專利名稱：：用于感染性物質(zhì)檢測的樣品制備的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及改進疾病檢測的方法、用于檢驗待測樣品中疾病指示部分存在的改進方法以及用于實施該方法的試劑盒。
背景技術：
：對患者樣品進行疾病檢測的理想狀況是，該檢測能提供可靠的疾病特異性結果，并且該檢測不給出高水平的假陽性或假陰性的結果。疾病檢測可以通過檢測樣品中的特異的分析物，例如通過檢測特異性抗原或抗原的片段、抗體或抗體的片段，或核酸序列。優(yōu)選患者的樣品在檢測前需要以最小量制備和處理。還優(yōu)選患者的樣品可以通過完全或相對無損傷的方式獲得。一種傳統(tǒng)的用于檢測待測溶液中分析物的存在的方法包括捕獲所述分析物于浸漬片(dipstick)上，并檢查該分析物在浸漬片上的存在。所述浸漬片具有與待測溶液接觸的接觸端和遠離接觸端的捕獲帶。所述待測溶液被記錄下從接觸端向捕獲帶移動，在所述捕獲帶中該待測溶液中存在的所有分析物將被捕獲，并給出適當?shù)娘@示作為讀出數(shù)據(jù)。已知的浸漬片種類應用抗體-抗原反應檢測分析物。所述分析物可以直接指示由感染性物質(zhì)導致的感染，或間接指示疾病的狀態(tài)。在受控試驗條件下(特別是在實驗室試驗條件下)，對最優(yōu)化的樣品進行檢測試驗是可能的。所述樣品可以從被檢測的分析物的“載量”方面(即生物載量)和其中存在被檢測的分析物的待測樣品的質(zhì)量和數(shù)量方面予以優(yōu)化。相反地，在許多臨床情況中，患者的樣品采集于亞最適(suboptimal)條件。此外患者的樣品還可能本身即為亞最適的例如患者樣品間的載量存在廣泛的差異和/或可能與許多可能會干擾檢測過程的其他物質(zhì)混合和污染。另外，這些物質(zhì)可能會在個體樣品間的數(shù)量和/或組成方面存在相差很大的差異。所述個體間的差異可能依賴于生理學條件、健康狀況和/或飲食習慣。因而一些在緩沖液中才有效的檢測可能給出不可靠的結果或可能在應用于實際的患者樣品時完全失敗。與上述有關的一個例子是沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis，CT)的檢測，所述沙眼衣原體是導致婦女不孕癥和盆腔炎的原因。圖1顯示了當CT的原生小體(EB)在緩沖液中被穿刺與其在陰道液體中被穿刺相比較的檢測水平?？梢钥吹接捎陉幍罉悠分幸种菩晕镔|(zhì)的存在而導致其檢測信號降低了約100倍。手工或自動檢測如酶免疫測定(EIA)依賴于連續(xù)的試劑孵育和洗滌步驟以提高檢測的靈敏度和降低樣品對檢測結果的抑制作用。然而就浸漬片分析來說，生物樣品本身即作為液體來溶解干試劑以滲透于浸漬片。因為這里不存在孵育或洗滌的步驟并且因為其反應是快速的，所以由所述樣品的質(zhì)量所產(chǎn)生的影響是特別重要的。Arko等人(JournalofClinicalMicrobiology(1979)，9，517-519)公開了在用于檢測淋病奈瑟球菌的玻片凝集試驗(SAT)中核酸酶對特異細胞凝集的增強作用。然而該試驗是在實驗室培養(yǎng)物上進行的(生長在瓊脂上的細菌細胞懸浮于含有每毫升1mg脫氧核糖核酸酶的磷酸鹽緩沖液中)。該文獻沒有公開如何改善患者樣品的檢測(特別是子宮頸內(nèi)液體樣品或陰道液體樣品)，也沒有公開除SAT之外核酸酶處理還可以提高哪些檢測。事實上，核酸酶處理并不改善在熒光抗體試驗中淋球菌的熒光染色。Tarkowski等人(MolecularDiagnosis(2001)，6(2)，125-130)描述了改良的用于分離自液態(tài)細胞學樣品的病毒RNA的檢測?？偤怂?TNA)提取自在實驗室培養(yǎng)的細胞系(來自新鮮細胞或來自固定于液態(tài)細胞學介質(zhì)的細胞)。然后用脫氧核糖核酸酶I處理上述提取的TNA以允許通過逆轉(zhuǎn)錄酶-多聚酶鏈式反應分析樣品中的核糖核酸。然而這里沒有公開臨床樣品的檢測，也沒有公開如何經(jīng)過處理來改善檢測的靈敏度、特異性或可靠性。因此，需要提出改良的疾病檢測試驗，其靈敏度、特異性和可靠性能夠達到令人滿意的水平，并且易于應用于患者的樣品，不論該樣品“質(zhì)量”如何。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種改善用以檢測感染性物質(zhì)的亞最適患者樣品“質(zhì)量”的方法。本發(fā)明提供了若干步驟，所述步驟可以單獨或聯(lián)合應用以實現(xiàn)對亞最適患者樣品進行的改良試驗。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了一種用于處理人類患者樣品的方法，用以實現(xiàn)對樣品進行感染性物質(zhì)檢測的診斷方法，其中所述樣品是子宮頸內(nèi)液體樣品或陰道液體樣品，該方法包括在脫氧核糖核酸酶存在下完成診斷方法的步驟。優(yōu)選地用脫氧核糖核酸酶處理子宮頸內(nèi)液體樣品或陰道液體樣品。值得重視的是本發(fā)明不需要預先了解患者樣品的質(zhì)量具有不佳質(zhì)量的樣品會得到改善，已具有高質(zhì)量的樣品會不作變動或作微小的改善?？偟慕Y果是不論樣品最初的質(zhì)量如何，均可以獲得對患者樣品的高度可靠的檢測結果，而不需對樣品進行質(zhì)量檢測。本發(fā)明將詳細描述關于由沙眼衣原體引發(fā)的性傳播性疾病的檢測，所述檢測是通過分析以自身采集的陰道拭子作為樣品類型來完成。但是本發(fā)明將不限于所描述的優(yōu)選的實施例，而是權利要求中所定義的范疇。衣原體作為疾病的重要性CT是在西方國家中最常見的性傳播的病原體。CT的血清型D-K具有世界范圍的分布并且是導致生殖器感染以及與眼和呼吸道相關的感染的原因。衣原體感染可導致嚴重的并發(fā)癥和后遺癥例如盆腔炎(PID)，異位妊娠，女性不孕癥，和嬰兒出生時從感染的母親獲得的圍產(chǎn)期的和先天性感染。由于許多被感染的女性具有輕微的、非特異的癥狀或是無癥狀，所以CT感染經(jīng)常是未確診的。CT感染的篩檢是疾病控制努力的重要組成部分。目前應用EIA或快速檢測對女性的CT感染的診斷需要對盆腔進行檢查。只有擴增的核酸檢測如連接酶鏈反應(LCR)或聚合酶鏈反應(PCR)能夠檢測尿液樣品。應用LCR或PCR的檢測是復雜的，其需要昂貴的儀器并且檢測結果通常在樣品送檢一周后才能得到。使用無損傷的樣品(即尿液或自身采集的陰道拭子)進行快速檢測將允許更多的女性得到檢測，這包括那些或者被盆腔檢查所阻礙或者無法獲得檢查(即因為缺少專業(yè)的內(nèi)外科醫(yī)師)的女性。對來自女性泌尿生殖門診的配對的尿液和陰道拭子的樣品進行的LCR試驗表明尿液中的CT微生物計數(shù)少于陰道拭子中。因此，應用自身采集的陰道拭子樣品具有作為易于采集的無損傷性樣品類型的優(yōu)點。由于其較高的微生物載量使得該樣品的應用與尿液相比還可提高檢測的靈敏度。目前的尿液檢測方案需要在離心前用水稀釋的步驟以降低尿液對檢測的抑制作用。另外，應用尿液作為樣品需要濃縮的步驟，這不但會增加成本也會延長處理時間。與上述有關的一個例子是Clearview衣原體MF(UnipathLTD，Bedford，England)檢測，其中10ml的尿液樣品用等量的蒸餾水或去離子水稀釋，然后在3000g條件下離心15分鐘。雖然目前的實驗沒有關于陰道拭子樣品的產(chǎn)品權利要求，但我們已發(fā)現(xiàn)陰道拭子樣品對于目前的基于抗體的或擴增的DNA衣原體檢測具有抑制作用。這些基于抗體的檢測包括Clearview衣原體MF，QuickVue衣原體(QuidelCorp，CA，USA)，和衣原體OLA(Biostar，CO，USA)。所述Clearview衣原體MF試驗是一種用于檢測女性子宮頸拭子樣品或男性尿液樣品中沙眼衣原體抗原的側(cè)流免疫測定法。如上所述男性尿液樣品需要稀釋和離心的步驟，而拭子樣品不需要。提取包括加入提取劑，在80℃下加熱10分鐘，并讓樣品冷卻至少5分鐘。檢測過程包括將5滴樣品提取物加到檢測裝置的樣品窗中(免疫色譜檢測條)，然后在15分鐘后讀取結果。所述QuickVue衣原體試驗是一種用于檢測子宮頸拭子樣品和細胞刷樣品中衣原體抗原的側(cè)流免疫測定法。作為試驗操作，從子宮頸取得臨床樣品并置于含有提取溶液的試管中；2分鐘后加入中和溶液至試管中。在提取和中和之后，將3滴經(jīng)提取的樣品加入到檢測盒的樣品池中并在10分鐘后讀取結果。所述衣原體OLA是一種用于檢測女性子宮頸拭子樣品和新生兒的結膜樣品中衣原體抗原的光學免疫測定法。該試驗包括用兩種樣品提取劑和一種中和劑從樣品中提取衣原體脂多糖(LPS)，隨后應用光學免疫測定技術對該抗原進行定性檢測。所述檢測或試驗過程包括5個步驟將樣品提取物加到檢測儀器中(孵育5分鐘)，加入偶聯(lián)物(孵育5分鐘)，洗滌，加入底物(孵育5分鐘)，最后洗滌。檢測結果依據(jù)明亮的光源下被試物表面反射的光計算。本發(fā)明開發(fā)了一種快速的免疫色譜條試驗，用于檢測自身采集的陰道拭子的衣原體LPS抗原。為進行此試驗，將所述拭子樣品置于含有提取溶液的試管中。中和樣品的提取物，并將等分試樣加到免疫色譜檢測條中(即“浸漬片”)。檢測結果于15-25分鐘后讀取。樣品制備當已知量的原生小體被穿刺到陰道拭子中(圖1)可觀察到陰道液體對所述分析靈敏度的抑制作用。在陰道液體存在下所產(chǎn)生的信號與緩沖液相比降低了約100倍。在陰道拭子樣品中觀察到至少兩個方面的抑制現(xiàn)象直接抑制抗體-抗原相互作用，和通過阻礙試劑的正常混合和減弱或阻止液體流動來間接抑制試驗。所述陰道樣品含有能直接抑制抗體和其靶抗原(即脂多糖和抗-脂多糖抗體)之間相互作用的成分。這種抑制可能是經(jīng)由物理地阻斷抗體和抗原的結合，隔絕脂多糖目標，或通過對抗體分子所帶電荷進行修飾而反向影響其親和力。所述抑制作用在個體間和同一個體月經(jīng)周期的不同時期之間存在較大的變異。對正常的混合和液體流動的抑制與陰道液體固有的粘度有關。導致上述粘度的兩個主要因素是樣品中粘蛋白的水平和DNA的數(shù)量。一些樣品中的高的粘蛋白水平導致了上述粘度以及大量的DNA趨向于形成凝膠樣基質(zhì)，因而物理地阻塞了膜并阻止或減弱液體的流動。陰道液體在個體之間以及在女性每月的月經(jīng)周期的不同時期之間存在很大的變異。其他一些情況的存在如精液，過度的細菌生長，酵母菌感染，陰道灌洗，和潤滑劑也可能與所述變異有關。一般實施例陰道拭子樣品樣品采集1.使用聚氨基甲酸酯或聚酯(例如滌綸)拭子(在聚苯乙烯或聚丙烯的塑料柄上)采集陰道樣品。棉塞和婦女衛(wèi)生紙也可用于樣品的采集。2.所述拭子從陰道口插入優(yōu)選6cm(3cm至9cm)深并在取出前旋轉(zhuǎn)幾次至少停留10秒鐘。3.在檢測前，所述拭子可在2-8℃下干燥保存也可在樣品采集緩沖液中保存2-4天。樣品制備1.脫氧核糖核酸酶用于降解核酸的應用一些陰道拭子樣品含有大量的脫氧核糖核酸以至形成凝膠樣基質(zhì)，該凝膠樣基質(zhì)趨向于保留液體、阻塞所述硝化纖維膜并抑制試劑移動，因而導致試驗完全失敗。用脫氧核糖核酸酶消化上述脫氧核糖核酸以阻止上述情形發(fā)生。脫氧核糖核酸酶在加到多于0.5μg/ml或每毫升1.5活性單位是有效的，例如0.5-100μg/ml或每毫升1.5-300活性單位。所述脫氧核糖核酸酶所需的量最終取決于樣品中脫氧核糖核酸的量以及酶作用的時間長短。圖4顯示脫氧核糖核酸酶處理對浸漬片分析的有益效果。在一個感染了衣原體的個體的陰道液體中，用脫氧核糖核酸酶處理防止了在所述條的底部的阻塞并使得在檢測線形成了更強的陽性信號。在衣原體陰性的陰道拭子樣品B中，脫氧核糖核酸酶處理防止了在所述條的底部的阻塞，使得程序的對照信號能夠形成。同時，還檢測了神經(jīng)氨酸酶和溶菌酶對陰道液體的抑制特性。然而與脫氧核糖核酸酶不同，它們都始終不具有對陰道液體的抑制現(xiàn)象。神經(jīng)氨酸酶的測試從每毫升陰道樣品提取物3至200活性單位，溶菌酶的測試從每毫升陰道樣品提取物830至100,000活性單位。2.正十二烷基麥芽糖苷作為表面活性物質(zhì)的應用非離子型烷基糖苷特別是正十二烷基麥芽糖苷是最有效的用于從陰道樣品中提取沙眼衣原體脂多糖的表面活性物質(zhì)，從而使其可用于抗體檢測。正十二烷基麥芽糖苷的濃度在重量體積比為0.01％至0.04％時作用最佳，優(yōu)選地為重量體積比在0.015％至0.03％。表1顯示當陰道拭子來自不同的個體(A-G)時，所述每個拭子用20,000衣原體原生小體穿刺，上述添加正十二烷基麥芽糖苷到提取緩沖液中給出了最好的信號結果。3.聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮的應用當使用陰道拭子樣品時聚乙烯醇(PVA)是一種有效的阻斷劑。PVA被認為包被于上述硝化纖維膜的纖維上，從而有效地阻斷其與其他試劑的結合。這使得在捕獲線有更多的試劑用于反應。這還導致試驗背景更干凈。另外，它可通過作為脂多糖的載體或通過增加脂多糖膠束的形成來增強浸漬片試驗的靈敏度。PVA的濃度在重量體積比為0.01％至0.5％時作用最佳。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)也可通過與PVA相似的機理增強上述試驗的靈敏度，并且其濃度在重量體積比為0.2％至2％時作用最佳。表2顯示當陰道拭子來自不同個體(A-G)，所述每個拭子用20,000衣原體原生小體穿刺，對提取溶液中應用或不應用PVA進行試驗，那些在PVA存在下提取的試驗的信號更強。4.H2O2用于氧化抑制性物質(zhì)的應用H2O2的添加可以中和一些陰道樣品的抑制作用。這種作用可能與H2O2作為氧化劑因而通過氧化作用氧化某些抑制性物質(zhì)有關。H2O2最適宜的濃度是重量體積比介于0.5％至3％之間。低于該濃度范圍時效果降低而高于該濃度范圍時會對試驗產(chǎn)生不良的作用。圖2顯示H2O2對不同個體中的沙眼衣原體浸漬片試驗的信號的影響。陰道拭子采集自四個不同的個體(A-D)并用90,000衣原體原生小體穿刺每個拭子。提取步驟在添加或不添加1％H2O2的條件下進行?？梢钥吹皆跊]有經(jīng)過H2O2處理的樣品中沒有觀測到陽性信號，相反在那些經(jīng)過H2O2處理的樣品中都產(chǎn)生了強陽性的信號。由圖3可以說明上述抑制性物質(zhì)主要存在于被處理樣品的溶液部分。來自個體A-D的陰道拭子用每個拭子80,000原生小體穿刺。在提取脂多糖后，一半樣品通過離心純化以除去特殊物質(zhì)得到進一步澄清。檢測離心的和未離心的樣品經(jīng)過或不經(jīng)過H2O2處理脂多糖的存在?？梢钥吹皆谒薪?jīng)過H2O2處理的樣品中可以觀測到顯著增強的信號強度。樣品制備過程的一般實施例首先獲得自身采集的陰道拭子樣品，然后按下述方式處理。(注意如果棉塞或婦女衛(wèi)生紙被用于采集上述樣品，所用試劑量需要作相應的調(diào)整。)1.加入400μl試劑A到上述拭子中以破壞原生小體并提取脂多糖。試劑A包含100-300mMNaOH。所述拭子應在試劑A中孵育不超過5分鐘。2.加入300μl試劑B以降低pH、提供蛋白質(zhì)和聚合物阻斷劑，并形成脂多糖膠束。試劑B是0.5M三羥甲基氨基甲烷緩沖液，pH8.5包含100mMNaCl，130-400mMHCl和1％-4％蛋白質(zhì)例如牛血清白蛋白，0.03％-1.3％聚乙烯醇和0.03％-0.1％正十二烷基麥芽糖苷。該拭子應孵育不超過5分鐘。3.加入100μl試劑C以氧化抑制性物質(zhì)。試劑C是6％H2O2。所述樣品應孵育不超過2分鐘。4.在多于0.5μg/ml或每毫升1.5活性單位，例如0.5-100μg/ml或每毫升1.5-300活性單位的脫氧核糖核酸酶存在條件下，將上述樣品加樣到試驗條中。參考文獻SmithK，HarringtonK，WingoodG，OhMK，HookEW，DiClementeRJ.2001.自身采集的陰道拭子用于診斷治療中的青春期少女性傳播性疾病(Self-obtainedvaginalswabsfordiagnosisoftreatablesexuallytransmitteddiseasesinadolescentgirls).ArchPediatrAdolescMed155676-679.表1上述信號用1～5來標度，5代表最強的信號表2上述信號用1～5來標度，5代表最強的信號權利要求1.一種用于處理人類患者樣品以對所述樣品實施診斷方法來檢測感染性物質(zhì)的方法，其中所述樣品是子宮頸內(nèi)液體樣品或陰道液體樣品，所述方法包括在脫氧核糖核酸酶存在下實施所述診斷方法的步驟。2.如權利要求1所述的方法，其中所述脫氧核糖核酸酶以多于0.5μg/ml，優(yōu)選地是0.5-100μg/ml的量存在。3.如權利要求1所述的方法，其中所述脫氧核糖核酸酶以多于每毫升1.5活性單位，優(yōu)選地是每毫升1.5-300活性單位的量存在。4.如權利要求1至3中任何一項所述的方法，其另外包括在對所述樣品實施診斷方法來檢測感染性物質(zhì)之前制備人類患者樣品的方法，所述制備方法包括用氧化劑處理樣品的步驟。5.如權利要求4所述的方法，其中所述氧化劑是過氧化氫(H2O2)。6.如權利要求5所述的方法，其應用過氧化氫的工作濃度是重量體積比0.5％-3％。7.如權利要求1至3或4至6中任何一項所述的方法，其另外包括用非離子型烷基糖苷表面活性物質(zhì)處理樣品的步驟。8.如權利要求7所述的方法，其中所述表面活性物質(zhì)是正十二烷基麥芽糖苷。9.如權利要求8所述的方法，其中所述正十二烷基麥芽糖苷以重量體積比0.01％至0.04％，優(yōu)選地是0.015％至0.03％的工作濃度存在。10.如權利要求1至3或4至6或7至9中任何一項所述的方法，其另外包括單獨或同時應用聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮處理樣品的步驟。11.如權利要求10所述的方法，其中所述樣品用聚乙烯醇處理，所述聚乙烯醇優(yōu)選地具有介于20-25kDa的平均分子量和重量體積比介于0.01％-0.5％的工作濃度。12.如權利要求10所述的方法，其中所述樣品用重量體積比介于0.2％-2％的工作濃度的聚乙烯吡咯烷酮處理。13.如權利要求1至3中任何一項所述的方法，其另外包括如權利要求10至12中任何一項所述的方法步驟和如權利要求7至9中任何一項所述的方法步驟和如權利要求4至6中任何一項所述的方法步驟。14.如權利要求1至13中任何一項所述的方法，其中所述人類患者樣品是從自身采集的陰道拭子樣品獲得的。15.如權利要求1至13中任何一項所述的方法，其中所述方法是用于沙眼衣原體的檢測。16.如權利要求1至13中任何一項所述的方法，其中所述患者樣品是自身采集的陰道拭子樣品并且所述方法是用于沙眼衣原體的檢測。17.如上述權利要求中任何一項所述的方法，其中所述方法是浸漬片試驗法。18.一種試劑盒，其包括-用于完成特定的感染性物質(zhì)檢測試驗的浸漬片試驗設備；-為了完成上述特定的檢測試驗的上述設備所需的試劑；-用于完成如權利要求1至3中任一項所述方法的脫氧核糖核酸酶試劑。19.如權利要求18所述的試劑盒，其另外包括-用于完成如權利要求4至6中任一項所述方法的氧化劑試劑。20.如權利要求18所述的試劑盒，其另外包括-用于完成如權利要求7至9中任一項所述方法的非離子型烷基糖苷試劑。21.如權利要求18所述的試劑盒，其另外包括-用于完成如權利要求10至12中任一項所述方法的試劑，所述試劑是聚乙烯醇和/或聚乙烯吡咯烷酮。22.如權利要求18所述的試劑盒，其另外包括-用于完成如權利要求1至15中任一項所述方法的如權利要求4至6中任一項所定義的非離子型烷基糖苷表面活性物質(zhì)試劑和如權利要求7至9中任一項所定義的聚乙烯醇和/或聚乙烯吡咯烷酮試劑。全文摘要本文描述了改善用于檢測感染性物質(zhì)的亞最適患者樣品質(zhì)量的方法。特別是用脫氧核糖核酸酶處理子宮頸內(nèi)液體樣品或陰道液體樣品以提高感染性物質(zhì)檢測的可靠性。本文還描述了用于實施該方法的試劑盒。文檔編號G01N33/569GK1620611SQ02828192公開日2005年5月25日申請日期2002年12月24日優(yōu)先權日2001年12月24日發(fā)明者利海倫,黃玲,E·C·小納達拉,N·D·布特雷斯申請人:真實世界診斷有限公司