專利名稱：一種篩選抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選抗體的方法。
背景技術(shù)：
借助蛋白展示技術(shù)的高通量抗體篩選已經(jīng)成為現(xiàn)在抗體制備的主要方法之一。 噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)和酵母展示技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于新抗體的篩選和 抗體親和力的改進(jìn)。展示的抗體能與目的抗原結(jié)合從而被快速的從復(fù)雜的抗體文庫中 篩選出來。通常用于抗體篩選的抗原是已知的可溶性純化抗原。然而許多疾病的分子 標(biāo)記都定位于細(xì)胞膜表面，并且具有復(fù)雜的翻譯后修飾，例如糖基化(Ohtsubo K, Marth JD :Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell 2006， 126(5) :855-867.)。糖基化丟失會(huì)影響蛋白的折疊效率和穩(wěn)定性(Shental-Bechor D， Levy Y :Folding of glycoproteins toward understanding the biophysics of the glycosylation code. Curr Opin Struct Biol 2009，19 (5) :524_533·)。并且許多癌細(xì) 胞表面的糖基化都有明顯變化(Kim YJ, Varki A !Perspectives on the significance of altered glycosylation of glycoproteins in cancer. Glycoconj J 1997，14(5) 569-576.)?？墒峭ㄟ^生物工程技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)和純化的可溶性抗原通常會(huì)丟失翻譯后 修飾，無法真實(shí)反映天然抗原的構(gòu)象(Liat Binyamina HBaLMW Cancer therapy with engineered monoclonal antibodies Update on Cancer Therapeutics 2006,1 (2) 147-157. Linenberger ML,Maloney DG,Bernstein ID :Antibody_directed therapies for hematological malignancies. Trends Mol Med 2002,8(2) :69_76.)。而且有時(shí)抗原是未 知的分子，無法獲得純化的抗原。因此如果能以完整細(xì)胞為抗原篩選特異結(jié)合細(xì)胞表面抗 原的抗體，才有利于篩選到識(shí)別天然抗原表位的新抗體，將更加有利于臨床的診斷和治療。到目前為止，噬菌體展示系統(tǒng)和酵母展示系統(tǒng)都已被證明能夠直接以完整的細(xì)胞 作為抗原，篩選特異識(shí)別細(xì)胞表面抗原的抗體。但是噬菌體展示技術(shù)由于展示效率有限，不 是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達(dá)。而且在噬菌體擴(kuò)增的過程中，由于插入片 段性質(zhì)的不同，可能呈現(xiàn)出生長(zhǎng)差異，從而可能丟失文庫多樣性。此外，噬菌體展示系統(tǒng)難 以展示分子量較大的蛋白，因此不能成功展示完整的IgG抗體分子。而酵母展示技術(shù)由于 受到轉(zhuǎn)化效率的影響，很難構(gòu)建足夠大的抗體文庫。通常文庫大小< 108。細(xì)菌原生質(zhì)體展示技術(shù)(APEx) (Harvey BR, Georgiou G, Hayhurst A, Jeong KJ, Iverson BL, Rogers GK Anchored periplasmic expression, a versatile technology for the isolation of high-affinity antibodies from Escherichia coli-expressed libraries. Proc Natl Acad Sci USA 2004,101(25) :9193_9198.)是一種高效的細(xì)菌展示 技術(shù)。APEx展示技術(shù)是將蛋白質(zhì)表達(dá)定位到細(xì)菌周質(zhì)空間中，蛋白質(zhì)通過N端融合的內(nèi)膜 脂蛋白NlpA的六個(gè)氨基酸序列(CDQSSS)以共價(jià)酯化的方式錨定在內(nèi)膜外側(cè)，或者是通過 C端融合的M13噬菌體外殼蛋白3 (g3p)的N端片斷錨定在內(nèi)膜中，從而將目的蛋白展示到 周質(zhì)空間。然后可以通過EDTA和溶菌酶的作用將細(xì)菌的外膜去掉，從而將內(nèi)膜上錨定的蛋白質(zhì)暴露出來。暴露的抗體可以和熒光標(biāo)記的抗原結(jié)合從而使細(xì)菌獲得明顯的熒光。通過 流式分選可以將特異結(jié)合抗原的細(xì)菌分選出來，從而獲得相應(yīng)的抗體。APEx展示系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)。(I)APEx展示系統(tǒng)是一種細(xì)菌展示系統(tǒng)，容易構(gòu)建 巨大的抗體文庫(> IO9)。(2)錨定方式多樣，可以選擇C端或N端錨定。(3)由于抗體展 示在內(nèi)膜表面，而內(nèi)膜不含有LPS或其它復(fù)雜的多糖類等外膜的成份，表面相對(duì)平整因此 不會(huì)對(duì)大分子抗原與抗體的結(jié)合產(chǎn)生空間影響。因此，APEx系統(tǒng)展示的抗體可有效的結(jié)合 分子量高達(dá)240kDa的可溶性抗原。(4)抗體的展示只需要穿過一層細(xì)胞膜，而不需要像酵 母展示或細(xì)菌外膜展示系統(tǒng)那樣要穿越細(xì)胞外壁，這使得抗體的展示不會(huì)受分子量和空間 結(jié)構(gòu)的限制，展示效果更好。因此，APEx系統(tǒng)能夠成功地展示完整的IgG抗體(Mazor Y,Van Blarcom Τ, Mabry R, Iverson BL, Georgiou G :Isolation of engineered, full-length antibodies from libraries expressed in Escherichia coli. Nat Biotechnol 2007, 25(5) :563-565.)。并且完整的IgG抗體具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，可以產(chǎn)生二價(jià)結(jié)合，這將 有利于篩選單價(jià)結(jié)合親和力較低的抗體。(5)可以直接利用廣泛使用的噬菌體展示載體來 進(jìn)行蛋白表達(dá)，這使得可以直接利用許多噬菌體展示的單鏈抗體的文庫資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白的方法。本發(fā)明所提供的篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白的方法，包括如下步驟1)將目標(biāo)蛋白展示于真核細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，得到表面展示有目標(biāo)蛋白的真核細(xì) 胞；2)將待篩選蛋白庫中的各蛋白分別展示于細(xì)菌原生質(zhì)體表面，得到表面展示有待 篩選蛋白的細(xì)菌原生質(zhì)體庫；3)將步驟1)得到的真核細(xì)胞與步驟2)得到的細(xì)菌原生質(zhì)體庫共同孵育，使展示 于所述真核細(xì)胞表面的目標(biāo)蛋白和展示于所述細(xì)菌原生質(zhì)體表面的蛋白之間發(fā)生特異性 的相互配對(duì)，得到所述真核細(xì)胞與所述細(xì)菌原生質(zhì)體的特異性結(jié)合物，將所述結(jié)合物從孵 育體系中分離出來；4)從步驟3)得到的結(jié)合物中分離得到與展示于真核細(xì)胞表面的目標(biāo)蛋白特異性 結(jié)合的目的蛋白或目的蛋白的編碼基因。上述篩選方法中，所述待篩選蛋白庫為含有與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白的待篩選 蛋白庫。即該方法適合于含有與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白的待篩選蛋白庫。上述篩選方法中，待篩選蛋白庫可以是現(xiàn)有的用于噬菌體展示技術(shù)的可篩選的蛋 白庫，也可以是現(xiàn)有的包含更大的抗體(例如完整的IgG)的蛋白庫。上述任一所述篩選方法中，所述步驟3)中，所述孵育的條件包括所述孵育體系 的 PH 值為 5. 0-7. 5，具體為 5. 0,5. 3,5. 5,5. 8,6. 0,6. 3,6. 5,6. 8,7. 0,7. 3,7. 5。上述任一所述篩選方法中，所述步驟3)中，所述孵育的條件包括溫度為 30-37°C，具體為30°C或37°C ；時(shí)間為0. 5-2小時(shí)，具體為0. 5h或Ih或2h。上述任一所述篩選方法中，所述步驟3)中，所述將所述結(jié)合物從孵育的體系中分 離出來的方法包括，首先使用平板淘選法篩選，然后使用流式分選法分選。上述任一所述篩選方法中，使用流式分選法的步驟為首先從所述孵育體系中去除未同所述真核細(xì)胞形成特異性結(jié)合物的細(xì)菌原生質(zhì)體，再通過流式細(xì)胞儀篩選，收集所 述真核細(xì)胞與原生質(zhì)體發(fā)生特異性結(jié)合的結(jié)合物。上述流式細(xì)胞儀篩選方法中，所述從所述孵育體系中去除未形成結(jié)合物的細(xì)菌原 生質(zhì)體的方法為將所述孵育的體系300g離心1. 5-3分鐘后，收集沉淀，棄去上清。上述任一所述篩選方法中，所述將所述結(jié)合物從孵育的體系中分離出來的方法 中；淘選法為在平板上淘選可結(jié)合的細(xì)菌原生質(zhì)體，它主要是一種定性的篩選，是把能夠結(jié) 合的細(xì)菌原生質(zhì)體都篩選出來，而不是根據(jù)結(jié)合力強(qiáng)弱來進(jìn)行篩選。而流式細(xì)胞分選技術(shù) 是一種具有高通量，多參數(shù)定量分選能力的技術(shù)，它能夠根據(jù)親和力強(qiáng)弱進(jìn)行定量的篩選。上述任一所述篩選方法中，所述步驟1)中，所述將目標(biāo)蛋白展示于真核細(xì)胞的細(xì) 胞膜表面是由包括如下步驟的方法制備得到的將含有所述目標(biāo)蛋白編碼基因的重組載體 轉(zhuǎn)入所述真核細(xì)胞中，得到重組真核細(xì)胞，培養(yǎng)該重組真核細(xì)胞并誘導(dǎo)所述重組載體的表 達(dá)，得到所述表面展示有目標(biāo)蛋白的真核細(xì)胞；所述真核表達(dá)載體可以是任何可在真核細(xì)胞膜表面展示的載體。優(yōu)選是 pUHD10-3-display(SEQ ID :6)，該載體是按照如下方法得到的將DNA片段插入pUHD10_3 載體中四環(huán)素調(diào)控的啟動(dòng)子下游的EcoR I和Xba I之間，得到中間重組載體；再將所述目 標(biāo)蛋白的編碼基因插入所述中間重組載體的Bgl II和Sal I位點(diǎn)間，得到所述目標(biāo)蛋白的 編碼基因的重組載體；所述DNA片段的序列如下所示，制備方法為以載體pDisplay為模板，用如下引物 對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的上游弓丨物ACGCGAATTCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCT下游弓丨物AACTAGTCTAGACTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCAT。所述真核細(xì)胞可以是CH0、C0Sl、C0S7、293T、HeLa、HCT116等，優(yōu)選是H1299細(xì)胞株。上述任一所述篩選方法中，所述步驟1)中，所述目標(biāo)蛋白的編碼基因是人源化 的。上述任一所述篩選方法中，所述步驟2)中，將待篩選蛋白庫中的各蛋白分別展示 于細(xì)菌原生質(zhì)體表面的方法包括如下步驟將待篩選蛋白的編碼基因插入細(xì)菌表達(dá)載體 中，得到表達(dá)所述待篩選蛋白的重組載體，將所述表達(dá)待篩選蛋白的重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì) 菌，得到重組細(xì)菌，培養(yǎng)所述重組細(xì)菌并誘導(dǎo)所述重組載體的表達(dá)，再提取重組細(xì)菌的原生 質(zhì)體，得到所述表面展示有待篩選蛋白的細(xì)菌原生質(zhì)體。所述的細(xì)菌中還可以轉(zhuǎn)入用于通過熒光信號(hào)篩選原生質(zhì)體的熒光蛋白表達(dá)載體， 該載體可以是在細(xì)菌中表達(dá)任何顏色熒光蛋白質(zhì)的載體，優(yōu)選為PBAD30-KmR-GFPmut2。所述的細(xì)菌可以是各種大腸桿菌如DH10B，Topl0，JM109，BL21等，優(yōu)選為大腸桿 菌 Jude-I上述任一所述篩選方法中，所述步驟4)中，所述從結(jié)合物中分離得到目的蛋白或 目的蛋白的編碼基因的方法包括如下步驟從所述結(jié)合物中提取所述表達(dá)目的蛋白的重組 載體，將重組載體進(jìn)行測(cè)序，得到所述目的蛋白的編碼基因。實(shí)際應(yīng)用中，所述目標(biāo)蛋白可為抗原，所述待篩選蛋白可為抗體；所述抗體具體可 為特異識(shí)別人源細(xì)胞表面抗原的抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用上述方法輔助鑒定蛋白是否與目標(biāo)蛋白結(jié) 合的方法。本發(fā)明所提供的輔助鑒定蛋白是否與目標(biāo)蛋白結(jié)合的方法，包括如下步驟1)將目標(biāo)蛋白展示于離體真核細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，得到表面展示有目標(biāo)蛋白的真 核細(xì)胞；2)將待鑒定蛋白庫中的各蛋白分別展示于細(xì)菌原生質(zhì)體表面，得到表面展示有待 鑒定蛋白的細(xì)菌原生質(zhì)體庫；3)將步驟1)得到的真核細(xì)胞與步驟2)得到的細(xì)菌原生質(zhì)體庫共同孵育，使展示 于所述真核細(xì)胞表面的目標(biāo)蛋白和展示于所述細(xì)菌原生質(zhì)體表面的蛋白之間發(fā)生特異性 的相互配對(duì)，得到所述真核細(xì)胞與所述細(xì)菌原生質(zhì)體的特異性結(jié)合物，檢測(cè)孵育的體系中 是否含有所述特異性結(jié)合物，若含有所述特異性結(jié)合物，則所述待鑒定蛋白與所述目標(biāo)蛋 白結(jié)合，若不含有所述特異性結(jié)合物，則所述待鑒定蛋白不與所述目標(biāo)蛋白結(jié)合。上述鑒定方法中，所述待鑒定蛋白庫為含有與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白的待篩選 蛋白庫。即該方法適合于含有與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白的待鑒定蛋白庫。上述鑒定方法中，待鑒定蛋白庫可以是現(xiàn)有的用于噬菌體展示技術(shù)的可篩選的蛋 白庫，也可以是現(xiàn)有的包含更大的抗體(例如完整的IgG)的蛋白庫。上述任一所述鑒定方法中，所述步驟3)中，所述孵育的條件包括所述孵育體系 的 PH 值為 5. 0-7. 5，具體為 5. 0,5. 3,5. 5,5. 8,6. 0,6. 3,6. 5,6. 8,7. 0,7. 3,7. 5。上述任一所述鑒定方法中，所述步驟3)中，所述孵育的條件包括溫度為30-37°C 和時(shí)間為0. 5-2小時(shí)。上述任一所述鑒定方法中，所述步驟3)中，檢測(cè)孵育的體系中是否含有所述特異 性結(jié)合物的方法是流式細(xì)胞儀檢測(cè)。上述任一所述鑒定方法中，所述步驟3)中，可將所述結(jié)合物從孵育的體系中分離 出來再進(jìn)行檢測(cè)，分離方法包括，首先使用平板淘選法篩選，然后使用流式分選法分選。上述任一所述鑒定方法中，使用流式分選法的步驟為首先從所述孵育體系中去 除未同所述真核細(xì)胞形成特異性結(jié)合物的細(xì)菌原生質(zhì)體，再通過流式細(xì)胞儀篩選，收集所 述真核細(xì)胞與原生質(zhì)體發(fā)生特異性結(jié)合的結(jié)合物。上述流式細(xì)胞儀篩選方法中，所述從所述孵育體系中去除未形成結(jié)合物的細(xì)菌原 生質(zhì)體的方法為將所述孵育的體系300g離心1. 5-3分鐘后，收集沉淀，棄去上清。上述任一所述篩選方法中，所述將所述結(jié)合物從孵育的體系中分離出來的方法 中；淘選法為在平板上淘選可結(jié)合的細(xì)菌原生質(zhì)體，它主要是一種定性的篩選，是把能夠結(jié) 合的細(xì)菌原生質(zhì)體都篩選出來，而不是根據(jù)結(jié)合力強(qiáng)弱來進(jìn)行篩選。而流式細(xì)胞分選技術(shù) 是一種具有高通量，多參數(shù)定量分選能力的技術(shù)，它能夠根據(jù)親和力強(qiáng)弱進(jìn)行定量的篩選。上述任一所述篩選方法中，所述步驟1)中，所述將目標(biāo)蛋白展示于真核細(xì)胞的細(xì) 胞膜表面是由包括如下步驟的方法制備得到的將含有所述目標(biāo)蛋白編碼基因的重組載體 轉(zhuǎn)入所述真核細(xì)胞中，得到重組真核細(xì)胞，培養(yǎng)該重組真核細(xì)胞并誘導(dǎo)所述重組載體的表 達(dá)，得到所述表面展示有目標(biāo)蛋白的真核細(xì)胞；所述真核表達(dá)載體可以是任何可在真核細(xì)胞膜表面展示的載體。優(yōu)選是 pUHD10-3-display(SEQ ID :6)，該載體是按照如下方法得到的將DNA片段插入pUHD10_3載體中四環(huán)素調(diào)控的啟動(dòng)子下游的EcoR I和Xba I之間，得到中間重組載體；再將所述目 標(biāo)蛋白的編碼基因插入所述中間重組載體的Bgl II和Sal I位點(diǎn)間，得到所述目標(biāo)蛋白的 編碼基因的重組載體；所述DNA片段的序列如下所示，制備方法為以載體pDisplay為模板，用如下引物 對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的上游弓丨物ACGCGAATTCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCT下游弓丨物AACTAGTCTAGACTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCAT。所述真核細(xì)胞可以是CH0、C0Sl、C0S7、293T、HeLa、HCT116等，優(yōu)選是H1299細(xì)胞株。上述任一所述篩選方法中，所述步驟1)中，所述目標(biāo)蛋白的編碼基因是人源化 的。上述任一所述篩選方法中，所述步驟2)中，將待篩選蛋白庫中的各蛋白分別展示 于細(xì)菌原生質(zhì)體表面的方法包括如下步驟將待篩選蛋白的編碼基因插入細(xì)菌表達(dá)載體 中，得到表達(dá)所述待篩選蛋白的重組載體，將所述表達(dá)待篩選蛋白的重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì) 菌，得到重組細(xì)菌，培養(yǎng)所述重組細(xì)菌并誘導(dǎo)所述重組載體的表達(dá)，再提取重組細(xì)菌的原生 質(zhì)體，得到所述表面展示有待篩選蛋白的細(xì)菌原生質(zhì)體。所述的細(xì)菌中還可以轉(zhuǎn)入用于通過熒光信號(hào)篩選原生質(zhì)體的熒光蛋白表達(dá)載體， 該載體可以是在細(xì)菌中表達(dá)任何顏色熒光蛋白質(zhì)的載體，優(yōu)選為PBAD30-KmR-GFPmut2。所述的細(xì)菌可以是各種大腸桿菌如DH10B，Topl0，JM109，BL21等，優(yōu)選為大腸桿 菌 Jude-I ο上述任一所述篩選方法中，所述步驟4)中，所述從結(jié)合物中分離得到目的蛋白或 目的蛋白的編碼基因的方法包括如下步驟從所述結(jié)合物中提取所述表達(dá)目的蛋白的重組 載體，將重組載體進(jìn)行測(cè)序，得到所述目的蛋白的編碼基因。實(shí)際應(yīng)用中，所述目標(biāo)蛋白可為抗原，所述待鑒定蛋白可為抗體；所述抗體具體可 為特異識(shí)別人源細(xì)胞表面抗原的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白的試劑盒。本發(fā)明所提供的用于篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白的試劑盒，由真核細(xì)胞、真 核細(xì)胞表達(dá)載體、用于制備原生質(zhì)體的細(xì)菌、原生質(zhì)體展示載體、在原生質(zhì)體中表達(dá)熒光蛋 白以便于篩選的載體組成。上述試劑盒中，所述離體人源細(xì)胞為人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299 ；所述真核細(xì) 胞表達(dá)載體為pUHD10-3-display(SEQ ID 6)；所述細(xì)菌為大腸桿菌菌株Jude-I ；所述表達(dá) 熒光蛋白的載體為pBAD30-KmR-GFPmut2。細(xì)菌原生質(zhì)體展示方法在篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白中的應(yīng)用也屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供了利用APEx展示技術(shù)應(yīng)用于以完整的人細(xì)胞為抗原篩選特異識(shí)別人 細(xì)胞表面抗原的抗體的一種篩選方法。APEx細(xì)菌展示系統(tǒng)擁有與噬菌體展示系統(tǒng)相當(dāng)大小 的抗體庫(彡IO9)，并且具有展示完整的IgG抗體的能力。此外APEx細(xì)菌展示系統(tǒng)可以直 接利用廣泛使用的噬菌體表達(dá)載體進(jìn)行蛋白展示，因此可以直接利用現(xiàn)有的噬菌體單鏈抗 體文庫進(jìn)行篩選。此方法的建立，有助于篩選更多識(shí)別細(xì)胞表面分子標(biāo)記的抗體，對(duì)疾病診
8斷和治療都將起到巨大的推動(dòng)作用。


圖1為熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀分析H1299_tet on-PAD4細(xì)胞表面PAD4的表達(dá)。圖2為熒光顯微鏡觀察細(xì)菌原生質(zhì)體與貼壁細(xì)胞的結(jié)合。圖3為H1299_tet on-PAD4細(xì)胞與展示抗體M18的細(xì)菌原生質(zhì)體的特異結(jié)合。圖4為pH值對(duì)展示抗體M18的細(xì)菌原生質(zhì)體與H1299_tet on_PAD4細(xì)胞結(jié)合的影響。圖5為展示M18抗體的細(xì)菌原生質(zhì)體在不同初始純度時(shí)被平板淘選和流式分選的
富集效率。圖6為多輪富集展示M18抗體的細(xì)菌原生質(zhì)體。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明用已有的抗原-抗體對(duì)作為模型，證明展示了特定抗體的細(xì)菌原生質(zhì)體， 能夠通過與人細(xì)胞表面展示的抗原相互作用從而結(jié)合到細(xì)胞表面。選用了炭疽桿菌保護(hù) 抗原的一個(gè)片斷PA domaiM作為抗原，而對(duì)應(yīng)的單鏈抗體為M18 ScFv0而抗地高辛標(biāo)簽 (DIG)的單鏈抗體26-10 scFv作為陰性對(duì)照。將誘導(dǎo)后的H1299-tet on-PAD4細(xì)胞從平板 上酶解下來，然后分別和展示抗PAD4的單鏈抗體或抗DIG標(biāo)簽的單鏈抗體并帶有GFPmut2 熒光的細(xì)菌原生質(zhì)體孵育。孵育完后，去掉未結(jié)合的細(xì)菌原生質(zhì)體。將細(xì)胞重懸后在流式 細(xì)胞儀上檢測(cè)。由于細(xì)胞和細(xì)菌原生質(zhì)體在大小上有明顯差別，在流式細(xì)胞儀上可以通過 前向散射光FSC和測(cè)向散射光SSC信號(hào)明顯的區(qū)分開。H1299細(xì)胞在流式細(xì)胞儀上呈現(xiàn)比 細(xì)菌原生質(zhì)體更大的FSC和SSC信號(hào)，可以準(zhǔn)確的選取細(xì)胞群，分析細(xì)胞因?yàn)榻Y(jié)合了有熒光 的細(xì)菌原生質(zhì)體而獲得的GFP熒光。熒光的強(qiáng)弱就能反映出細(xì)菌原生質(zhì)體結(jié)合的強(qiáng)弱。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、篩選抗體的方法一、將抗原PAD4展示于離體的動(dòng)物細(xì)胞表面人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫，產(chǎn)品目錄號(hào) 為 0092。pUHDlO-3載體在文獻(xiàn)(Gossen M, Bujard H :Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA 1992,89(12) :5547_5551.)中公開過。(Domain 4 of the Anthrax Protective Antigen gene)白勺IS 碼基因序列如SEQ ID N0:5所示。人細(xì)胞mRNA翻譯常用的密碼子與細(xì)菌有所差異，人源化 該DNA的目的是為了人細(xì)胞的翻譯機(jī)器能高效地翻譯該基因轉(zhuǎn)錄出來的mRNA。pDisplay(購自Invitrogen)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，專門用于將重組蛋白定 位于哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜表面。通過將感興趣的基因克隆到載體框架(包括N端Ig k分泌信 號(hào)，C 端血小板來源的生長(zhǎng)因子受體(PDGFR) (Gronwald RG, Grant FJ, Haldeman ΒΑ, HartCE, Of Hara PJ, Hagen FS,Ross R,Bowen-Pope DF, Murray MJ :Cloning and expression of a cDNA coding for the human platelet-derived growth factor receptor :evidence for more than one receptor class. Proc Natl Acad Sci USA 1988,85(10) :3435_3439.) 的跨膜錨定域中，而使表達(dá)的蛋白質(zhì)定向錨定于細(xì)胞表面。PAD4通過C端與血小板來源的 生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)的跨膜錨定域融合在N端分泌信號(hào)的引導(dǎo)下從而能夠展示到H1299 細(xì)胞膜表面。以 pDisplay 為模板，用引物對(duì)(上游引物 ACGCGAATTCGCCACCATGGAGACAGACACACTC CTGCT，下游弓丨物 AACTAGTCTAGACTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCAT)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中 包括載體上的Ig k鏈前導(dǎo)序列(分泌信號(hào))、HA標(biāo)簽、多克隆位點(diǎn)區(qū)、c-myc標(biāo)簽及PDGFR 跨膜區(qū)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入pUHD10-3載體中四環(huán)素調(diào)控的啟動(dòng)子下游的EcoR I和Xba I之間，得到構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒，記作pUHD10-3-display載體。該pUHDlO-3-display載 體中通過四環(huán)素來調(diào)節(jié)外源蛋白(PAD4)在細(xì)胞表面的表達(dá)。用overlap PCR的方法合成人源化的PAD4 DNA序列，具體如下組裝PAD4的弓I物序列1 TCAGagatctCGGTTCCACTATGATCGGAACAACATCGCAGTCG 342 TGAGCTTCCTTCACGACGCTTTCGTCTGCGCCGACTGCGATGTTGTTCCG 503 GCGTCGTGAAGGAAGCTCACCGGGAAGTGATCAACAGCAGCACTGAAGGA 504 CGAATATCCTTATCGATGTTCAGGAGGAGTCCTTCAGTGCTGCTGTTGAT 505 CCTCCTGAACATCGATAAGGATATTCGGAAGATTCTGAGCGGCTACATCG 506 TTTGAGTCCCTCAGTATCTTCGATCTCCACGATGTAGCCGCTCAGAATCT 507 AGATCGAAGATACTGAGGGACTCAAAGAGGTCATCAACGATCGGTACGAT 508 CCTGTTGCAGGCTGCTGATATTGAGCATATCGTACCGATCGTTGATGACC 509 ATATCAGCAGCCTGCAACAGGACGGCAAAACTTTCATCGACTTCAAGAAA 5010 CAGAGGGAGCTTGTCGTTGTATTTCTTGAAGTCGATGAAAGTTTTGCC 4811 TACAACGACAAGCTCCCTCTGTACATTAGCAATCCCAACTACAAGGTGAA 5012 GTTCTCCTTTGTGACGGCATAGACGTTCACCTTGTAGTTGGGATTGCTAA 5013 TCTATGCCGTCACAAAGGAGAACACCATCATTAACCCAAGCGAGAACGGG 5014 GAGGATCCGTTTGATCCCATTTGTGGAAGTGTCCCCGTTCTCGCTTGGGT 5015 ACAAATGGGATCAAACGGATCCTCATCTTTTCCAAAAAGGGGTACGAGAT 5016 GTACgtcgacCCCAATCTCGTACCCCTTTTTGGAAAAGA 291.將各條引物重懸為100M。2.制備10X的引物混合物將每條引物各取11混合在一起，然后加Milli-Q水至 終體積200 μ 1。3.制備50 μ 1的PCR反應(yīng)體系a. 8 μ 1 10Χ的引物混合物+5 μ 1 10Χ PCR緩沖液b. 1 μ 1 dNTP 底物(2. 5mM each)c. 1 μ 1 pyrobest ?！纜8| (Takara)d. 35 μ 1 Milli-Q 水4· PCR反應(yīng)條件
a. 95 °C 2minb. 95°C 20secc. 52 °C Imind. 72 °C 2mine.重復(fù)步驟b_d29次f. 72 °C IOmin5.取1 μ 1 PCR產(chǎn)物(不需要純化)作為模板用于第二次PCRa. 1 μ 1 of PCR 產(chǎn)物b. 5 μ 1 IOX PCR 緩沖液c. 1 μ 1 dNTP 底物(2. 5mM each)d. 0· 5μ 1 1 號(hào)引物(ΙΟΟμΜ)e. 0. 5μ 1 16 號(hào)引物(ΙΟΟμΜ)f. 1 μ 1 pyrobest 擴(kuò)增酶(Takara)g. 41 μ 1 Milli-Q 水h.重復(fù)步驟6的PCR反應(yīng)用Bgl II-Sal I酶切將擴(kuò)增產(chǎn)物并亞克隆到pUHDlO-3-display載體中，重組質(zhì) 粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果在pUHDlO-3-display的Bgl II和Sal I酶切位點(diǎn)間插入了 SEQ ID NO 5所示DNA，表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確，記作pUHD10-3-display-PAD4。完全培養(yǎng)基含10%小牛血清(Hyclone)和100U/ml雙抗(青鏈霉素，Sigma)的 DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)，用于培養(yǎng)HI2"細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)前接種H1299細(xì)胞使其在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到60% _80%滿度，去除完全培 養(yǎng)基，用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)將pTet-on (編碼rtTA轉(zhuǎn)錄因子，可于四環(huán)素 響應(yīng)啟動(dòng)子配對(duì)對(duì)基因進(jìn)行Tet on調(diào)控)(Clontech)和目的質(zhì)粒pUHD10-3-display-PAD4 在無血清培養(yǎng)基中混合并加入細(xì)胞培養(yǎng)盤中，孵育4-6小時(shí)后，換成完全培養(yǎng)基繼續(xù) 培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將細(xì)胞按1 5的比例接種于新的培養(yǎng)皿中，并加入450yg/ml G418 (Amersco)篩選抗性細(xì)胞。篩選兩周后，將G418抗性細(xì)胞按5 X IO5細(xì)胞/IOcm平皿的 密度接種，并加入2μ g/ml d0XyCyCline(D0X，一種四環(huán)素的衍生物，具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)效果 和穩(wěn)定性)(Sigma)誘導(dǎo)PAD4表達(dá)。誘導(dǎo)48小時(shí)后，收集細(xì)胞。細(xì)胞鑒定用1 400稀釋的抗c-myc標(biāo)簽的單抗(9E10，Calbiochem)4度標(biāo) 記細(xì)胞表面的PAD4-c-myc蛋白。孵育30min后，再用1 300稀釋的兔抗鼠的FITC標(biāo) 記的二抗(Jackson ImmunoResearch) 4度孵育30min。被標(biāo)記的細(xì)胞重懸于DMEM培養(yǎng)基 (Invitrogen,CA)中。樣品在BD FACS Aria II (Becton Dickinson)上進(jìn)行無菌分選，將約 5%具有最強(qiáng)FITC熒光的細(xì)胞分選出來。經(jīng)過三輪分選，獲得了 63%的細(xì)胞表面展示PAD4 的細(xì)胞，記作H1299-tet on PAD4細(xì)胞。Dox誘導(dǎo)前后的H1299_tet on-PAD4細(xì)胞如圖1所示。圖1中，(A)熒光顯微鏡觀 察PAD4在H1299細(xì)胞表面的表達(dá)?？筩_myc標(biāo)簽抗體標(biāo)記H1299_tet on_PAD4細(xì)胞在有 無Dox時(shí)表面PAD4的表達(dá)水平。(B)流式細(xì)胞儀檢測(cè)H1299-tet on_PAD4細(xì)胞在有無Dox 時(shí)表面PAD4的表達(dá)水平。表明，在細(xì)胞維持的過程中，由于沒有Dox，細(xì)胞不會(huì)表達(dá)PAD4抗 原，有利于細(xì)胞的擴(kuò)增。只有當(dāng)在培養(yǎng)基中加入Dox時(shí)，H1299細(xì)胞才能在短時(shí)間內(nèi)在細(xì)胞表面表達(dá)PAD4抗原。二、將待篩選抗體展示于細(xì)菌原生質(zhì)體表面細(xì)菌表達(dá)載體 pBAD30-KmR-GFPmut2、pAK200-26_10 (anti-Digoxigenin scFv) 禾口 pAK200-M18 在文獻(xiàn)(Jung ST, Jeong KJ, Iverson BL, Georgiou G=Binding and enrichment of Escherichia coli spheroplasts expressing inner membrane tethered scFv antibodies on surface immobilized antigens. Biotechnol Bioeng 2007,98(1) 39-47.)中公開過。pAK200-M18中含有PAD4的抗體(即M18)的編碼基因，該基因序列如SEQ ID NO 1所示。M18抗體的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。pAK200-26-10中含有陰性對(duì)照抗體26_10 (抗地高辛標(biāo)簽(DIG)的抗體)的編碼 基因，該基因序列如SEQ ID N0:3所示。對(duì)照抗體26-10的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所
7J\ οpBAD30-KmR載體是一個(gè)araBAD啟動(dòng)子嚴(yán)格調(diào)控蛋白表達(dá)的載體。向細(xì)菌中導(dǎo)入pBAD30-KmR-GFPmut2的目的是使細(xì)菌原生質(zhì)體發(fā)熒光，便于篩選。pAK200載體是一種噬菌體展示的載體，它將外源蛋白的C端與M13噬菌體的gp3 蛋白形成融合蛋白，通過gp3錨定在細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)從而將外源蛋白展示在細(xì)菌周質(zhì)空間。 將細(xì)菌外壁去除后將能將目的蛋白展示在細(xì)菌表面。E. coli Jude-I 在文獻(xiàn)(F，[TnlO (Tetr) proAB+lacIq Δ (lacZ)M15]mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80(11βοΖΔΜ15 Δ lacX74 deoR recAl araD139A (ara leu) 7697 galU galK rpsL endAl nupG)(Jung ST,Jeong KJ,Iverson BL,Georgiou G :Binding and enrichment of Escherichia coli spheroplasts expressing inner membrane tethered scFv antibodies on surface immobilized antigens. Biotechnol Bioeng 2007,98(1) 39-47.)中公開過。E coli Jude-I電化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備A.挑取單克隆接種于5ml SOB培養(yǎng)基中37度，250rpm培養(yǎng)16小時(shí)；B.將5ml過夜培養(yǎng)液接種于500ml SOB培養(yǎng)基中，37度，250rpm培養(yǎng)至0D600到 1. O ；C.將培養(yǎng)液置于冰上30分鐘，然后4，500g 4度離心15分鐘收集細(xì)菌；D.棄上清，用500ml冰上預(yù)冷的無菌超純水重懸菌體E. 4，500g 4度離心15分鐘，棄上清，用250ml冰上預(yù)冷的無菌超純水重懸菌體F. 4，500g 4度離心15分鐘，棄上清，用50ml冰上預(yù)冷的無菌超純水重懸菌體G. 4，500g 4度離心15分鐘，棄上清，用1. 5ml冰上預(yù)冷的10% (ν/ν)甘油的無菌 超純水溶液重懸菌體，50 μ 1/管分裝感受態(tài)細(xì)胞，馬上置于-70度超低溫冰箱保存。電轉(zhuǎn)化E coli Jude-I電化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞A.將0. Icm的電擊杯置于冰上預(yù)冷，同時(shí)從_70度超低溫冰箱取出一管E coli Jude-I電化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化。B.將質(zhì)粒溶液(1-2 μ 1)加入已溶化的E coli Jude-I電化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，迅速 并溫和混勻。C.馬上將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)移到0. Icm的電擊杯中，將電擊杯置于Gene
12Pulser II (Bio-Rad)電穿孔儀上，以1. 8kv，25 μ F，200 Ω的電擊條件進(jìn)行電擊。電擊常 數(shù)可控制到4-5毫秒。D.迅速加入Iml SOC培養(yǎng)基(常溫)重懸電擊后的細(xì)菌，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)15ml離心 管中，置于37度搖床，220rpm培養(yǎng)1個(gè)小時(shí)。E.將復(fù)蘇后的菌液以300 μ l/10cm平皿涂布于含有氯霉素和卡那霉素的LB固體 選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。按照如上方法將pBAD30-KmR-GFPmut2和pAK200-26-10共同轉(zhuǎn)入E.coli Jude-I， 得到含有 pBAD30-KmR-GFPmut2 和 pAK200-26_10 的 E. coli Jude-I。按照如上方法將pBAD30-KmR-GFPmut2和pAK200-M18共同轉(zhuǎn)入E.coli Jude-I，得 到含有 pBAD30-KmR-GFPmut2 和 pAK200_M18 的 E. coli Jude-I。將含有pBAD30-KmR-GFPmut2 和 pAK200-26_10 的 E.coli Jude-I 或含有 pBAD30-KmR-GFPmut2 和 pAK200_M18 的 E. coli Jude-I 在添加了 20mg/ml 葡萄糖，40 μ g/ ml氯霉素(Sigma)和50 μ g/ml卡那霉素(Sigma)的TB (Terrific Broth)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 37度過夜。將過夜培養(yǎng)液按1 100的比例接種到新鮮的TB培養(yǎng)基中(不含葡萄糖)，37 度培養(yǎng)至 OD6tltl 等于 0. 5。然后加入 ImM IPTG(Sigma)和 2mg/ml L-arabinose (Sigma)至于 16度誘導(dǎo)抗體和綠色熒光蛋白的表達(dá)。制備細(xì)菌原生質(zhì)體誘導(dǎo)18小時(shí)后，離心收集菌體(菌體濃度為Iml菌體的 OD6tltl 值為 4. 5)，用 Iml IOmM Tris-HCl(pH 8. 0)洗兩次，再重懸于 Iml STE 溶液中(0. 5M Sucrose, IOmM Tris-HCl, IOmM EDTA，pH 8· 0)，置于 37 度孵育 30min。12，000g 離心收集細(xì) 菌，然后用溶液 A (0. 5M Sucrose, 20mM MgCl2, IOmM M0PS，pH 6.8)洗一次，再重懸于 Iml 含 有l(wèi)mg/ml溶菌酶的溶液A中，37度孵育15min。最后12，OOOg離心收集細(xì)菌原生質(zhì)體，并 重懸于含有BSA和脫脂奶粉、pH6. 5的optimal-MEM培養(yǎng)基中，至細(xì)菌原生質(zhì)體的 濃度為Iml懸液的0D_值為10，獲得細(xì)菌原生質(zhì)體懸液。三、抗體篩選方法的摸索Doxycycline 購自 Sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為 D9891。optimal-MEM 培養(yǎng)基購自 Invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為31985。(一 )驗(yàn)證平板淘選法(panning)能否用于抗體篩選實(shí)驗(yàn)組方法(A)將H1299-tet on_PAD4細(xì)胞按5X IO5細(xì)胞/IOcm平皿接種，并加 入2μβ/πι1 doxycycline誘導(dǎo)PAD4表達(dá)。誘導(dǎo)60小時(shí)后，平皿用PBS洗一遍，然后加入含 有BSA和脫脂奶粉的optimal-MEM pH6. 5培養(yǎng)基常溫封閉20min。將IOml細(xì)菌原 生質(zhì)體懸液(10ml細(xì)菌原生質(zhì)體懸液的OD6tltl值為80)加入到每個(gè)平皿中，放置于37度、pH 值6. 5、水平搖床中以50轉(zhuǎn)/分鐘孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束，用PBS洗三次，去除未結(jié)合的細(xì) 菌原生質(zhì)體。實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)加展示M18的細(xì)菌原生質(zhì)體或展示26-10的細(xì)菌原生質(zhì)體。由于細(xì)菌原生質(zhì)體帶有GFP熒光，直接在熒光顯微鏡下觀察細(xì)菌原生質(zhì)體與細(xì)胞 的結(jié)合。結(jié)果如圖2所示。圖2A為展示M18的細(xì)菌原生質(zhì)體與H1299-tet on-PAD4孵育； 圖2B為展示26-10細(xì)菌原生質(zhì)體與H1299-tet on_PAD4孵育；圖2C為展示M18細(xì)菌原生 質(zhì)體與H1299細(xì)胞孵育；圖2D為展示26-10細(xì)菌原生質(zhì)體與H1299細(xì)胞孵育。圖2A顯示 為特異結(jié)合實(shí)驗(yàn)，而圖2B、C和D為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果一致。結(jié)果表明，只有 展示了抗PAD4的單鏈抗體的細(xì)菌原生質(zhì)體能結(jié)合到H1299-tet on_PAD4細(xì)胞的表面，而展示抗DIG標(biāo)簽的細(xì)菌原生質(zhì)體不能與H1299-tet0n-PAD4細(xì)胞結(jié)合。兩種細(xì)菌原生質(zhì)體細(xì) 胞均不能和普通的H1299細(xì)胞結(jié)合。證實(shí)M18-細(xì)菌原生質(zhì)體能結(jié)合到貼壁的H1299-PAD4 細(xì)胞表面。且對(duì)照抗體的非特異結(jié)合水平非常低。證明平板淘選法可以用于篩選抗體。(二)驗(yàn)證流式分選能否用于抗體篩選收集誘導(dǎo)過的H1299-tet on_PAD4細(xì)胞，重懸于含有IOmM EDTA和1 % BSA optimal-MEM pH6. 5 培養(yǎng)基中。將 IO6 H1299_tet on_PAD4 細(xì)胞與 Iml 0D_ 值為 2 的展示 M18的細(xì)菌原生質(zhì)體或展示26-10的細(xì)菌原生質(zhì)體懸液(Iml懸液的OD6tltl值為2)混合，置 于靜音混和器上于37度、pH6. 5的條件下孵育1小時(shí)。孵育完后，300g離心2分鐘以除去 未結(jié)合的細(xì)菌原生質(zhì)體。樣品重懸于DMEM培養(yǎng)基中，用流式細(xì)胞儀BD FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson)進(jìn)行分析。圖3A為細(xì)菌原生質(zhì)體和H1299細(xì)胞通過抗體M18 和抗原PAD4結(jié)合在一起的示意圖。H1299-tet on-PAD4細(xì)胞明顯比細(xì)菌原生質(zhì)體大，在流 式細(xì)胞儀上表現(xiàn)出更強(qiáng)的前向散射光和側(cè)向散射光信號(hào)，通過散射光信號(hào)可以將細(xì)胞和殘 留的細(xì)菌原生質(zhì)體區(qū)分開來(圖3B)。圖3B中Rl區(qū)域?yàn)镠1299-tet on_PAD4細(xì)胞及目的復(fù) 合物。將該Rl區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞和細(xì)胞_細(xì)菌原生質(zhì)體可以圖示為圖3C。H1299-tet on-PAD4 細(xì)胞結(jié)合展示M18細(xì)菌原生質(zhì)體，而不結(jié)合用于陰性對(duì)照的展示26-10細(xì)菌原生質(zhì)體。兩 種細(xì)菌原生質(zhì)體均表達(dá)綠色熒光蛋白GFPmut2，因此被488nm激光激發(fā)后發(fā)綠色熒光。由 圖3C可見，因展示M18細(xì)菌原生質(zhì)體能特異結(jié)合H1299-tet on-PAD4細(xì)胞可檢測(cè)到明顯 的530/30nm波長(zhǎng)的熒光信號(hào)；而展示26-10細(xì)菌原生質(zhì)體幾乎不結(jié)合H1299_tet on-PAD4 細(xì)胞，只能檢測(cè)到非常低水平的背景熒光。樣品可用流式分選儀FACSAria II (Becton Dickinson，也可用別的流式分選儀)根據(jù)熒光信號(hào)分選H1299_tet on-PAD4細(xì)胞與展 示M18抗體的細(xì)菌原生質(zhì)體的復(fù)合物。圖3C中S區(qū)域?yàn)榉诌x區(qū)。結(jié)果篩選到H1299-tet on-PAD4細(xì)胞與展示M18抗體的細(xì)菌原生質(zhì)體的復(fù)合物，表明流式分選法也可用于抗體篩 選。(三)孵育條件的優(yōu)化將誘導(dǎo)過的H1299-tet on_PAD4細(xì)胞收集并重懸于含有IOmM EDTA和1 % BSA、pH 不同的optimal-MEM培養(yǎng)基中。將IO6細(xì)胞與Iml展示M18細(xì)菌原生質(zhì)體懸液(Iml懸液的 0D_值為2)混合，置于靜音混和器上于37度、pH不同的條件下孵育1小時(shí)。pH值分別為 5. 0,5. 3,5. 5,5. 8,6. 0,6. 3,6. 5,6. 8,7. 0，7. 3 或 7. 5。孵育完成的樣品在流式分選儀FACSAria II (Becton Dickinson)上檢測(cè)細(xì)菌原生
質(zhì)體結(jié)合信號(hào)。同時(shí)以展示26-10抗體的細(xì)菌原生質(zhì)體作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。圖4為展示抗PAD4抗體M18細(xì)菌原生質(zhì)體或陰 性對(duì)照展示26-10抗體細(xì)菌原生質(zhì)體在不同的pH值條件下與懸浮的H1299-tet on-PAD4 細(xì)胞結(jié)合數(shù)目。在pH為5. 5到7. 0之間，展示M18的細(xì)菌原生質(zhì)體與H1299_tet on_PAD4 細(xì)胞的結(jié)合數(shù)(在流式中以GFP熒光強(qiáng)度表示)明顯高于此pH值范圍之外展示M18的細(xì) 菌原生質(zhì)體與H1299-tet on-PAD4細(xì)胞的結(jié)合數(shù)。而在pH為5. 5到7. 0之間和之外，展示 陰性對(duì)照抗體26-10的細(xì)菌原生質(zhì)體與H1299-tet on-PAD4細(xì)胞的結(jié)合數(shù)都處于低水平狀 態(tài)。例如展示特異抗體M18的細(xì)菌原生質(zhì)體與H1299-tet on_PAD4細(xì)胞孵育后，當(dāng)pH值為 5. 0時(shí)，結(jié)合信號(hào)(熒光強(qiáng)度)為662 ；當(dāng)pH值為5. 5時(shí)，結(jié)合信號(hào)為1136 ；當(dāng)pH值為6. 0時(shí)，結(jié)合信號(hào)為2857 ；當(dāng)pH值為6. 5時(shí)，結(jié)合信號(hào)為2711 ；當(dāng)pH值為7. 0時(shí)，結(jié)合信號(hào)為 839 ；當(dāng)pH值為7. 5時(shí)，結(jié)合信號(hào)為439。以上實(shí)驗(yàn)說明pH在5. 5到7. 0之間有利于對(duì)展 示特異抗體M18的細(xì)菌原生質(zhì)體的富集。當(dāng)pH值處于生理?xiàng)l件pH7. 5時(shí)，特異結(jié)合信號(hào)非常低。而pH值降到弱酸性時(shí)，結(jié) 合信號(hào)有明顯提高。這很可能是因?yàn)樵谏項(xiàng)l件下哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌表面都帶有負(fù)電 荷，降低PH可以中和部分負(fù)電荷，降低兩者之間的靜電排斥，從而有利于抗原-抗體的結(jié) 合。但PH值過低，結(jié)合信號(hào)也會(huì)開始下降。這可能是由于PAD4蛋白解折疊造成抗原表位 變化的原因。綜合考慮結(jié)合信號(hào)及蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的雙重因素，選定在PH6. 5作為最優(yōu)條 件。四、抗體篩選( 一 )平板淘選法(panning)將展示26-10抗體的細(xì)菌原生質(zhì)體的懸浮液與展示M18的細(xì)菌原生質(zhì)體的懸浮液 混合，得到混合懸浮液，使混合懸浮液中展示M18的細(xì)菌原生質(zhì)體與展示26-10抗體的細(xì)菌 原生質(zhì)體的數(shù)目比為1 1000或5 100，然后將混合懸浮液分別用平板淘選法進(jìn)行篩選 抗體。將H1299_tet on_PAD4細(xì)胞按5 X IO5細(xì)胞/IOcm平皿接種，在完全培養(yǎng)基中加入 2 μ g/ml doxycycline，誘導(dǎo)PAD4表達(dá)。誘導(dǎo)60小時(shí)后，平皿用PBS洗一遍，然后加入含有 1% BSA和脫脂奶粉的optimal-MEM pH6. 5培養(yǎng)基常溫封閉20min。將IOml混合懸浮 液(IOml混合懸浮液的OD6tltl值為80)加入到每個(gè)平皿中，放置于37度、pH值6. 5、水平搖 床中以50轉(zhuǎn)/分鐘孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束，用PBS洗三次，去除未結(jié)合的細(xì)菌原生質(zhì)體，保 留剩余產(chǎn)物。獲得抗體序列將剩余產(chǎn)物用胰酶酶解，從中回收表達(dá)抗體的質(zhì)粒，將回收的表達(dá) 抗體的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)于E. coli Jude-I電化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂布于含有氯霉素的 LB固體選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。從陽性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序，得到目的抗體的編 碼基因序列，序列如SEQ ID NO :1所示，基因序列正確，說明本發(fā)明方法能夠篩選得到正確 的抗體。再通過基因工程表達(dá)和純化得到目的抗體。統(tǒng)計(jì)富集效率將剩余產(chǎn)物用胰酶酶解，從中回收表達(dá)抗體的質(zhì)粒，將回收的表達(dá) 抗體的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)于E. coli Jude-I電化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂布于含有氯霉素的 LB固體選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取48個(gè)轉(zhuǎn)化子，采用菌落PCR鑒定富集后的M18 純度，再統(tǒng)計(jì)富集效率。富集效率的計(jì)算公式富集后的M18純度/富集前的M18純度。鑒定引物序列(M18特異引物)如下5’ -ATATGCTAGCGATATTCAGATGACACAGACT-3’ ；5 ’ -GCGTTTGCCATCTTTTCATAATCAAAATCACC-3’。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果如圖5所示。當(dāng)用于實(shí)驗(yàn)的混合懸浮液中展示M18細(xì)菌原生質(zhì)體的純度為 0. 1 %時(shí)，富集后的M18純度為6. 4%，淘選表現(xiàn)出好的富集效率，為64倍。當(dāng)用于實(shí)驗(yàn)的混 合懸浮液中展示M18細(xì)菌原生質(zhì)體的純度為5%時(shí)，富集后的M18純度為25%，淘選的富集 效率為5倍。當(dāng)孵育溫度為37度、孵育時(shí)間為0. 5h時(shí)，結(jié)果與圖5所示結(jié)果無顯著差異。
當(dāng)孵育溫度為37度、孵育時(shí)間為2h時(shí)，結(jié)果與圖5所示結(jié)果無顯著差異。當(dāng)孵育溫度為30度、孵育時(shí)間為0. 5h時(shí)，結(jié)果與圖5所示結(jié)果無顯著差異。當(dāng)孵育溫度為30度、孵育時(shí)間為2h時(shí)，結(jié)果與圖5所示結(jié)果無顯著差異。(二)流式分選法將展示26-10抗體的細(xì)菌原生質(zhì)體的懸浮液與展示M18的細(xì)菌原生質(zhì)體的懸浮液 混合，得到混合懸浮液，使混合懸浮液中展示M18的細(xì)菌原生質(zhì)體與展示26-10抗體的細(xì)菌 原生質(zhì)體的數(shù)目比為1 1000或5 100，然后將混合懸浮液分別用流式分選法進(jìn)行篩選 抗體。將H1299-tet on_PAD4細(xì)胞按5 X IO5細(xì)胞/IOcm平皿接種，在完全培養(yǎng)基中加入 2 μ g/ml doxycycline，誘導(dǎo)PAD4表達(dá)。誘導(dǎo)60小時(shí)后，平皿用PBS洗一遍，酶解收集誘導(dǎo) 過的 H1299-tet on_PAD4 細(xì)胞，并重懸于含有 IOmM EDTA 和 1 % BSA、pH6. 5 的 optimal-MEM 培養(yǎng)基中。將IO6Cells與Iml混合懸浮液(Iml混合懸浮液的OD6tltl值為2)混合于1. 5ml 離心管中，置于靜音混和器上于37度、pH6. 5的條件下孵育1小時(shí)。去除孵育體系中未結(jié)合的細(xì)菌原生質(zhì)體將孵育產(chǎn)物(將容器內(nèi)的所有物質(zhì)記作 孵育產(chǎn)物)置于離心管中，300g離心2分鐘，吸去上層液體，再以相同方式離心2次。分離復(fù)合物去除孵育體系中未結(jié)合的細(xì)菌原生質(zhì)體后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分 選。用FACSAria II (Becton Dickinson)通過綠色熒光蛋白進(jìn)行分選，收集發(fā)綠色熒光的 H1299-tet on_PAD4細(xì)胞與細(xì)菌原生質(zhì)體的復(fù)合物。獲得抗體序列將分選出的復(fù)合物用EasyPure Plasmid MiniPre Kit(Transgen) 按照試劑盒的操作步驟提取表達(dá)抗體的質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)于E. coli Jude-I電化學(xué) 感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂布于含有氯霉素的LB固體選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。從陽性 轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果得到SEQ ID NO :1所示的目的抗體的編碼基因序列，說 明本發(fā)明方法能夠篩選得到正確的抗體。再通過基因工程表達(dá)和純化得到目的抗體。統(tǒng)計(jì)富集效率將分選出的復(fù)合物用EasyPure Plasmid MiniPre Kit(Transgen) 按照試劑盒的操作步驟提取表達(dá)抗體的質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)于E. coli Jude-I電化學(xué) 感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂布于含有氯霉素的LB固體選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑 取48個(gè)轉(zhuǎn)化子，采用菌落PCR鑒定富集后的M18純度，再統(tǒng)計(jì)富集效率。富集效率的計(jì)算 公式富集后的M18純度/富集前的M18純度。鑒定引物序列(M18特異引物)如下5’ -ATATGCTAGCGATATTCAGATGACACAGACT-3’ ；5 ’ -GCGTTTGCCATCTTTTCATAATCAAAATCACC-3’。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果如圖5所示。當(dāng)用于實(shí)驗(yàn)的混合懸浮液中展示M18細(xì)菌原生質(zhì)體的純度為 0. 時(shí)，富集后的M18純度為2%，流式分選的富集效率為20倍。當(dāng)用于實(shí)驗(yàn)的混合懸浮 液中展示M18細(xì)菌原生質(zhì)體的純度為5%時(shí)，富集后的M18純度為65.6%，流式分選的富集 效率為13倍。當(dāng)孵育溫度為37度、孵育時(shí)間為0. 5h時(shí)，結(jié)果與圖5所示結(jié)果無顯著差異。當(dāng)孵育溫度為37度、孵育時(shí)間為2h時(shí)，結(jié)果與圖5所示結(jié)果無顯著差異。當(dāng)孵育溫度為30度、孵育時(shí)間為0. 5h時(shí)，結(jié)果與圖5所示結(jié)果無顯著差異。
當(dāng)孵育溫度為30度、孵育時(shí)間為2h時(shí)，結(jié)果與圖5所示結(jié)果無顯著差異。綜合實(shí)驗(yàn)(一)和(二)，結(jié)果表明，當(dāng)用于實(shí)驗(yàn)的混合懸浮液中展示M18細(xì)菌原 生質(zhì)體數(shù)目占所有原生質(zhì)體數(shù)目的0. 1 %時(shí)，淘選表現(xiàn)出更好的富集效率，為64倍。當(dāng)用于 實(shí)驗(yàn)的混合懸浮液中展示M18細(xì)菌原生質(zhì)體數(shù)目占所有原生質(zhì)體數(shù)目的5%時(shí)，流式分選 擁有比淘選更優(yōu)異的富集效率，流式分選的富集效率為13倍，淘選的富集效率為5倍。淘選比流式分選更容易操作，不需要進(jìn)行復(fù)雜的流式分選，并且能夠回收更多的 編碼抗體基因的質(zhì)粒，不需要分選后PCR回首抗體基因，可以直接電轉(zhuǎn)化細(xì)菌回收擴(kuò)增質(zhì) 粒。當(dāng)特異抗體比例達(dá)到一定值時(shí)，流式更容易通過親和力的強(qiáng)弱將高親和力的抗體迅速 的篩選富集出來。(三)淘選法和流式分選法結(jié)合將展示26-10抗體的細(xì)菌原生質(zhì)體的懸浮液與展示M18的細(xì)菌原生質(zhì)體的懸浮液 混合，得到混合懸浮液，使混合懸浮液中展示M18的細(xì)菌原生質(zhì)體與展示26-10抗體的細(xì)菌 原生質(zhì)體的數(shù)目比為1 1000或1 104，然后將混合懸浮液分別進(jìn)行如下篩選。(1) 一輪淘選和一輪流式分選步驟1 按照實(shí)驗(yàn)(一)中所述方法進(jìn)行淘選篩選，從篩選產(chǎn)物中回收表達(dá)抗體的 質(zhì)粒，將回收的表達(dá)抗體的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)于E. coli Jude-I電化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂 布于含有氯霉素的LB固體選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。統(tǒng)計(jì)富集效率。步驟2 將步驟1得到的陽性轉(zhuǎn)化子制成細(xì)菌原生質(zhì)體，再按照實(shí)驗(yàn)(二)中所述 方法進(jìn)行流式分選。將分選得到的復(fù)合物按照實(shí)驗(yàn)(二)中所述方法進(jìn)行富集效率統(tǒng)計(jì)。(2) 二輪淘選和一輪流式分選步驟1 按照實(shí)驗(yàn)(一)中所述方法進(jìn)行淘選篩選，從篩選產(chǎn)物中回收表達(dá)抗體的 質(zhì)粒，將回收的表達(dá)抗體的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)于E. coli Jude-I電化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂 布于含有氯霉素的LB固體選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。統(tǒng)計(jì)富集效率。步驟2:將步驟1得到的陽性轉(zhuǎn)化子制成細(xì)菌原生質(zhì)體，按照實(shí)驗(yàn)(一)中所述 方法進(jìn)行淘選篩選，從篩選產(chǎn)物中回收表達(dá)抗體的質(zhì)粒，將回收的表達(dá)抗體的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)于 E. coli Jude-I電化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂布于含有氯霉素的LB固體選擇培養(yǎng)基 上篩選轉(zhuǎn)化子。統(tǒng)計(jì)富集效率。步驟3 將步驟2得到的陽性轉(zhuǎn)化子制成細(xì)菌原生質(zhì)體，再按照實(shí)驗(yàn)(二)中所述 方法進(jìn)行流式分選。將分選得到的復(fù)合物按照實(shí)驗(yàn)(二)中所述方法進(jìn)行富集效率統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，當(dāng)樣品中展示M18的細(xì)菌原生質(zhì)體的純度為0. 時(shí)，通過一輪淘選篩 選，M18抗體的純度為5. 1 %，富集效率為51倍；然后通過一輪流式分選，M18抗體的純度 能達(dá)到65. 6% ；—輪淘選加上一輪流式分選，總共富集了 656倍，達(dá)到了明顯的富集效果。 當(dāng)樣品中展示M18細(xì)菌原生質(zhì)體的純度為0.01%時(shí)，兩輪淘選篩選后，M18抗體的純度為 6. 25%，富集效率為625倍；富集產(chǎn)物接著再進(jìn)行一輪流式分選，則富集產(chǎn)物中M18純度為 72.9%，通過兩輪淘選和一輪流式分選，總共獲得了 > 7200倍的富集效果。此結(jié)果充分的 說明了本發(fā)明方法能夠有效地篩選特異識(shí)別人細(xì)胞表面抗原的抗體。本發(fā)明采用了兩步法的策略來富集細(xì)菌原生質(zhì)體，它結(jié)合了淘選和流式分選的優(yōu) 點(diǎn)，同時(shí)又彌補(bǔ)了相互的缺點(diǎn)，可大大提高篩選效率。當(dāng)特異抗體濃度 1000時(shí)，采用
17淘選來富集以增加特異抗體的比例。然后利用流式的定量分選能力，將具有更高親和力的 抗體富集出來。
權(quán)利要求
一種篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白的方法，包括如下步驟1)將目標(biāo)蛋白展示于離體真核細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，得到表面展示有目標(biāo)蛋白的真核細(xì)胞；2)將待篩選蛋白庫中的各蛋白分別展示于細(xì)菌原生質(zhì)體表面，得到表面展示有待篩選蛋白的細(xì)菌原生質(zhì)體庫；3)將步驟1)得到的真核細(xì)胞與步驟2)得到的細(xì)菌原生質(zhì)體庫共同孵育，使展示于所述真核細(xì)胞表面的目標(biāo)蛋白和展示于所述細(xì)菌原生質(zhì)體表面的蛋白之間發(fā)生特異性的相互配對(duì)，得到所述真核細(xì)胞與所述細(xì)菌原生質(zhì)體的特異性結(jié)合物，將所述結(jié)合物從孵育體系中分離出來；4)從步驟3)得到的結(jié)合物中分離得到與展示于真核細(xì)胞表面的目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的目的蛋白或目的蛋白的編碼基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中，所述孵育的條件包括所 述孵育體系的PH值為5. 0-7. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中，所述孵育的條件包括所 述孵育體系的 PH 值為 5. 0,5. 3,5. 5,5. 8,6. 0,6. 3,6. 5,6. 8,7. 0，7. 3 或 7. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述孵育的條件是 溫度為30-37°C和時(shí)間為0. 5-2小時(shí)；所述溫度具體為30°C或37°C，所述時(shí)間具體為0. 5小 時(shí)或1小時(shí)或2小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，步驟3)中，將所述結(jié)合物從孵育 體系中分離出來的步驟是，首先使用平板淘選法篩選，然后使用流式分選法分選。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，使用流式分選法的步驟為首先從所述孵 育體系中去除未同所述真核細(xì)胞形成特異性結(jié)合物的細(xì)菌原生質(zhì)體，再通過流式細(xì)胞儀篩 選，收集所述真核細(xì)胞與原生質(zhì)體發(fā)生特異性結(jié)合的結(jié)合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于從所述孵育體系中去除未同所述真核細(xì) 胞形成特異性結(jié)合物的細(xì)菌原生質(zhì)體的步驟為將所述的孵育體系常溫300g離心1. 5-3分 鐘后，收集沉淀，棄去上清。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述將目標(biāo)蛋白展示于真核細(xì)胞的細(xì)胞膜表面是由包括如下步驟的方法 制備得到的將含有所述目標(biāo)蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入所述真核細(xì)胞中，得到重 組真核細(xì)胞，培養(yǎng)該重組真核細(xì)胞并誘導(dǎo)所述重組載體的表達(dá)，得到所述表面展示有目標(biāo) 蛋白的真核細(xì)胞；步驟2)中，將待篩選蛋白庫中的各蛋白分別展示于細(xì)菌原生質(zhì)體表面的方法包括如 下步驟將待篩選蛋白的編碼基因插入細(xì)菌表達(dá)載體中，得到表達(dá)所述待篩選蛋白的重組 載體，將所述表達(dá)待篩選蛋白的重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)菌，得到重組細(xì)菌，培養(yǎng)所述重組細(xì)菌 并誘導(dǎo)所述重組載體的表達(dá)，再提取重組細(xì)菌的原生質(zhì)體，得到所述表面展示有待篩選蛋 白的細(xì)菌原生質(zhì)體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于，所述含有所述目標(biāo)蛋白的編碼 基因的重組載體是受四環(huán)素調(diào)控的重組載體；所述培養(yǎng)該重組真核細(xì)胞并誘導(dǎo)所述重組載 體的表達(dá)的方法為將插入外源基因后的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入所述真核細(xì)胞，并用四環(huán)素誘導(dǎo)所述真核細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)菌中還轉(zhuǎn)入用于通過熒光 信號(hào)篩選原生質(zhì)體的熒光蛋白表達(dá)載體。所述熒光蛋白表達(dá)載體可以是在細(xì)菌中表達(dá)任何 顏色熒光蛋白質(zhì)的載體，優(yōu)選為PBAD30-KmR-GFPmut2。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)蛋白的編碼基因 是人源化的；所述真核細(xì)胞是人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299 ；所述真核表達(dá)載體為真核細(xì) 胞膜表面展示載體；所述真核細(xì)胞膜表面展示載體是核苷酸序列是SEQ ID 6所示的載體 pUHD10-3-display。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)菌為大腸桿菌，優(yōu) 選為 E.coli Jude-I0
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一所述的方法，其特征在于，所述步驟4)中，所述從結(jié)合物 中分離得到目的蛋白或目的蛋白的編碼基因的方法包括如下步驟從所述結(jié)合物中提取所 述表達(dá)目的蛋白的重組載體，對(duì)重組載體進(jìn)行測(cè)序，得到所述目的蛋白的編碼基因。
14.一種輔助鑒定蛋白是否與目標(biāo)蛋白結(jié)合的方法，包括如下步驟1)將目標(biāo)蛋白展示于離體真核細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，得到表面展示有目標(biāo)蛋白的真核細(xì)胞；2)將待鑒定蛋白庫中的各蛋白分別展示于細(xì)菌原生質(zhì)體表面，得到表面展示有待鑒定 蛋白的細(xì)菌原生質(zhì)體庫；3)將步驟1)得到的真核細(xì)胞與步驟2)得到的細(xì)菌原生質(zhì)體庫共同孵育，使展示于所 述真核細(xì)胞表面的目標(biāo)蛋白和展示于所述細(xì)菌原生質(zhì)體表面的蛋白之間發(fā)生特異性的相 互配對(duì)，得到所述真核細(xì)胞與所述細(xì)菌原生質(zhì)體的特異性結(jié)合物，檢測(cè)孵育的體系中是否 含有所述特異性結(jié)合物，若含有所述特異性結(jié)合物，則所述待鑒定蛋白與所述目標(biāo)蛋白結(jié) 合，若不含有所述特異性結(jié)合物，則所述待鑒定蛋白不與所述目標(biāo)蛋白結(jié)合。
15.一種用于篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白的試劑盒，由真核細(xì)胞、真核細(xì)胞表達(dá)載 體、用于制備原生質(zhì)體的細(xì)菌、原生質(zhì)體展示載體、在原生質(zhì)體中表達(dá)熒光蛋白以便于篩選 的載體組成。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其特征在于，所述真核細(xì)胞為人非小細(xì)胞肺癌 細(xì)胞株H1299 ；所述真核細(xì)胞表達(dá)載體為pUHDlO-3-display ；所述細(xì)菌為大腸桿菌菌株 Jude-I ；所述表達(dá)熒光蛋白的載體為pBAD30-KmR-GFPmut2。
17.權(quán)利要求15-16所述試劑盒在篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白中的應(yīng)用。
18.細(xì)菌原生質(zhì)體展示方法在篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的目的蛋白中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選抗體的方法。該方法包括如下步驟1)將目標(biāo)蛋白展示于離體真核細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，得到表面展示有目標(biāo)蛋白的真核細(xì)胞；2)將待篩選蛋白庫中的各蛋白分別展示于細(xì)菌原生質(zhì)體表面，得到表面展示有待篩選蛋白的細(xì)菌原生質(zhì)體庫。本發(fā)明提供了利用APEx展示技術(shù)應(yīng)用于以完整的人細(xì)胞為抗原篩選特異識(shí)別人細(xì)胞表面抗原的抗體的一種篩選方法。APEx細(xì)菌展示系統(tǒng)擁有與噬菌體展示系統(tǒng)相當(dāng)大小的抗體庫(≥109)，并且具有展示完整的IgG抗體的能力。此方法的建立，有助于篩選更多識(shí)別細(xì)胞表面分子標(biāo)記的抗體，對(duì)疾病診斷和治療都將起到巨大的推動(dòng)作用。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101948534SQ20101025736
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者杭海英, 邱俊康 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生物物理研究所