本發(fā)明涉及一種抗豬瘟病毒的雙峰駝vhh重鏈抗體庫。此外，本發(fā)明還涉及到該抗體文庫的構(gòu)建方法、庫容量鑒定和用途。本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：豬瘟(classicalswinefever,csf)是由豬瘟病毒(classicalswinefevervirus,csfv)引起豬的烈性傳染病。csfv是有囊膜的單股正鏈rna病毒,屬于黃病毒科(flaviridae),瘟病毒屬(pestivirus)。豬瘟是危害豬的最主要的傳染病之一，全世界40多個國家存在該病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。免疫預(yù)防是多數(shù)豬瘟嚴(yán)重國家采用的主要技術(shù)手段，我國的疫苗免疫率就高達(dá)95％以上。迄今為止，獲得成功的豬瘟疫苗都是經(jīng)人工馴化而來的致弱毒株，其中最著名的有三個品系，分別是中國的c株、日本的gpe株和法國的thviervaal株，其中以中國的c株應(yīng)用最廣泛。由于疫苗的廣泛應(yīng)用，有效地控制了豬瘟的大流行，減少了急性死亡。但從上世紀(jì)80年代以后，臨床癥狀不典型且病程變長的非典型性豬瘟(或慢性豬瘟)成為該病的主要發(fā)生形式，持續(xù)感染普遍存在，疫苗的預(yù)防效果明顯下降，使豬瘟防制遇到了新的困難，必需力求一種新型的研究技術(shù)或手段以用于豬瘟的防控。1993年hamers等報道，駱駝血液中的抗體有一半天然缺失輕鏈和重鏈恒定區(qū)1(ch1)，克隆這種抗體重鏈的可變區(qū)，構(gòu)建僅由一個重鏈可變區(qū)組成的單域抗體(variabledomainofheavychainofheavy2chainantibody，vhh)，現(xiàn)已被重新命名為“納米抗體”(nanobody)，它是具有完整功能的最小的抗原結(jié)合片段。納米抗體從發(fā)現(xiàn)至今，已經(jīng)發(fā)展為有廣泛生物應(yīng)用價值和臨床應(yīng)用價值的高度通用分子。納米抗體具有高度穩(wěn)定性和與抗原結(jié)合的高親合力，能與蛋白裂隙和酶活性位點(diǎn)的相互作用，其作用類似于抑制劑。因此，納米抗體可以為從肽模擬藥物設(shè)計小分子酶抑制物提供新的思路。由于僅有重鏈，納米抗體的制造較mab容易。納米抗體的獨(dú)特性質(zhì)，如處于極端溫度和ph環(huán)境中的穩(wěn)定性，還具有常規(guī)單域抗體無法比擬的水溶性和構(gòu)象穩(wěn)定性。這種單體結(jié)構(gòu)域能高特異性、高親和力地與抗原結(jié)合，從而中和或封閉相對隱蔽的抗原表位。憑借以上特性納米抗體與普通單域抗體相比有很大 優(yōu)勢。納米抗體是目前可以得到的具有完整功能、穩(wěn)定、可結(jié)合抗原的最小單元，由于相對分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、可溶性好、抗原結(jié)合性能好、易表達(dá)及免疫原性低等特點(diǎn)成為當(dāng)前分子影像研究中的重要靶分子，這為工程化抗體提供了一個良好的來源，具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，納米抗體在疾病的治療和診斷中具有很大的價值。因此，綜合目前在抗體領(lǐng)域的研究和利用情況，不難發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)抗體類藥物仍面臨著挑戰(zhàn)，有必要設(shè)計和生產(chǎn)新一代更有效的抗體分子以滿足臨床的需要。特別是如何實(shí)現(xiàn)抗體小型化，使其高效作用于特定部位。為此，實(shí)現(xiàn)抗體小型化靶向癌細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子或者其他靶細(xì)胞一直是抗體工程與抗癌研究的重要目標(biāo)和研究熱點(diǎn)?？贵w庫的容量和多樣性很大程度上影響從中淘選出特異性抗體的概率以及抗體的親和力。自1976年構(gòu)建的第一個cdna文庫以來，其方法不斷的改進(jìn)，其中smart(switchingmechanismat5’endofthernatranscript)方法構(gòu)建的cdna文庫能夠代表原有樣品中mrna的豐度，保持了生物遺傳信息的完整性。而且該方法只需要25ng的mrna或者50ng的totalrna就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cdna庫，更重要的是得到的cdna能夠代表原有樣品中的mrna的豐度，可以應(yīng)用于直接擴(kuò)增基因、構(gòu)建cdna文庫。綜上所述，通過建立抗體庫篩選具有csfv特異性、生物學(xué)活性好、結(jié)合抗原能力強(qiáng)、具有潛在中和功能的抗體，尤其是納米抗體之類的新型抗體，對于建立敏感的csfv的臨床診斷方法，研究病毒的感染機(jī)理具有極其重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種抗豬瘟病毒vhh抗體的酵母cdna文庫及其構(gòu)建方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：本發(fā)明的一種抗豬瘟病毒vhh抗體的酵母cdna文庫的構(gòu)建方法，其包括以下步驟：(1)淋巴細(xì)胞分離從豬瘟c株弱毒疫苗免疫的駱駝的外周血中分離得到淋巴細(xì)胞，保存?zhèn)溆茫?2)淋巴細(xì)胞總mrna的提取提取步驟(1)分離得到的淋巴細(xì)胞的總mrna；(3)全基因cdna合成以步驟(2)提取的淋巴細(xì)胞的總mrna為模板，合成全基因cdna；(4)第一輪擴(kuò)增以步驟(3)合成的全基因cdna為模板，以p1、r1為引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃1min；95℃15s，68℃5min，20個循環(huán)；68℃5min，將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，純化收集600bp產(chǎn)物，-20℃保存?zhèn)溆茫籶1:5-gtcctggctgctcttctacaagg-3r1:5-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3(5)第二輪擴(kuò)增以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以p2、r2為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃1min；95℃15s，68℃5min，20個循環(huán)；68℃5min；擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，純化收集400bp產(chǎn)物，置-20℃保存?zhèn)溆?；p2:5-ttccacccaagcagtggtatcaacgcagagtgggagtctgggggagg-3r2:5-gtatcgatgcccaccctctagaggccgaggcggccgacatggagacggtgacctgggt-3(6)文庫的構(gòu)建和收獲制備酵母感受態(tài)細(xì)胞，每600ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化20ul第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物和6ulpgadt7-rec載體，將轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布于sd/-leu平板上，30℃倒置培養(yǎng)3-5d直至克隆出現(xiàn)；再次將平板置于4℃冰箱，放置3-4h，給每塊平板加入含25％(v/v)甘油的ypda液體培養(yǎng)基，并加入無菌玻璃珠，水平方向反復(fù)搖動，之后收集菌液，即得抗豬瘟病毒vhh抗體的酵母cdna文庫。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的淋巴細(xì)胞分離是采用駱駝外周血淋巴細(xì)胞的分離試劑盒(產(chǎn)品編號：lts1076，購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)按照以下步驟進(jìn)行：(1)豬瘟c株弱毒疫苗免疫的駱駝的抗凝血中加入等體積量的樣本稀釋液，混勻，得到抗凝血的稀釋液；(2)按照樣本稀釋液與淋巴細(xì)胞分離液體積比為5:9的比例，量取淋巴細(xì)胞分離液，之后先慢后快加入抗凝血的稀釋液，水平離心機(jī)1800rpm，18-22℃離心20min；(3)小心收集淋巴細(xì)胞層于新的收集管，以5倍量細(xì)胞洗滌液稀釋，水平離心機(jī)1000rpm，18-22℃離心10min；棄上清，沉淀再用細(xì)胞洗滌液稀釋，水平離心 機(jī)1000rpm，18-22℃離心10min；沉淀用5ml無rna酶水重懸，隨即加入45mlrpim-1640培養(yǎng)液混勻，1000rpm，18-22℃離心10min，沉淀即為淋巴細(xì)胞，并將其重懸于rnalater保存液中，置-70℃保存?zhèn)溆?。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的淋巴細(xì)胞總mrna的提取按照以下方法進(jìn)行：吸取步驟(1)分離得到的淋巴細(xì)胞液400ul，加入1mltrizol，混勻，4℃靜置5min；加入200ul三氯甲烷，混勻，室溫靜置3min，12000r/min，4℃離心15min；吸取750ul上清，加等量異丙醇，室溫靜置10min，10000r/min，4℃離心10min；輕棄上清，沉淀加75％乙醇，8000r/min，4℃，離心5min；沉淀置通風(fēng)櫥10min使之干燥；20ul無rna酶的水溶解的沉淀即為收獲的總mrna。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的全基因cdna合成是采用smartcdna文庫構(gòu)建試劑盒，在0.2ml的pcr擴(kuò)增管中依次加入下列組分：mrna3ulsmart1ulcdsⅲ1ul混勻后，將離心管放置于72℃金屬浴，孵育2min，立即置冰上，冷卻2min，然后再依次加入下列組分：混勻后，將離心管放置于42℃金屬浴，反轉(zhuǎn)錄1h，室溫冷卻，加入1μlrna酶h(2u/ul)，得到的產(chǎn)物為全基因組cdna，置-20℃保存?zhèn)溆?。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的第一輪擴(kuò)增是采用smartcdna文庫構(gòu)建試劑盒，在0.2ml的pcr擴(kuò)增管中依次加入下列組分：在步驟(4)所述擴(kuò)增程序下進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，純化收集600bp產(chǎn)物，-20℃保存?zhèn)溆?。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的第二輪擴(kuò)增是采用smartcdna文庫構(gòu)建試劑盒，在0.2ml的pcr擴(kuò)增管中依次加入下列組分：在步驟(5)所述擴(kuò)增程序下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，凝膠回收試劑盒從凝膠中純化收集400bp產(chǎn)物，置-20℃保存?zhèn)溆?。在本發(fā)明中，以上涉及cdna合成所采用的試劑盒為smartcdna文庫構(gòu)建試劑盒(產(chǎn)品編號：634901，購自寶生物公司)。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了按照以上任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建得到的抗豬瘟病毒vhh抗體的酵母cdna文庫。在本發(fā)明中，所述的文庫中cdna分布在400-2000bp之間，滴度為5.5×106cfu/ml，重組率為100％。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的抗豬瘟病毒vhh抗體的酵母cdna文庫在篩選抗豬瘟病毒vhh抗體中的用途。本發(fā)明發(fā)明人對所構(gòu)建的抗豬瘟病毒vhh抗體的酵母cdna文庫的容量及多態(tài)性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明該文庫滴度約為5.5×106cfu/ml。從sd/-leu平板上隨機(jī)挑取16個克隆進(jìn)行菌落pcr，電泳結(jié)果顯示文庫插入片段均不同，分布在400-2000bp之間(圖4)，平均插入片段約為1000bp，說明所構(gòu)建的文庫的多樣性好。由菌落pcr結(jié)果可以得知文庫的重組率為100％。采用血凝抑制試驗(yàn)對抗豬瘟病毒vhh抗體的酵母cdna文庫進(jìn)行初步功能性鑒定，表明所構(gòu)建的酵母文庫中存在具有中和活性的抗豬瘟病毒vhh抗體。本發(fā)明的提出為篩選抗豬瘟病毒vhh抗體提供了平臺，并且為豬瘟的早期治療和診斷提供了新的技術(shù)手段。附圖說明圖1為駱駝外周血淋巴細(xì)胞總rna電泳圖；m.dl5000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.駱駝外周血淋巴細(xì)胞總rna；圖2為駱駝外周血淋巴細(xì)胞dscdna第二輪擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖；m.dl2000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.第一輪擴(kuò)增dsdna，600bp；圖3為駱駝外周血淋巴細(xì)胞dscdna第二輪擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖；m.dl2000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.第二輪擴(kuò)增dsdna，400bp；圖4為駱駝外周血淋巴細(xì)胞酵母雙雜交cdna文庫單克隆pcr擴(kuò)增結(jié)果；m.dl5000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-16:酵母菌落的pcr結(jié)果。圖5為抗豬瘟病毒的vhh基因的pcr擴(kuò)增結(jié)果；m:dl200dna分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1,2：vhhpcr擴(kuò)增產(chǎn)物圖6為表達(dá)載體pgex-4t-vhh的雙酶切鑒定結(jié)果；m.dl5000dna分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1,2,3:pgex-4t-vhh雙酶切產(chǎn)物；圖7為vhh基因的表達(dá)結(jié)果。m：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1,2：抗豬瘟vhh抗體表達(dá)純化產(chǎn)物。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1抗豬瘟病毒vhh抗體的酵母cdna文庫的構(gòu)建1.材料與方法1.1材料1.1.1試驗(yàn)動物、抗原、佐劑和豬瘟病毒抗體檢測試劑盒1峰雄性雙峰駝(1周歲)，1峰雌性雙峰駝(6個月大)；豬瘟c株弱毒疫苗，csfv抗體elisa檢測試劑盒購自idexx。1.1.2菌株和試劑酵母文庫相關(guān)載體購自clontech，限制性內(nèi)切酶購自neb、駱駝外周血淋巴細(xì)胞的分離試劑盒(產(chǎn)品編號：lts1076)購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公 司、trizol、鎳親和層析樹脂、dna片段回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒為omega產(chǎn)品、smartcdna文庫構(gòu)建試劑盒(產(chǎn)品編號：634901)以及pcr相關(guān)試劑購自寶生物公司、分子生物學(xué)試劑來自sigma公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2方法1.2.1抗原接種劑量、免疫程序和血清抗體效價的測定在雙峰駝的頸部皮下、背部皮下和后腿皮下進(jìn)行分點(diǎn)接種豬瘟c株弱毒疫苗，每個部位不少3個接種點(diǎn)。首次免疫前和每次免疫后采集靜脈血，用csfv抗體elisa檢測試劑盒檢測血清抗體效價，檢測抗體阻斷率大于70％時靜脈采血。具體動物免疫程序和抗原接種劑量見表1：表1雙峰駝免疫程序和抗原劑量1.2.2淋巴細(xì)胞分離測定抗體效價達(dá)到要求后，頸靜脈采集駱駝抗凝血100ml。淋巴細(xì)胞分離按照天津?yàn)髏bd駱駝外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒操作說明進(jìn)行，具體為：向采集的抗凝血中加入等量的樣本稀釋液，混勻；按照樣本稀釋液與淋巴細(xì)胞分離液體積比為5:9的比例，量取淋巴細(xì)胞分離液，之后先慢后快加入稀釋好的抗凝血，水平離心機(jī)1800rpm，18-22℃離心20min；小心收集淋巴細(xì)胞層于新的收集管，以5倍量細(xì)胞洗滌液稀釋之，水平離心機(jī)1000rpm，18-22℃離心10min；棄上清，沉淀再用細(xì)胞洗滌液稀釋，水平離心機(jī)1000rpm，18-22℃，離心10min；棄上清，沉淀即為分離到的淋巴細(xì)胞，取懸浮細(xì)胞上清液并且計數(shù)后并懸浮于rna保存液(rnalater)中，置-70℃保存?zhèn)溆谩?.2.3淋巴細(xì)胞總mrna的提取吸取上述淋巴細(xì)胞液400ul，加入1mltrizol，混勻，4℃靜置5min；加入200ul三氯甲烷，混勻，室溫靜置3min，12000r/min，4℃離心15min；吸取750ul上清，加等量異丙醇，室溫靜置10min，10000r/min，4℃離心10min；輕棄上清，沉淀加75％乙醇，8000r/min，4℃離心5min；沉淀置通風(fēng)櫥10min使之干燥；20ul無rna酶的水溶解的沉淀即為收獲的總mrna。1.2.4文庫制備引物的設(shè)計第一輪擴(kuò)增引物：p1:5-gtcctggctgctcttctacaagg-3r1:5-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3第二輪擴(kuò)增引物：p2:5-ttccacccaagcagtggtatcaacgcagagtgggagtctgggggagg-3r2:5-gtatcgatgcccaccctctagaggccgaggcggccgacatggagacggtgacctgggt-31.2.5cdna合成雙鏈及純化1.2.5.1全基因cdna合成在0.2ml的pcr擴(kuò)增管中依次加入下列組分：混勻，將離心管放置于72℃金屬浴，孵育2min，立即置冰上，冷卻2min，依次加入下列組分：混勻，將離心管放置于42℃金屬浴，反轉(zhuǎn)錄1h，室溫冷卻，加入1μlrna酶h(2u/ul)，得到的產(chǎn)物為全基因組cdna，置-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.5.2第一輪擴(kuò)增在0.2ml的pcr擴(kuò)增管中依次加入下列組分：上述擴(kuò)增程序:95℃1min；95℃15s，68℃5min，20個循環(huán)；68℃5min。將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，采用凝膠回收試劑盒從凝膠中純化收集600bp產(chǎn)物，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.5.3第二輪擴(kuò)增在0.2ml的pcr擴(kuò)增管中依次加入下列組分：上述擴(kuò)增程序:95℃1min；95℃15s，68℃5min，20個循環(huán)；68℃5min。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，采用凝膠回收試劑盒從凝膠中純化收集400bp產(chǎn)物，置-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.7文庫的構(gòu)建和收獲采用peg/liac法制備酵母y187感受態(tài)細(xì)胞。每600ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化20ul雙鏈cdna和6ulpgadt7-rec，將轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布于直徑100mm的和150mm的sd/-leu平板上，30℃倒置培養(yǎng)3-5d直至克隆出現(xiàn)。再次將平板置于4℃冰箱，放置3-4h。給每塊平板加入5ml凍存液(ypda液體培養(yǎng)基含25％甘油)，并加入無菌玻璃珠，水平方向反復(fù)搖動，之后收集菌液。1.2.8文庫的質(zhì)量評價取共轉(zhuǎn)化產(chǎn)物菌液，按1/10、1/100和1/1000稀釋，分別涂100ul稀釋液至100mmsd/-leu平板，30℃倒置培養(yǎng)3-5d直至克隆出現(xiàn)，此時對生長的單菌落計數(shù)，并計算文庫容量。隨機(jī)挑取16個單菌落，用pgadt-rec通用測序引物進(jìn)行菌落pcr，分析文庫插入片段的大小以及重組率。pcr反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取7ulpcr產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析。2.結(jié)果2.1駱駝外周血淋巴細(xì)胞總rna的提取及mrna的分離純化提取的總rna經(jīng)紫外分光光度計測定，濃度為4329ng/ul，od260/od280為1.98。變性瓊脂糖凝膠電泳可見28s、18s、5s3條清晰帶，28s:18s約為2:1。說明rna和mrna純度較高，滿足文庫構(gòu)建的需要(圖1)。2.2雙鏈cdna文庫的瓊脂糖凝膠電泳取第一輪擴(kuò)增的dscdna產(chǎn)物進(jìn)行電泳，收集600bp條帶。取第二輪擴(kuò)增的dscdna產(chǎn)物進(jìn)行電泳，收集400bp條帶。如圖2、圖3所示。2.3文庫容量及多態(tài)性鑒定對涂布不同稀釋度文庫的平板進(jìn)行單菌落計數(shù)，根據(jù)公式：文庫滴度＝平板上菌落數(shù)/平鋪菌液體積(ml)×稀釋因子，經(jīng)計算pgadt7-rec文庫滴度約為5.5×106cfu/ml。從sd/-leu平板上隨機(jī)挑取16個克隆進(jìn)行菌落pcr，電泳結(jié)果顯示文庫插入片段均不同，分布在400-2000bp之間，平均插入片段約為1000bp，說明所構(gòu)建的文庫的多樣性較好，如圖4所示。由菌落pcr結(jié)果可以得知文庫的重組率為100％。實(shí)施例2抗豬瘟病毒vhh抗體的酵母cdna文庫在篩選抗豬瘟病毒vhh抗體中的用途1、實(shí)驗(yàn)材料及方法1.1豬瘟vhh基因的擴(kuò)增采用plasmidmidikitomega酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取實(shí)施例1中酵母文庫質(zhì)粒，同時針對vhh結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計擴(kuò)增引物，并在上下游引物的5′端分別引入ecori和xholi酶切位點(diǎn)，上游引物vf:5’-ccggaattcatgggtatcaacgcagag-3’；vr:5’-ccctcgagcatggagacggtgacc-3’，擴(kuò)增體系為50ul： 10×pcrbuffer5ul，dntp4ul，引物1ul，taq酶1ul，ddh2o39ul，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s,57℃退火40s,72℃延伸1min,共30個循環(huán)；72℃再延伸10min,4℃5min。pcr產(chǎn)物于10g/l的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。1.2vhh基因的膠回收純化按寶生物凝膠片段回收試劑盒操作進(jìn)行，具體如下：在紫外燈下將符合vhh基因大小的條帶從凝膠上切下，按0.1g膠加100ulpc液的比例加入pc，50℃水浴溶解10min至凝膠完全溶解；溶解后的膠溶液倒入平衡后的柱子，12000rmp離心1min，棄去廢液，回收柱子；在柱子中加入600ul漂洗液pw，12000rmp離心1min，棄廢液，并重復(fù)洗脫柱子一次。12000rmp空離2min，室溫放置4-5min，目的是使乙醇蒸發(fā)。將柱子放入1.5ml的ep管中，加入30μl65℃加熱過的去離子水。靜置1-2min。12000rmp離心1min，收集離心液體。1.3pgex-4t-vhh的構(gòu)建與鑒定使用ecori和xholi雙酶切，酶切pcr回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pgex-4t-1，回收純化后使用t4dna連接酶將酶切后的vhh與pgex-4t-14℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化bl21感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于氨芐抗性的lb固體平板上培養(yǎng)直到有菌落出現(xiàn)，在挑單菌落接到卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，搖床上37℃過夜培養(yǎng)，提質(zhì)粒做雙酶切鑒定并將陽性質(zhì)粒送去測序驗(yàn)證。1.4重組目的蛋白的純化將陽性菌液加入于100ml含amp的lb液體培養(yǎng)基中，加入iptg進(jìn)行誘導(dǎo),od600值不再增長時，5000r/min離心5min收獲菌體沉淀。加入10ml1×ibwashbuffer重懸沉淀，按novagen蛋白純化試劑盒說明書進(jìn)行純化，分步洗脫并收集目的蛋白洗脫液即為豬瘟vhh抗體蛋白。1.4vhh活性檢測采用idexx豬瘟抗體測試劑盒，按照操作說明書的要求對表達(dá)的vhh進(jìn)行稀釋，并對其效價進(jìn)行測定。2.結(jié)果2.1抗豬瘟病毒的vhh基因的pcr擴(kuò)增pcr產(chǎn)物經(jīng)10g/l瓊脂糖凝膠電泳檢測得到一條清晰特異性條帶，大小約400bp，與預(yù)期片段大小一致(見圖5)。這說明從構(gòu)建的酵母文庫中成功擴(kuò)增到了vhh基因。2.2表達(dá)載體pgex-4t-vhh的雙酶切分析重組質(zhì)粒用ecori和xholi限制性內(nèi)切酶雙酶切分析，得到約400bp和5000bp大小片段，與預(yù)期結(jié)果一致(見圖6)。測序結(jié)果證明vhh基因成功插入表達(dá)載體，可用于后續(xù)試驗(yàn)。2.3vhh基因的表達(dá)28℃誘導(dǎo)后出現(xiàn)1條大小為37kda的特異蛋白條帶,結(jié)果與預(yù)期相符(見圖7)，并隨誘導(dǎo)時間的延長而變濃，誘導(dǎo)后12h表達(dá)量達(dá)高峰。2.4表達(dá)的豬瘟vhh抗體活性檢測表達(dá)產(chǎn)物采用愛德士豬瘟抗體檢測試劑盒(classicalswinefevervirusantibodytestkit(csfvab))進(jìn)行活性測試。測試結(jié)果表明所表達(dá)的產(chǎn)物為抗豬瘟病毒的vhh抗體。vhh活性測試結(jié)果陽性對照陰性對照vhh1vhh2阻斷率83.92％15.26％73.09％75.89％當(dāng)前第1頁12