專利名稱：：用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的競爭elisa試劑盒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明為檢測非洲豬瘟病毒(ASFV)抗體檢測試劑盒，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體而言，本發(fā)明涉及一種動物檢疫中檢測抗體的ELISA試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
：非洲豬瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸的烈性傳染性疾病。其特征為病程短、病死率高率，可高達(dá)100%，臨床癥狀和病理變化均類似于急性豬瘟，在診斷時極易誤診，表現(xiàn)高熱、皮膚充血發(fā)紺、流產(chǎn)、7K月中及臟器出血。(William,HessAdv.Africanswinefever:areassessment[J].VetSciCompMed，1981，25:3969)世界動物組織(0IE)列為A類疫病，我國規(guī)定為動物一類疾病，受到世界各國的高度重視(孫懷昌.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，1999，21(2):117119)。本病自1921年在肯尼亞發(fā)現(xiàn)以來，一直存在于撒哈拉以南的非洲國家，1957年先后流傳至西歐和拉美國家，多數(shù)被及時撲滅，單在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁島仍有流行，截至目前已在非洲、歐洲和美洲等數(shù)十個國家流行，而且有不斷蔓延趨勢。2007年，亞美尼亞連續(xù)發(fā)生六起非洲豬瘟，我國尚無該病。非洲豬瘟在國際病毒分類委員會第四次報告中歸于虹彩病毒科，在該委員會第五次報告中將其列在痘病毒科之下，置于該科的脊椎動物痘病毒亞科及昆蟲痘病毒亞科之外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之間的特征，ASFV的這一特性表明它不屬于國際病毒分類委員會所核定的任何一科，是個新科，1995年第9次國際病毒分類委員第六次報告，將非洲豬瘟病毒列入“類非洲豬瘟病毒屬”，非洲豬瘟是唯一已知的代表種。非洲豬瘟病毒是一種大的、有囊膜的雙鏈DNA病毒，是唯一的蟲媒DNA病毒。其基因組為末端共價閉合的單分子線狀雙鏈DNA，病毒基因組全長為170kb190kb，中央有125kb左右的保守區(qū)，兩端為可變區(qū)，含有末端反轉(zhuǎn)重復(fù)序列，這些重復(fù)序列的增加或者缺失是造成不同分離株基因組長度差異的主要原因(Rafael，Yancz,JavierM，etal.AnalysisofthecompleteNucleotideSequenceofAficanSwineFeverVirus[J].Virology,1995，208249279)。ASF病毒基因組有5個編碼基因，包括假定膜蛋白、分泌性蛋白、參與核甘酸和核酸代謝(DNA修復(fù))以及蛋白修飾的酶，整個基因組含有151個0RF，可以編碼150200種蛋白質(zhì)，已從ASFV感染的細(xì)胞中分離鑒定出86種病毒蛋白多肽(曲連東，于康震，非洲豬瘟研究進(jìn)展，中國獸醫(yī)科技，1998,28(11):4243)。非洲豬瘟病毒大多數(shù)毒株的毒力都很強(qiáng)，但是免疫原性很低，只有少數(shù)幾個蛋白具有免疫原性。實(shí)驗(yàn)證明，P30蛋白為具有較好抗原性的蛋白之一，蛋白分子量約為36KD。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是以原核表達(dá)的重組蛋白為基礎(chǔ)，通過酶聯(lián)免疫技術(shù)研制一種檢測非洲豬瘟病毒抗體的競爭ELISA試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的競爭ELISA試劑盒，所述的試劑盒包括由保藏號為CGMCCNO.3771雜交瘤細(xì)胞系分泌的抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的酶標(biāo)記物。還包括ELISA板條、血清稀釋液和濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照。上述用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的競爭ELISA試劑盒包括所述ELISA板條每個試劑盒裝有2塊或5塊ELISA微孔板，每塊ELISA板條為能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原為原核表達(dá)的P30蛋白，規(guī)格為8孔X12條；所述血清稀釋液和濃縮洗滌液血清稀釋液為即用型，洗滌液為25倍濃縮，使用前稀釋；所述底物顯色液即用型TMB顯色液，50mL；所述終止液2mol/L的H2S04溶液，50mL；所述酶標(biāo)單克隆抗體所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗P30單克隆抗體，使用前100倍稀釋；陽性對照；陰性對照。所述的競爭ELISA試劑盒在檢測非洲豬瘟病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是建立一種準(zhǔn)確、快速、可進(jìn)行大量篩查的非洲豬瘟病毒抗體檢測的方法，為動物檢驗(yàn)檢疫部門提供了一套實(shí)用性強(qiáng)、效果可靠的診斷試劑盒產(chǎn)品。圖1為重組P30蛋白純化后SDS-PAGE圖。圖2為重組P30蛋白純化后westernblotting圖。具體實(shí)施例方式抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCNO.3771，保藏日2010-04_22，分類命名雜交瘤細(xì)胞株。下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案如下一、建立細(xì)胞系1.抗原制備a)非洲豬瘟P30蛋白的表達(dá)根據(jù)GenBank中非洲豬瘟(ASFV)P30基因序列，設(shè)計合成了1對引物，采用PCR方法從ASFVDNA中擴(kuò)增出P30基因片段，將其克隆到表達(dá)載體pET28b中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PET-P30，測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。設(shè)計的引物為P30-1-5，-GCGGATCCTAATTTTAAAATTGAATGGAT-3‘P30-2-5，-GTCTCGAGCCCAATCAAAATTAGATAACT-3‘下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn)，P30-1為ASFVP30基因上游擴(kuò)增引物，引入的酶切位點(diǎn)為BamHI；P30-2為ASFVP30基因下游擴(kuò)增引物，引入的酶切位點(diǎn)為Xhol。b)非洲豬瘟P30蛋白的純化誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集誘導(dǎo)后菌體，用PBS洗滌重懸菌體，超聲裂解(超聲ls，間隔ls，共lOmin)，12000rpm離心，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析。蛋白純化時使用鎳離子親和層析柱，純化后，經(jīng)SDS-PAGE、westernblotting鑒定，獲取到單一條帶，并具備較好的抗原性(見附圖1，2)。使用BCA法測定純化后蛋白含量，標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對應(yīng)的0D值見表1。純化后P30蛋白的0D值為2.25，與標(biāo)準(zhǔn)品比較后，其濃度為1700iig/ml。表1BCA法測定標(biāo)準(zhǔn)品蛋白含量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.抗原免疫以純化的非洲豬瘟病毒P30蛋白為抗原，常規(guī)方法免疫6周齡BALB/c小鼠，首次基礎(chǔ)免疫皮下注射抗原200μg，使用完全弗氏佐劑；每隔3周進(jìn)行一次免疫，共三次，50μg/只/次，最后一次基礎(chǔ)免疫后3周后脾內(nèi)注射加強(qiáng)免疫，25μg/只，免疫完成。3.雜交瘤細(xì)胞的制備a)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備以BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞。融合前1天，將小鼠拉頸處死，體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射IOmlRPMI1640培養(yǎng)液至腹腔，反復(fù)沖洗，回收沖洗液，1000r/min離心10分鐘，棄上清。用含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為2XlO5Ail。將上述細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml，置37°C，6%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。b)免疫脾細(xì)胞的制備取免疫完成后的BALB/c小鼠，通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘，無菌條件下取出脾臟，至于平皿中，RPMI1640培養(yǎng)液清洗1次。將脾臟移入另一盛有IOmlRPMI1640培養(yǎng)液的平皿中，使脾細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)液。用吸管吹打數(shù)次。過濾，收獲脾細(xì)胞懸液，lOOOr/min離心10分鐘，用RPMI1640培養(yǎng)液離心洗滌2次，然后將細(xì)胞重懸，計數(shù)，用于細(xì)胞融合。c)骨髓瘤細(xì)胞于融合前48-36小時，將骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，融合當(dāng)天，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁輕輕吹下，收集于50ml離心管。lOOOr/min離心10分鐘，棄去上清。加入30ml不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于IOml不完全培養(yǎng)基，混勻。取骨髓瘤細(xì)胞懸液，計數(shù)，用于細(xì)胞融合。d)細(xì)胞融合及HAT選擇雜交瘤將骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按110比例混合，在50ml離心管內(nèi)用RPMI1640培養(yǎng)液洗1次，1200r/min，離心lOmin，棄上清，用滴管小心吸出殘留液體。在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻，置40°C水浴中預(yù)熱。在45秒時加入預(yù)熱至40°C的50%PEG(PH8.0)1ml，作用90秒。加入20ml預(yù)熱至37°C的RPMI1640培養(yǎng)液，室溫靜置10分鐘。lOOOr/min，離心5min，棄去上清。加入5mlHAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補(bǔ)加含飼養(yǎng)細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基至80ml。分裝96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.1ml，然后將培養(yǎng)板置37°C，6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24小時后用HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基，48小時后完全換液。兩周后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基，再維持兩周后，改用RPMI1640培養(yǎng)液。4.雜交瘤細(xì)胞的篩選雜交瘤細(xì)胞融合兩周后，按照常規(guī)免疫酶技術(shù)進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選。篩選出能分泌抗非洲豬瘟病毒抗體的雜交瘤孔。5.雜交瘤的克隆化和凍存a)雜交瘤細(xì)胞的克隆克隆化方案為有限稀釋法，按照常規(guī)雜交瘤細(xì)胞克隆方法進(jìn)行，同法克隆進(jìn)行三次。b)雜交瘤細(xì)胞的凍存細(xì)胞凍存液50%小牛血清+40%RPMI1640培養(yǎng)液+10%二甲基亞砜將雜交瘤細(xì)胞離心，重新懸浮于預(yù)冷的凍存液中，濃度為IO6-IO7Ail，轉(zhuǎn)移至凍存管中，每瓶lml。置于-70°C冰箱中，次日轉(zhuǎn)入液氮中。將制備的抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCNO.3771，保藏日2010-04_22，分類命名雜交瘤細(xì)胞株。二、單克隆抗體制備本發(fā)明中，大量生產(chǎn)單克隆抗體的方案為小鼠腹水法，步驟如下本方案將上述獲得的雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，得到大量的腹水單抗。具體方法為BALB/c小鼠腹腔接種液體石蠟，每只小鼠0.5ml。兩周后，腹腔接種用無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠5X105/0.2ml。間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待腹水盡可能多而小鼠瀕于死亡時，處死小鼠，無菌條件下將腹水吸出。室溫靜止30min，1000r/min，離心lOmin，收集上清，分裝，_70°C凍存?zhèn)溆?。三、單克隆抗體純化及辣根過氧化酶標(biāo)記1.單克隆抗體的純化上述獲得的腹水單抗的純化方案為辛酸_硫酸銨沉淀法。取1份預(yù)處理過的腹水加2份0.06mol/LρΗ5·O醋酸緩沖液，用lmol/LHCl調(diào)pH至4.8；按每毫升稀釋腹水加Ilul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30分鐘內(nèi)加完，4°C靜置2小時，取出12000r/min離心30min，棄沉淀；上清經(jīng)尼龍篩過濾(125um)，加入1/10體積的0.01mol/LPBS，用lmol/LNaOH調(diào)pH至7.2；在4°C下加入飽和硫酸銨至45%飽和度，輕輕混勻30min，靜置1小時；12000r/min離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量PBS中，對50-100倍體積的PBS透析，4°C過夜；取出12000r/min離心30min，除去不溶性沉淀，分裝，凍存?zhèn)溆谩?.單克隆抗體的辣根過氧化酶標(biāo)記純化后的單克隆抗體的酶標(biāo)記物的制備方案為過碘酸鈉法，具體步驟如下稱取5mgHRP溶解于Iml蒸餾水中；向其中加入0.2ml新配的0.IMNaIO4溶液，室溫避光攪拌20分鐘；對ImMpH4.4的醋酸鈉緩沖液中透析，4°C過夜；向其中再加入20μ10.2ΜρΗ9.5的碳酸鹽緩沖液，使以上醛化物的pH升高到9.0，然后立即加入溶于0.OlM碳酸鹽緩沖液的單克隆抗體純品5mg(10mg/ml)，室溫避光輕柔攪拌2小時；加入0.Iml新配的4mg/mlNaBH4,混勻，4°C放置2小時；所得產(chǎn)物對0.15MpH7.4PBS中4°C透析過夜。透析完成后，在攪拌中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C1小時。3000r/min離心30min，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中。將上述溶液裝入透析袋中，對0.15MpH7.4的PBS緩沖液透析，取出銨離子，10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，凍存。四、標(biāo)準(zhǔn)ASFV陽性血清及標(biāo)準(zhǔn)ASFV陰性血清的制備在ELISA檢測過程中，不同的操作人員和不同的檢測批次間會存在一定的誤差，操作誤差會導(dǎo)致檢測樣品OD值的誤差。本發(fā)明研制了標(biāo)準(zhǔn)ASFV抗體陽性對照血清和標(biāo)準(zhǔn)ASFV抗體陰性對照血清，用于檢測條件的優(yōu)化和檢測結(jié)果的判定。a)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的制備取健康成年家兔，體重2_3kg，剪去兩后腳掌的部分兔毛，用碘酒消毒皮膚。第一次免疫，用注射器吸取弗式完全佐劑(FCA)乳化的抗原(純化后重組P30)(以下稱FCA-P30)液1ml，每側(cè)腳掌皮下各注入0.5ml。間隔10-14天后，進(jìn)行第二次免疫，與兩側(cè)胭窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入弗式不完全佐劑(FIA-P30)，每個淋巴結(jié)0.1ml，其余注入淋巴結(jié)附近的皮下共1ml。間隔7-10天后，從耳靜脈采血0.5-1.0ml，分離血清，采用ELISA方法檢測血清效價，抗體效價可達(dá)到1100以上。采用心臟采血法采血，將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中。將三角燒瓶的血置37°C溫箱1小時，再置4°C冰箱3小時。待血液凝固血塊收縮后，用滴管吸取血清，3000r/min離心15min，取上清，加入終濃度為0.01%的硫柳汞防腐，分裝后，-20°C保存。b)標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的制備取經(jīng)檢驗(yàn)合格的SPF兔，心臟采血，分離血清，加入萬分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml分裝于無菌管中，-20°C保存。五、試劑盒的建立a)本發(fā)明試劑盒的檢測原理采用競爭法，將重組的非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白P30包被于微孔板中，然后用BSA將酶標(biāo)板封閉，加入待測樣本及標(biāo)準(zhǔn)陽性對照、陰性對照。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的非洲豬瘟病毒抗體能與酶標(biāo)板中包被的P30抗原反應(yīng)，加入針對P30的酶標(biāo)單克隆抗體后參與結(jié)合表位的競爭。隨后，加入辣根過氧化物酶底物TMB顯色，終止液終止反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀在450nm波長下，測定各孔吸光度值，OD值的大小(終止顯色反應(yīng)后顏色的深淺)與待測樣本中非洲豬瘟病毒抗體的含量成反比。b)本發(fā)明試劑盒的組成a)酶標(biāo)板的最佳制備方法用pH9.60.05M的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，將上述制備的純化后重組P30蛋白稀釋后，按IOOul/孔加入微孔板中，保證每孔中的P30含量為0.2ug。4°C包被過夜，次日，棄去包被液，按200ul/孔加入1%BSA的封閉液，37°C靜置2小時，洗滌甩干。室溫干燥后裝入包裝袋，加入干燥劑，真空保存。b)工作試劑的配置洗滌液(pH7.4,0.15MPBS)=KH2PO40.2g,Na2HPO4-12H202.9g,NaCl8.0g,KCl0.2g，Tween-20(0.05%)0.5ml，加蒸餾水至1000ml。濃縮成25倍作為存儲液。血清稀釋液牛血清白蛋白0.lg，加洗滌緩沖液至IOOml底物緩沖液(pH5.0磷酸檸檬酸)0.2MNa2HPO425.7ml，0.IM檸檬酸24.3ml，加蒸餾水50mlTMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液TMB(10mg/5ml無水乙醇)0·5ml，底物緩沖液10ml，0.75%H2O232ul終止液(2MH2SO4)蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98%)21.7mlc)檢測非洲豬瘟的競爭ELISA試劑盒的組建組建檢測非洲豬瘟的酶聯(lián)免疫試劑盒，包含以下組分96孔酶標(biāo)板辣根過氧化物酶標(biāo)記的單抗標(biāo)準(zhǔn)陽性對照標(biāo)準(zhǔn)陰性對照濃縮洗滌液血清稀釋液TMB底物終止液產(chǎn)品說明書六、樣品中非洲豬瘟病毒抗體的檢測a)用上述制備的試劑盒進(jìn)行檢測1)將待測血清、陽性對照及陰性對照用抗體稀釋液按比例稀釋，每孔100μ1加入酶標(biāo)板，37°C孵育1小時。洗滌液清洗3-5次。2)每孔加入稀釋后酶標(biāo)單克隆抗體100μ1，37°C孵育30min，洗滌液清洗3_5次。3)每孔加入TMB底物液100μ1，室溫避光反應(yīng)10-15分鐘。4)每孔加入100μ12ΜH2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測450nm吸光度值。b)檢測結(jié)果分析i.測中陰性對照血清(NC)的OD值至少是陽性對照血清(PC)的4倍時，檢測被認(rèn)為有效。NC/PC^4陽性CutOff=NC-[(NC-PC)X0.5]陰性CutOff=NC-[(NC-PC)X0.4]其中NC=陰性對照血清OD值PC=陽性對照血清OD值ii.檢測時使用復(fù)孔，最終使用OD值為兩個的平均值。當(dāng)血清樣本的OD值低于陽性CutOff值時，該樣本為ASFV抗體陽性。當(dāng)血清樣本的OD值高于陰性CutOff值是，該樣本為ASFV抗體陰性。當(dāng)血清樣本的OD值在兩個CutOff值之間時，被認(rèn)為可疑，對于該樣本應(yīng)重新測試，或者采用其他檢測方法確認(rèn)。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求一種用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的競爭ELISA試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括由保藏號為CGMCCNO.3771雜交瘤細(xì)胞系分泌的抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的酶標(biāo)記物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的競爭ELISA試劑盒，其特征在于，還包括ELISA板條、血清稀釋液和濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的競爭ELISA試劑盒，其特征在于，所述ELISA板條每個試劑盒裝有2塊或5塊ELISA微孔板，每塊ELISA板條為能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原為原核表達(dá)的P30蛋白，規(guī)格為8孔X12條；所述血清稀釋液和濃縮洗滌液血清稀釋液為即用型，洗滌液為25倍濃縮，使用前稀釋；所述底物顯色液即用型TMB顯色液，50mL；所述終止液2mol/L的H2SO4溶液，50mL；所述酶標(biāo)單克隆抗體所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗P30單克隆抗體，使用前100倍稀釋；陽性對照；陰性對照。4.權(quán)利要求1所述的競爭ELISA試劑盒在檢測非洲豬瘟病毒中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于檢測非洲豬瘟病毒抗體的競爭ELISA試劑盒及其用途，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。試劑盒采用原核表達(dá)的重組P30蛋白作為包被抗原，依據(jù)競爭ELISA原理檢測豬血清中非洲豬瘟病毒的抗體。試劑盒中96孔板中的包被抗原為原核表達(dá)的重組P30蛋白，其具有良好的抗原性。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒包括P30蛋白包被的96孔板、陽性對照、陰性對照、辣根過氧化酶標(biāo)記的單克隆抗體、濃縮洗滌液、血清稀釋液、TMB底物、終止液。本發(fā)明試劑盒可用于大批樣品的篩查，試劑盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便。文檔編號G01N33/577GK101825633SQ20101015403公開日2010年9月8日申請日期2010年4月23日優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日發(fā)明者侯艷梅,張瑞,欒慎順,王濤,肖妍,董志珍,趙祥平申請人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心