qǐng)于-80℃冰箱中，建議3個(gè)月內(nèi)使用。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。用于本發(fā)明的待檢液體沒有特別限制，可以是人源、大鼠、小鼠、兔子等哺乳動(dòng)物體液、也可以是前述動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)液。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁12