本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株流行性腹瀉病毒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉（porcineepidemicdiarrhea，ped）是一種急性高度接觸性腸道傳染病，由豬流行性腹瀉病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，pedv）引起，其臨床特征為水樣腹瀉、嘔吐和脫水。各日齡的豬均易感，尤其是哺乳仔豬。ped在世界范圍內(nèi)廣泛分布，英國(guó)、比利時(shí)、法國(guó)、匈牙利、加拿大等國(guó)相繼報(bào)道了本病的發(fā)生。據(jù)報(bào)道，ped近幾年在亞洲國(guó)家發(fā)生相當(dāng)嚴(yán)重，日本、韓國(guó)、泰國(guó)均出現(xiàn)過(guò)大流行，并且死亡率高，危害嚴(yán)重，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前還沒(méi)有治療豬流行性腹瀉的特效藥物，常規(guī)治療效果不佳，因此現(xiàn)在仍以疫苗預(yù)防為主，雖然目前已有豬流行性腹瀉的商業(yè)疫苗用于豬群，但是該病毒還是出現(xiàn)在了免疫豬群中，給該病的預(yù)防帶來(lái)了極大的困難，因此尋找一個(gè)新的具有較高免疫原性的毒株對(duì)于豬流行性腹瀉預(yù)防措施及診斷方法的研制有重大的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)在豬流行性腹瀉疾病防控中的問(wèn)題，提供一株最新的豬流行性腹瀉病毒。

本發(fā)明還提供上述豬流行性腹瀉病毒株的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明還提供上述豬流行性腹瀉病毒株的應(yīng)用。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種豬流行性腹瀉病毒，該病毒的分類命名為豬流行性腹瀉病毒，拉丁文學(xué)名為porcineepidemicdiarrheavirus（pedv），名稱為pedv/ch/nb/2014，該病毒已于2016年2月18日典藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101，保藏編號(hào)cgmccno.12041。

上述豬流行性腹瀉病毒，其病毒纖突蛋白s基因的核苷酸序列如seqidno：1所示；orf3基因的核苷酸序列如seqidno：10所示；囊膜蛋白m基因的核苷酸序列如seqidno：13所示；核衣殼蛋白n基因的核苷酸序列如seqidno：16所示。

上述豬流行性腹瀉病毒的培養(yǎng)方法，步驟如下：

1）用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)vero細(xì)胞使之形成細(xì)胞單層；

2）將單層的vero細(xì)胞的生長(zhǎng)液棄掉，用pbs洗滌細(xì)胞3次，加入1-5%豬流行性腹瀉病毒液，37℃和5%濃度co2條件下感作1.5h，每隔20min搖動(dòng)一次，吸附完畢后棄掉吸附液，加入含有濃度2%胎牛血清的dmem作為維持液，37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)；

3）連續(xù)培養(yǎng)至第7天或者出現(xiàn)70-80%細(xì)胞病變時(shí)收毒，將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次，取細(xì)胞培養(yǎng)物做種毒進(jìn)行下一輪傳代。

上述培養(yǎng)方法中，所述細(xì)胞培養(yǎng)液為培養(yǎng)vero細(xì)胞系的常用培養(yǎng)液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明的pedv/ch/nb/2014毒株可在vero細(xì)胞中高效增殖，病毒滴度可以達(dá)到108.0tcid50/ml，無(wú)外源病毒污染；

2、本發(fā)明的pedv/ch/nb/2014毒株對(duì)仔豬具有較強(qiáng)的致病力，病毒滴度100tcid50時(shí)即能引起仔豬發(fā)病，具有良好的免疫原性；

3、本發(fā)明的pedv/ch/nb/2014毒株與cv777毒株s基因的同源性只有94%，s蛋白在病毒侵入宿主細(xì)胞上起著關(guān)鍵性的作用，并且是主要的中和介導(dǎo)抗原決定部位，因此s蛋白作為發(fā)展pedv疫苗的首選目標(biāo)，pedv/ch/nb/2014毒株的成功分離及其穩(wěn)定傳代對(duì)新疫苗的開(kāi)發(fā)具有重要作用。本發(fā)明不僅對(duì)我國(guó)豬流行性腹瀉病毒毒種保存是一種補(bǔ)充，對(duì)研究不同同pedv毒株和流性毒株之間關(guān)系，該病引起的疾病診斷，感染檢測(cè)體系完善和所致疾病流行的控制等有重要的作用。

附圖說(shuō)明

圖1：病料的rt-pcr檢測(cè)結(jié)果電泳照片，其中m：dl2000marker；1-7：陽(yáng)性病料；8：陰性病料；9：陰性對(duì)照；10：陽(yáng)性對(duì)照。

圖2：vero細(xì)胞感染pedv后的病變照片（20×倍數(shù)），其中2-1:正常細(xì)胞對(duì)照；2-2:病料傳至第5代時(shí)，vero細(xì)胞感染病毒48h后的病變照片，細(xì)胞圓縮，聚堆，單個(gè)細(xì)胞死亡，拉絲，脫落。

圖3：rt-pcr檢測(cè)不同代次的pedv/ch/nb/2014病毒培養(yǎng)物，1：陽(yáng)性對(duì)照2：陰性對(duì)照；3-7：第5、10、15、20、25代細(xì)胞培養(yǎng)上清。

圖4：pedv/ch/nb/2014毒株感染vero細(xì)胞的透射電鏡照片，箭頭指示為病毒顆粒。

圖5：間接免疫熒光鑒定照片，其中5-1：陰性對(duì)照；5-2：pedv/ch/nb/2014感染vero細(xì)胞的結(jié)果。

圖6：pedv/ch/nb/2014分離株s基因系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能更好地理解本發(fā)明并予以實(shí)施，但實(shí)施例并不作為本發(fā)明的限定。

具體實(shí)施方式1：病毒的分離與培養(yǎng)

浙江省寧波市某豬場(chǎng)送檢腹瀉仔豬小腸，取其腸壁及內(nèi)容物，用rt-pcr方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為豬流行性腹瀉抗原陽(yáng)性，獲得了豬流行性腹瀉病毒pedv/ch/nb/2014（圖1）。

取送檢小腸適量，刮取腸粘膜和內(nèi)容物，按照1:5的比例（重量:體積）加入生理鹽水，研磨，反復(fù)凍融3次，8000r/min離心10min，取上清液，0.22μm濾膜過(guò)濾，所得病料處理液分裝并于-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)vero細(xì)胞使之形成細(xì)胞單層，將單層的vero細(xì)胞的生長(zhǎng)液棄掉，用pbs洗滌細(xì)胞3次，加入1-5%豬流行性腹瀉病毒液，37℃和5%濃度co2條件下感作1.5h，每隔20min搖動(dòng)一次，吸附完畢后棄掉吸附液，加入含有濃度2%胎牛血清的dmem作為維持液，37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)。如此操作盲傳至第10代，觀察是否產(chǎn)生cpe。同時(shí)設(shè)置空白細(xì)胞作為對(duì)照。

盲傳傳至第2代時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)輕微的cpe變化，傳至第10代時(shí)則出現(xiàn)明顯、穩(wěn)定的cpe變化，細(xì)胞圓縮，聚堆，單個(gè)細(xì)胞死亡，拉絲，脫落（圖2）。

具體實(shí)施方式2：細(xì)胞培養(yǎng)物的rt-pcr檢測(cè)

pedv/ch/nb/20145、10、15、20、25代次細(xì)胞培養(yǎng)物分別取250μl，使用omega公司生產(chǎn)的totalrnakitii試劑盒提取rna。提取后的rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：6μl的rna與1μloligo(dt)混合均勻，70℃10min，迅速冰浴2min。向該混合液中加入2μl5×buffer，0.5μl10mm的dntpmix，0.25μlmlv反轉(zhuǎn)錄酶及0.25μlrnaseinhibitor。混勻后按如下條件反應(yīng)：42℃，60min；70℃，15min。

反轉(zhuǎn)錄后的cdna用以下引物進(jìn)行pcr，擴(kuò)增n基因，上游引物nf：5’cggttctcacagatagtgag3’，seqidno：17；下游引物nr：5’cgctagaaaaacactcagtaat3’，seqidno：18。反應(yīng)體系為：cdna1μl，2×taqmix12.5μl，10μm/ml的上下游引物各0.5μl，補(bǔ)加去離子水至25μl，混合均勻。同時(shí)設(shè)水陰性對(duì)照和cv777毒株陽(yáng)性對(duì)照。pcr反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

取10μlpcr產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，可見(jiàn)pedv/ch/nb/2014不同代次細(xì)胞培養(yǎng)物樣品均檢測(cè)到陽(yáng)性條帶。

具體實(shí)施方式3：病毒滴度檢測(cè)

采用微量滴定法測(cè)定pedv/ch/nb/2014病毒毒價(jià)，采用方法如下：采用vero細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)vero細(xì)胞，將病毒用不加血清的dmem從10-1倍比稀釋至10-10，分別將每個(gè)稀釋度的100μl病毒液接種到鋪滿vero細(xì)胞的培養(yǎng)孔，每個(gè)稀釋度接種8孔，同時(shí)設(shè)置陰性細(xì)胞對(duì)照孔。置37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4-6天觀察細(xì)胞感染病毒情況，計(jì)算病毒滴度，最高病毒毒價(jià)可達(dá)108.5tcid50/ml。

具體實(shí)施方式4：動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)

取tgev、pedv中和抗體均小于1:8的母豬所產(chǎn)的3日齡仔豬5頭，每頭口服pedv/ch/nb/2014病毒第5代103個(gè)tcid50，觀察7日，統(tǒng)計(jì)接種豬的發(fā)病情況，對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行剖檢，觀察病理變化。取發(fā)病豬腸粘膜和內(nèi)容物，提取rna，按實(shí)施例第二步提到的檢測(cè)n基因設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行rt-pcr檢測(cè)，并將pcr產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果5頭仔豬全部發(fā)病，發(fā)病率為100%，5頭仔豬死亡，死亡率為100%，發(fā)病豬表現(xiàn)為腹瀉，脫水，個(gè)別豬出現(xiàn)嘔吐，剖檢觀察發(fā)現(xiàn)胃和小腸出現(xiàn)典型的病理變化。從發(fā)病豬的腸粘膜及內(nèi)容物中可擴(kuò)增出1326bp的片段，經(jīng)序列分析為pedvn基因。

具體實(shí)施方式5：電鏡鑒定

將pedv/ch/nb/2014病毒感染vero細(xì)胞單層后，分別于24h、36h和48h時(shí)，用細(xì)胞刮收取細(xì)胞，800r/min離心后，收集細(xì)胞并用2.5%戊二醛電鏡固定液固定，制作超薄切片并用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，電子顯微鏡觀察病毒形態(tài)，見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示感染pedv/ch/nb/2014的vero細(xì)胞中能檢測(cè)到典型pedv病毒粒子，表明pedv/ch/nb/2014病毒在vero細(xì)胞中穩(wěn)定增殖。

具體實(shí)施方式6：間接免疫熒光檢測(cè)

于12孔板培養(yǎng)vero細(xì)胞，長(zhǎng)至單層后接種pedv/ch/nb/2014第5代病毒培養(yǎng)物，同時(shí)設(shè)立不接毒的vero細(xì)胞作陰性對(duì)照，以及接種cv777毒株的陽(yáng)性對(duì)照。培養(yǎng)36h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，輕輕吸棄培養(yǎng)液，用4℃預(yù)冷的pbs洗滌細(xì)胞3次。每孔加入500μl-20℃預(yù)冷的丙酮，將培養(yǎng)板置4℃冰箱固定15min。pbs洗滌3次，每次5min。每孔加入500μl5%的脫脂奶粉封閉30min。棄掉脫脂奶粉，用pbs輕輕洗滌2次，每次3min。向孔內(nèi)滴加適當(dāng)稀釋后的一抗（鼠抗pedv6c8單克隆抗體（bionote，seoul，korea））各200μl，于37℃作用1h。pbs洗滌3次，每次5min；滴加fitc（異硫氰酸熒光素）標(biāo)記的山羊抗鼠igg二抗（1：20000），37℃作用30min，pbs洗滌3次，每次5min。每孔加入500μlpbs，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需設(shè)置只加一抗不加二抗和只加二抗不加一抗的陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照孔均無(wú)熒光；陽(yáng)性對(duì)照孔及接種pedv/ch/nb/2014的孔均在細(xì)胞漿中呈現(xiàn)綠色熒光；只加一抗和只加二抗的陰性對(duì)照孔沒(méi)有綠色熒光背景。說(shuō)明所分離到的病毒是豬流行性腹瀉病毒，結(jié)果見(jiàn)圖5，表明分離株pedv/ch/nb/2014具有良好的抗原性。

具體實(shí)施方式7：s、orf3、m、n基因序列測(cè)定

取250μlpedv/ch/nb/2014第5代vero細(xì)胞培養(yǎng)物提取rna，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及pcr擴(kuò)增（rna提取和反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件同上述步驟2）。反轉(zhuǎn)錄后的cdna用下述引物進(jìn)行pcr：分段擴(kuò)增s基因，引物s1f5’tagtgatgttgtgttag3’，見(jiàn)seqidno:2；s1r5’cgctgcacagcagctc3’，seqidno:3；s2f5’cataccagaaggttttag3’，見(jiàn)seqidno:4；s2r5’gtaatcaactcaccctt3’，見(jiàn)seqidno:5；s3f5’ttaccctgagtttggtagtg3’，見(jiàn)seqidno:6；s3r5’tccgtctgtagagcaagat3’，見(jiàn)seqidno:7；s4f5’cttcacatgtatagtgcgtct3’，見(jiàn)seqidno:8；s4r5’cagactttgagacatctttgac3’，見(jiàn)seqidno:9。擴(kuò)增orf3基因，引物orf3f5’ctagacttcaaccttacgaa3’，見(jiàn)seqidno:11；orf3r5’tactagaccattatcattcact3’，見(jiàn)seqidno:12。擴(kuò)增m基因，引物mf5’actgttattgacgtataaacg3’,見(jiàn)seqidno:14；mr5’atgaagcactttctcactatc3’，見(jiàn)seqidno:15。擴(kuò)增n基因，引物nf5’cggttctcacagatagtgaga3’，見(jiàn)seqidno:17；nr5’cgctagaaaaacactcagtaat3’，見(jiàn)seqidno:18。pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，56℃退火40s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。將pcr產(chǎn)物送諾塞基因公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果：s基因拼接后全長(zhǎng)為4161bp，見(jiàn)seqidno:1；orf3基因全長(zhǎng)675bp，見(jiàn)seqidno:10；m基因661bp（非全長(zhǎng)），見(jiàn)seqidno:13；n基因全長(zhǎng)1326bp，見(jiàn)seqidno:16。

具體實(shí)施方式8：s基因進(jìn)化分析

利用dnastar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，pedv/ch/nb/2014與美國(guó)分離株usa/colorado/2013構(gòu)成一新的分支，與我國(guó)報(bào)道株pedv/ch/bj/2014、fj-zp-2014、bj-2012及zj-2011-2同源性較高；與經(jīng)典參考株如比利時(shí)cv777毒株、韓國(guó)dr13毒株、日本kpedv-9毒株等相比，不在同一進(jìn)化分支上，已經(jīng)發(fā)生了明顯的變異，表明我國(guó)及美國(guó)最新流行的pedv野毒株發(fā)生了明顯的變異，結(jié)果見(jiàn)圖6。

所述毒株可以應(yīng)用于制備豬流行性腹瀉病毒治療感染藥物中，制備豬流行性腹瀉病毒診斷試劑中或者制備豬流行性腹瀉病毒疫苗中。

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<110>北京偉嘉人生物技術(shù)有限公司

<120>一株豬流行性腹瀉病毒的分離培養(yǎng)與應(yīng)用

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