本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體、編碼該突變體的dna、含有該突變體的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床使用最多和應(yīng)用最廣的一類抗生素。β-內(nèi)酰胺環(huán)抗生素中最主要的兩類是青霉素和頭孢類抗生素。青霉素因其高效和低毒而成為臨床上應(yīng)用最廣的重要抗生素。但是隨著青霉素的大量使用，它的一些不足也暴露出來(lái)，如青霉素抗菌譜相對(duì)比較窄、容易導(dǎo)致病菌耐藥性、對(duì)酸不穩(wěn)定、不能口服等。頭孢菌素和青霉素都具有β-內(nèi)酰胺特征，兩者的不同之處是青霉素的母核由β-內(nèi)酰胺環(huán)和五元噻唑環(huán)構(gòu)成，而頭孢菌素的母核則由β-內(nèi)酰胺環(huán)和六元二氫噻嗪環(huán)構(gòu)成。因此，頭孢菌素不易被β-內(nèi)酰胺酶(如金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的β-內(nèi)酰胺酶)降解。而且頭孢菌素具有高效、低毒、抗菌譜廣、過(guò)敏反應(yīng)少、可以口服、品種多等優(yōu)點(diǎn)。頭孢菌素作為一類廣譜半合成抗生素，可分為以7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸(7-adca)為母核和以7-氨基頭孢烷酸(7-aca)為母核的兩大系列。以7-adca為母核的系列是青霉素的下游產(chǎn)品。利用7-adca可以進(jìn)一步合成頭孢氨芐、頭孢拉定等頭孢菌素類抗生素藥物。目前，工業(yè)上從青霉素g到7-adca的合成使用化學(xué)法，反應(yīng)條件苛刻，步驟繁瑣，對(duì)環(huán)境造成污染。而使用青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶使青霉素g擴(kuò)環(huán)從而得到g-7-adca(7-苯乙?；撘阴Ｑ趸^孢菌素)是更為有效和環(huán)保的方法。因此，青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶成為當(dāng)今工業(yè)酶研究中的一大熱點(diǎn)。但青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶的天然底物是不易廉價(jià)取得的青霉素n。非天然底物青霉素g則可以方便、廉價(jià)地獲得。所以科學(xué)家們利用各種方法對(duì)青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶進(jìn)行改造，以提高它對(duì)非天然性底物青霉素g的催化活性。自1976年kohsaka首先對(duì)低等真核生物頂頭孢菌的擴(kuò)環(huán)酶進(jìn)行研究以來(lái)，至今擴(kuò)環(huán)酶的研究得到迅速發(fā)展。以棒狀鏈霉菌(streptomycesclavuligerus)為來(lái)源的擴(kuò)環(huán)酶由于具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值而得到研究者的極大關(guān)注。然而，仍需要對(duì)青霉素g的催化活性和耐熱性提高的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體、編碼該突變體的dna、含有該突變體的試劑盒及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供了：(1)一種青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的seqidno.:2為參考序列，具有位于第42位蘇氨酸和第126位谷氨酰胺中的至少一者的突變，所述第42位蘇氨酸突變?yōu)槌渥陨硪酝馄渌烊话被嶂械娜我徽?，所述?26位谷氨酰胺突變?yōu)槌渥陨硪酝馄渌烊话被嶂械娜我徽摺?2)根據(jù)(1)所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體，其特征在于其具有位于第42位蘇氨酸的所述突變和位于第126位谷氨酰胺的所述突變。(3)根據(jù)(1)或(2)所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體，其特征在于所述第42位蘇氨酸突變?yōu)榘腚装彼?、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸?4)根據(jù)(1)或(2)所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體，其特征在于所述第42位蘇氨酸突變?yōu)樘於彼帷?5)根據(jù)(1)或(2)所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體，其特征在于所述第126位谷氨酰胺突變?yōu)楸彼?、或苯丙氨酸、或異亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸?6)根據(jù)(1)或(2)所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體，其特征在于所述第126位谷氨酰胺突變?yōu)楸奖彼帷?7)根據(jù)(1)所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體，其特征在于其具有序列表中的seqidno.:4所示的氨基酸序列，并且其中第42位的xaa代表半胱氨酸、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸。(8)根據(jù)(1)所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體，其特征在于其具有序列表中的seqidno.:4所示的氨基酸序列，并且其中第126位的xaa代表丙氨酸、或苯丙氨酸、或異亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸。(9)根據(jù)(1)所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體，其特征在于其具有序列表中的seqidno.:4所示的氨基酸序列，其中第42位的xaa代表天冬氨酸，并且第126位的xaa代表苯丙氨酸。(10)一種dna，其含有編碼(1)至(9)中任一項(xiàng)所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體的核苷酸序列。(11)一種表達(dá)載體，其含有與啟動(dòng)子有效連接的(10)所述的dna。(12)一種宿主細(xì)胞，其含有(11)所述的表達(dá)載體。(13)(1)至(9)中任一項(xiàng)所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體在制備7-苯乙?；撘阴Ｑ趸^孢菌素中的應(yīng)用。(14)根據(jù)(13)所述的應(yīng)用，其中所述青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體以青霉素g為底物。(15)一種制備7-苯乙?；撘阴Ｑ趸^孢菌素的方法，包括將(1)至(9)中任一項(xiàng)所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體與用于制備7-苯乙酰基脫乙酰氧基頭孢菌素的底物一起孵育。(16)根據(jù)(15)所述的方法，其中所述底物為青霉素g。(17)一種用于制備7-苯乙酰基脫乙酰氧基頭孢菌素的試劑盒，包含(1)至(9)中任一項(xiàng)所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體。(18)根據(jù)(17)所述的試劑盒，還包含青霉素g。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：本發(fā)明通過(guò)對(duì)棒狀鏈霉菌的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶進(jìn)行基因工程改造，提高了該酶對(duì)青霉素g的催化活性和耐熱性。與野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶相比，本發(fā)明的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體的催化活性可提高至少20％，耐熱性可提高至少400％。本發(fā)明的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體更適于商業(yè)和工業(yè)應(yīng)用。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了大量深入的理論研究和實(shí)驗(yàn)摸索，利用遺傳工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對(duì)棒狀鏈霉菌的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶進(jìn)行了突變改造，最終獲得了一系列具有高酶活和高耐熱性的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體，可更有利地用于生產(chǎn)g-7-adca。具體而言，本發(fā)明提供了一種青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的seqidno.:2為參考序列，具有位于第42位蘇氨酸和第126位谷氨酰胺中的至少一者的突變，所述第42位蘇氨酸突變?yōu)槌渥陨硪酝馄渌烊话被嶂械娜我徽撸龅?26位谷氨酰胺突變?yōu)槌渥陨硪酝馄渌烊话被嶂械娜我徽?。?yōu)選地，所述第42位蘇氨酸突變?yōu)榘腚装彼?、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨?met)、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸；其中更優(yōu)選突變?yōu)樘於彼?、谷氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺，最?yōu)選突變?yōu)樘於彼?。?yōu)選地，所述第126位谷氨酰胺突變?yōu)楸彼?、或苯丙氨酸、或異亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸；其中更?yōu)選突變?yōu)楸奖彼?、丙氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、或酪氨酸，最?yōu)選突變?yōu)楸奖彼?。?yōu)選地，所述青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體同時(shí)具有位于第42位蘇氨酸的突變和位于第126位谷氨酰胺的突變。優(yōu)選地，所述青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體具有序列表中的seqidno.:4所示的氨基酸序列。編碼序列表seqidno.:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列如seqidno.:3所示。還優(yōu)選地，序列表seqidno.:4中第42位的xaa代表半胱氨酸、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸；其中更優(yōu)選突變?yōu)樘於彼?、谷氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺，最?yōu)選突變?yōu)樘於彼?。還優(yōu)選地，序列表seqidno.:4中第126位的xaa代表丙氨酸、或苯丙氨酸、或異亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸；其中更優(yōu)選突變?yōu)楸奖彼?、丙氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、或酪氨酸，最?yōu)選突變?yōu)楸奖彼?。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體具有序列表中的seqidno.:4所示的氨基酸序列，并且其中第42位的xaa代表天冬氨酸，第126位的xaa代表苯丙氨酸。本發(fā)明的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體可以利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)對(duì)來(lái)自棒狀鏈霉菌(streptomycesclavuligerus)的野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶進(jìn)行定點(diǎn)突變而獲得。所述棒狀鏈霉菌的野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶的核苷酸序列如序列表seqidno.:1所示，氨基酸序列如序列表seqidno.:2所示。棒狀鏈霉菌的野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶基因的genbank登錄號(hào)為m32324。所用技術(shù)方法和制備流程例如為，利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，構(gòu)建含有野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶基因的載體質(zhì)粒，然后選擇定點(diǎn)突變的位點(diǎn)以及突變后的氨基酸種類，合成相應(yīng)的引物，以所述的含青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶基因的載體質(zhì)粒為模板，pcr擴(kuò)增突變dna片段，分離純化，然后以pcr將所得片段擴(kuò)增為全長(zhǎng)突變基因。通過(guò)將該全長(zhǎng)突變基因克隆到適當(dāng)?shù)妮d體上并轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)篩選出具有高酶活擴(kuò)環(huán)酶的陽(yáng)性克隆。最后從陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒dna,進(jìn)行dna序列測(cè)定分析，以確定引入的突變。在本發(fā)明制備青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體的方法中，可采用任何合適的載體。例如，適用的載體包括但不限于原核表達(dá)載體pgemt-easy、prset和pet21；包括但不限于真核表達(dá)載體pyd1和pyes2/gs；包括但不限于克隆載體puc18/19和pbluscript-sk。在本發(fā)明制備青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體的方法中，所獲得的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變基因可以在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，也可采用本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法實(shí)現(xiàn)在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞外表達(dá)。在本發(fā)明制備青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體的方法中，所述載體的微生物宿主細(xì)胞可以為原核生物細(xì)胞或真核生物細(xì)胞。所述原核微生物包括但不限于大腸桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、t.saccharolyticum和鏈霉菌。所述真核微生物包括但不限于釀酒酵母和畢赤巴斯德酵母。本文所用的術(shù)語(yǔ)“參考序列”，當(dāng)其為核苷酸序列時(shí)，是指序列表seqidno.:1的序列，當(dāng)其為氨基酸序列時(shí)，是指序列表seqidno.:2的序列。本發(fā)明的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體可以以未經(jīng)純化的粗酶形式使用，也可以是經(jīng)部分純化的或純化的形式。本發(fā)明的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體可以是以序列表seqidno.:2所示的氨基酸序列為參考序列，與其相比至少存在一個(gè)氨基酸的差異，并且酶的催化活性比該野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶至少高20％，優(yōu)選至少高20％-100％，更優(yōu)選至少高200％，和/或耐熱性比該野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶至少高400％，優(yōu)選至少高900％，更優(yōu)選高1700％。本發(fā)明還提供了一種dna，其含有本發(fā)明所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，其含有與啟動(dòng)子有效連接的本發(fā)明所述的dna。在本發(fā)明中，“表達(dá)載體”是指能夠指導(dǎo)其有效連接的基因的表達(dá)的載體。通過(guò)將啟動(dòng)子序列有效連接至根據(jù)本發(fā)明所述的dna，該啟動(dòng)子序列可指導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明所述的相應(yīng)的肽的表達(dá)。通常，基因工程技術(shù)中所用的表達(dá)載體可以為質(zhì)粒的形式，但本發(fā)明也可以包括表達(dá)載體的其它已知形式。當(dāng)啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)編碼本發(fā)明所述肽的dna表達(dá)為rna時(shí)，該啟動(dòng)子和所述dna即被“有效連接”。所述啟動(dòng)子可以為基因工程領(lǐng)域中常用的啟動(dòng)子。本發(fā)明的表達(dá)載體還可包含其它的序列，如還可以包含終止序列，其能夠用于提高信息水平并使從構(gòu)建體到其它序列的通讀最小化。另外，表達(dá)載體還可以具有選擇性標(biāo)記，例如抗生素抗性基因的形式，從而能夠使攜帶這些載體的細(xì)胞被篩選出來(lái)。本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)本發(fā)明所述的表達(dá)載體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指已經(jīng)引入了根據(jù)本發(fā)明所述的表達(dá)載體的細(xì)胞。該細(xì)胞例如可以為原核細(xì)胞，其可用于例如快速產(chǎn)生大量的本發(fā)明的表達(dá)載體。可以用本發(fā)明所述的表達(dá)載體瞬時(shí)或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意技術(shù)實(shí)現(xiàn)，所述技術(shù)包括但不限于：標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌轉(zhuǎn)化、磷酸鈣共沉淀或電穿孔。本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體在制備7-苯乙?；撘阴Ｑ趸^孢菌素中的應(yīng)用。優(yōu)選的是，在所述應(yīng)用中，所述青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體以青霉素g為底物。本發(fā)明還提供了一種制備7-苯乙酰基脫乙酰氧基頭孢菌素的方法，包括將本發(fā)明所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體與用于制備7-苯乙?；撘阴Ｑ趸^孢菌素的底物一起孵育。優(yōu)選的是，所述底物為青霉素g。制備7-苯乙酰基脫乙酰氧基頭孢菌素可以利用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進(jìn)行，只要使用本發(fā)明所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體作為催化所用的酶即可。本發(fā)明還提供了一種用于制備7-苯乙?；撘阴Ｑ趸^孢菌素的試劑盒，包含本發(fā)明所述的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體。還優(yōu)選包含青霉素g。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明所述的試劑盒還可以包含制備7-苯乙?；撘阴Ｑ趸^孢菌素所需的其他試劑和材料。以下通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步解釋或說(shuō)明本
發(fā)明內(nèi)容，但這些實(shí)施例不應(yīng)被理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例以下實(shí)施例中未注明具體條件的，均按常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。除非特別說(shuō)明，否則所述百分比為體積百分比。實(shí)施例1：野生型克隆青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶基因的擴(kuò)增及質(zhì)粒pgemt-sc的構(gòu)建根據(jù)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(uniprotkb:p18548)的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶氨基酸序列，運(yùn)用軟件genedesigner2.0，根據(jù)宿主細(xì)胞的密碼子偏好性將該氨基酸序列逆轉(zhuǎn)錄為dna序列。根據(jù)該dna序列設(shè)計(jì)引物sf和sr(引物序列見(jiàn)表1)。合成上述逆轉(zhuǎn)錄的dna序列，將其連接到載體pma-t(lifetechnologies公司)上，獲得質(zhì)粒sc-pma-t，以質(zhì)粒sc-pma-t為模板，用引物對(duì)sf和sr進(jìn)行pcr，擴(kuò)增得到936bp產(chǎn)物。pcr反應(yīng)條件為：1μg質(zhì)粒sc-pma-t，0.1μg引物(sf+sr)，5μl10x緩沖液(200mmtris-hcl(ph8.0),100mmkcl,100mm(nh4)2so4,20mmmgso4,1％tritonx-100)，4％dmso，4μl2.5mmdntp,1ulataq聚合酶(takara公司)，用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。pcr反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?6℃5分鐘，30個(gè)循環(huán)：94℃45秒、53℃45秒和72℃3分鐘，最后72℃10分鐘。擴(kuò)增反應(yīng)得到野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶基因，通過(guò)1％(w/v)瓊脂糖電泳，利用e.z.n.a.gelextraction試劑盒(omegabio-tekinc.)提純pcr產(chǎn)物，分離純化大小為936bp的片段sc，經(jīng)ta克隆以t4dna連接酶(neb公司)連接至pgemt-easy(promega公司)載體，獲得質(zhì)粒pgemt-sc。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌bl21(novagen公司)，在含50mg/l氨芐青霉素的lb平板上37℃培養(yǎng)，挑取單菌落，用dna-spinplasmiddnapurification試劑盒(intronbiotechnology)提取質(zhì)粒pgemt-sc，經(jīng)dna測(cè)序確定序列。實(shí)施例2：青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶氨基酸位點(diǎn)42的定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變技術(shù)參考“pcrprotocols(johnm.s.bartlett和davidstirling.totowa,n.j.:humanapress,2003)”一書(shū)之描述。以質(zhì)粒pgemt-sc(實(shí)施例1)為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)42df和42dr(表1)，將原始氨基酸序列中第42位的蘇氨酸(t)突變?yōu)樘於彼?d)，獲得突變體sc-t42d。具體而言，以質(zhì)粒pgemt-sc為模板，用引物sf和42dr擴(kuò)增模板片段42d1；用引物42df和sr擴(kuò)增模板片段42d2。pcr反應(yīng)條件為：1μg質(zhì)粒pgemt-sc，0.1μg引物(sf+42dr)(擴(kuò)增模板片段42d1)，或0.1μg引物(42df+sr)(擴(kuò)增模板片段42d2)，5μl10x緩沖液(200mmtris-hcl(ph8.0)，100mmkcl,100mm(nh4)2so4,20mmmgso4,1％tritonx-100),4％dmso，4μl2.5mmdntp,1ulataq聚合酶(takara公司)，用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。pcr反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?6℃5分鐘，30個(gè)循環(huán)：94℃45秒、53℃45秒和72℃60秒，最后72℃10分鐘。擴(kuò)增得到模板片段42d1和模板片段42d2，通過(guò)1％(w/v)瓊脂糖電泳，用e.z.n.a.gelextraction試劑盒(omegabio-tekinc.)分離純化，之后用引物sf和sr擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。pcr反應(yīng)條件為：50ng模板片段42d1和50ng模板片段42d2，0.1μg引物(sf+sr)，5μl10x緩沖液(200mmtris-hcl(ph8.0)，100mmkcl,100mm(nh4)2so4,20mmmgso4,1％tritonx-100),4％dmso，4μl2.5mmdntp,1ulataq聚合酶(takara公司)，用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。pcr反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?6℃5分鐘，30個(gè)循環(huán)：94℃45秒、53℃45秒和72℃2分鐘，最后72℃10分鐘。擴(kuò)增反應(yīng)得全長(zhǎng)突變基因，通過(guò)1％(w/v)瓊脂糖電泳，用e.z.n.a.gelextraction試劑盒(omegabio-tekinc.)提純pcr產(chǎn)物，分離純化大小為936pb的全長(zhǎng)突變基因sc-t42d。按照與上述類似的方法構(gòu)建突變體sc-t42c、sc-t42e、sc-t42m、sc-t42p、sc-t42q、sc-t42r，所用引物見(jiàn)表1。所得各突變體的名稱和序列表編號(hào)見(jiàn)表2。實(shí)施例3：質(zhì)粒pr-sc-t42d的構(gòu)建用ndei+bglii(neb)對(duì)突變基因sc-t42d和載體prset-kan(invitrogen)進(jìn)行酶切處理，通過(guò)1％(w/v)瓊脂糖電泳，用e.z.n.a.gelextraction試劑盒(omegabio-tekinc.)提純酶切產(chǎn)物，以進(jìn)行分離純化，以t4dna連接酶(neb公司)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌hb101(bio-rad)，在含50mg/l卡那霉素的lb平板上37℃培養(yǎng)，挑取單菌落，用dna-spinplasmiddnapurification試劑盒(intronbiotechnology)提取質(zhì)粒pr-sc-t42d，經(jīng)dna測(cè)序確定序列。按照上述類似的方法構(gòu)建質(zhì)粒pr-sc-t42c、pr-sc-t42e、pr-sc-t42m、pr-sc-t42p、pr-sc-t42q和pr-sc-t42r。實(shí)施例4：青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶氨基酸位點(diǎn)126的定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變技術(shù)參考“pcrprotocols(johnm.s.bartlett和davidstirling.totowa,n.j.:humanapress,2003)”一書(shū)之描述。以質(zhì)粒pgemt-sc(實(shí)施例1)為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)126ff和126fr(表1)，將原始氨基酸序列中第126位的谷氨酰胺(q)突變?yōu)楸奖彼?f)，獲得突變體sc-q126f。具體而言，以質(zhì)粒pgemt-sc為模板，用引物sf和126fr擴(kuò)增模板片段126f1；用引物126ff和sr擴(kuò)增模板片段126f2，pcr反應(yīng)條件為：1μg質(zhì)粒pgemt-sc，0.1μg引物(sf+126fr)(擴(kuò)增模板片段126f1)或0.1μg引物(126ff+sr)(擴(kuò)增模板片段126f2)，5μl10x緩沖液(200mmtris-hcl(ph8.0)，100mmkcl,100mm(nh4)2so4,20mmmgso4,1％tritonx-100),4％dmso，4μl2.5mmdntp,1ulataq聚合酶(takara)，用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。pcr反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?6℃5分鐘，30個(gè)循環(huán)：94℃45秒、53℃45秒和72℃60秒，最后72℃10分鐘。擴(kuò)增得模板片段126f1和模板片段126f2，通過(guò)1％(w/v)瓊脂糖電泳，用e.z.n.a.gelextraction試劑盒(omegabio-tekinc.)分離純化后，用引物sf和sr擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。pcr反應(yīng)條件為：50ng模板片段126f1和50ng模板片段126f2，0.1μg引物(sf+sr)，5μl10x緩沖液(200mmtris-hcl(ph8.0)，100mmkcl,100mm(nh4)2so4,20mmmgso4,1％tritonx-100),4％dmso，4μl2.5mmdntp,1ulataq聚合酶(takara)，用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。pcr反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?6℃5分鐘，30個(gè)循環(huán)：94℃45秒、53℃45秒和72℃2分鐘，最后72℃10分鐘。擴(kuò)增反應(yīng)得全長(zhǎng)突變基因，通過(guò)1％(w/v)瓊脂糖電泳，利用e.z.n.a.gelextraction試劑盒(omegabio-tekinc.)提純pcr產(chǎn)物，分離純化大小為936bp的全長(zhǎng)突變基因sc-q126f。按照上述類似的方法構(gòu)建突變體sc-q126a、sc-q126i、sc-q126l、sc-q126m、sc-q126n、sc-q126w和sc-q126y，所用引物見(jiàn)表1。所得各突變體的名稱和序列表編號(hào)見(jiàn)表2。實(shí)施例5：質(zhì)粒pr-sc-q126f的構(gòu)建用ndei+bglii(neb)對(duì)突變基因sc-q126f和載體prset-kan(invitrogen)進(jìn)行酶切，通過(guò)1％(w/v)瓊脂糖電泳，用e.z.n.a.gelextraction試劑盒(omegabio-tekinc.)提純酶切產(chǎn)物，以進(jìn)行分離純化，以t4dna連接酶(neb)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌hb101(bio-rad)，在含50mg/l卡那霉素的lb平板上37℃培養(yǎng)，挑取單菌落，用dna-spinplasmiddnapurification試劑盒(intronbiotechnology)提取質(zhì)粒pr-sc-q126f，經(jīng)dna測(cè)序確定序列。按照上述類似的方法構(gòu)建質(zhì)粒pr-sc-q126a、pr-sc-q126i、pr-sc-q126l、pr-sc-q126m、pr-sc-q126n、pr-sc-q126w和pr-sc-q126y。實(shí)施例6：青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶雙突變組合pr-sc-t42dq126f的構(gòu)建定點(diǎn)突變技術(shù)參考“pcrprotocols(johnm.s.bartlett和davidstirling.totowa,n.j.:humanapress,2003)”一書(shū)之描述。以質(zhì)粒pr-sc-t42d(實(shí)施例3)為模板，將氨基酸序列中第126位的谷氨酰胺(q)突變?yōu)楸奖彼?f)，獲得突變體sc-t42dq126f。具體而言，以質(zhì)粒pr-sc-t42d為模板，用引物sf和126fr擴(kuò)增模板片段42d126f1；用引物126ff和sr擴(kuò)增模板片段42d126f2，pcr反應(yīng)條件為：1μgpr-sc-t42d，0.1μg引物(sf+126fr)(擴(kuò)增模板片段42d126f1)，或0.1μg引物(126ff+sr)(擴(kuò)增模板片段42d126f2)，5μl10x緩沖液(200mmtris-hcl(ph8.0)，100mmkcl,100mm(nh4)2so4,20mmmgso4,1％tritonx-100),4％dmso，4μl2.5mmdntp,1ulataq聚合酶(takara)，用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。pcr反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?6℃5分鐘，30個(gè)循環(huán)：94℃45秒、53℃45秒和72℃60秒，最后72℃10分鐘。擴(kuò)增得模板片段42d126f1和模板片段42d126f2，通過(guò)1％(w/v)瓊脂糖電泳，用e.z.n.a.gelextraction試劑盒(omegabio-tekinc.)分離純化后，用引物sf和sr擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。pcr反應(yīng)條件為：50ng模板片段42d126f1和50ng模板片段42d126f2，0.1μg引物(sf+sr)，5μl10x緩沖液(200mmtris-hcl(ph8.0)，100mmkcl,100mm(nh4)2so4,20mmmgso4,1％tritonx-100),4％dmso，4μl2.5mmdntp,1ulataq聚合酶(takara)，用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。pcr反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?6℃5分鐘，30個(gè)循環(huán)：94℃45秒、53℃45秒和72℃2分鐘，最后72℃10分鐘。擴(kuò)增反應(yīng)得全長(zhǎng)突變基因，通過(guò)1％(w/v)瓊脂糖電泳，用e.z.n.a.gelextraction試劑盒(omegabio-tekinc.)提純pcr產(chǎn)物，分離純化大小為936bp的全長(zhǎng)突變基因sc-t42dq126f。用ndei+bglii(neb)對(duì)突變基因sc-t42dq126f和載體prset-kan(invitrogen)進(jìn)行酶切，通過(guò)1％(w/v)瓊脂糖電泳，用e.z.n.a.gelextraction試劑盒(omegabio-tekinc.)提純酶切產(chǎn)物，以進(jìn)行分離純化，以t4dna連接酶(neb)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌hb101(bio-rad)，在含50mg/l卡那霉素的lb平板上37℃培養(yǎng)，挑取單菌落，用dna-spinplasmiddnapurification試劑盒(intronbiotechnology)提取質(zhì)粒pr-sc-t42dq126f，經(jīng)dna測(cè)序確定序列。實(shí)施例7：青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶的酶活力測(cè)定分別用上述實(shí)施例制備的野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶質(zhì)粒和各青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21細(xì)胞(novagen公司)，在含50mg/l卡那霉素的lb平板上37℃培養(yǎng)，挑取單菌落，在3ml含50mg/l卡那霉素的lb培養(yǎng)液中在37℃、250rpm下培養(yǎng)8小時(shí)，然后取1ml接種至50ml含50mg/l卡那霉素的lb培養(yǎng)液中，在37℃、250rpm下培養(yǎng)18小時(shí)。離心收集細(xì)胞，懸浮于10mmph7.4的磷酸鈉緩沖液中，用超聲波(50w)裂解細(xì)胞，超聲時(shí)間為5秒30次，離心去除細(xì)胞碎片，取上清液為酶液。檢測(cè)各酶液中青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶的活力，并以sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定酶蛋白的表達(dá)量。具體如下：于1.5ml離心管中加入490μl底物(10mm青霉素g,20mmα-酮戊二酸鈉,4mml-抗壞血酸鈉和1.8mm七水硫酸亞鐵,6mm磷酸鈉緩沖液(ph7.5))，然后加入10μl酶液，混勻，置于200rpm30℃恒溫?fù)u床中反應(yīng)30分鐘。加入500μl甲醇中止反應(yīng)，抽取200μl上清液，加入800μl水，混勻，以hplc測(cè)定g-7-adca的含量并計(jì)算酶活力。下列表2示出了野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶與各青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體的酶活之比較。hplc測(cè)定的條件如下：hplc色譜柱：依利特高效液相色譜柱(大連依利特分析儀器有限公司，10ds-bp5μm，4.6mmx250mm)；流動(dòng)相：(a)50mm磷酸二氫鉀/磷酸氫二鉀(ph7)，6％乙腈，(b)60％乙腈；柱溫度：30℃；流速：1.0ml/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。實(shí)施例8：青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶的耐熱性測(cè)定按實(shí)施例7制備野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶酶液和各青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體酶液，于1.5ml離心管中分別加入200μl酶液。將離心管置于45℃水浴中進(jìn)行30分鐘熱處理，離心后，取上清液，按實(shí)施例7所述，測(cè)定青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶的酶活。用置于4℃、未經(jīng)熱處理的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶的酶活除經(jīng)熱處理的酶活，得到野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶與各青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體的殘余酶活，用百分比表示。用以下式子計(jì)算酶的耐熱性增加百分比。下列表3示出野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶和各青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體在熱處理后的殘余酶活。實(shí)施例9：以青霉素g為底物制備g-7-adca將終濃度分別為10mm的青霉素g,20mm哦α-酮戊二酸鈉，4mm的l-抗壞血酸鈉和1.8mm的七水硫酸亞鐵溶解于90ml6mmph7.4的磷酸鈉緩沖液中。用1m氫氧化鈉溶液調(diào)至ph6，加入10ml酶液。置于磁力攪拌器上高速攪拌,于30℃,ph6.4反應(yīng)150分鐘。于30、60、90、120和150分鐘的時(shí)間點(diǎn)分別抽取500μl反應(yīng)液，與500μl甲醇混勻以中止反應(yīng)。以13000rpm離心1分鐘，抽取200μl上清液并混勻800μl水，以hplc測(cè)定g-7-adca的濃度。hplc測(cè)定的條件如下：hplc色譜柱：依利特高效液相色譜柱(大連依利特分析儀器有限公司，10ds-bp5μm，4.6mmx250mm)；流動(dòng)相：(a)50mm磷酸二氫鉀/磷酸氫二鉀(ph7)，6％乙腈，(b)60％乙腈；柱溫度：30℃；流速：1.0ml/分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。本發(fā)明不受上述具體文字描述的限制，本發(fā)明可在權(quán)利要求書(shū)所概括的范圍內(nèi)做各種修改或改變。這些改變均在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。表1表2野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶與突變體的酶活比較序列表序列編號(hào)酶的名稱酶活(％)seqidno.:2野生型100seqidno.:5sc-t42c120seqidno.:6sc-t42d160seqidno.:7sc-t42e150seqidno.:8sc-t42m130seqidno.:9sc-t42p120seqidno.:10sc-t42q140seqidno.:11sc-t42r120seqidno.:12sc-q126a210seqidno.:13sc-q126f260seqidno.:14sc-q126i200seqidno.:15sc-q126l180seqidno.:16sc-q126m220seqidno.:17sc-q126n150seqidno.:18sc-q126w120seqidno.:19sc-q126y240seqidno.:20sc-t42dq126f300表3熱處理后野生型青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶與突變體的殘余酶活當(dāng)前第1頁(yè)12