專(zhuān)利名稱(chēng)：用于測(cè)定樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)的檢查器具及使用其的分析對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定方法
用于測(cè)定樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)的檢查器具及使用其的分析對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測(cè)定樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)的檢查器具及使用其的分析對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定方法。更具體而言，本發(fā)明涉及主要在臨床檢查領(lǐng)域中適用，特別是，適宜于可在患者的床側(cè)或救急現(xiàn)場(chǎng)等的所有的場(chǎng)所迅速簡(jiǎn)便地檢查的所謂POCT領(lǐng)域的，用于將液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的檢查器具及使用其的分析對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
近年，通過(guò)分析技術(shù)的進(jìn)步，測(cè)定各種各樣的活體成分成為可能。特別是，在臨床檢查領(lǐng)域中，通過(guò)基于稱(chēng)之為抗原與抗體特異性地反應(yīng)的的原理的免疫測(cè)定法的開(kāi)發(fā)，與病態(tài)關(guān)聯(lián)的體液中的各種活體成分被測(cè)定。在那樣的免疫測(cè)定法的領(lǐng)域中，近年，從可縮短從采集待測(cè)樣品至得到檢查結(jié)果之時(shí)間的方面、另外，稱(chēng)之為裝置簡(jiǎn)便的方面、可簡(jiǎn)單地測(cè)定的方面，關(guān)注了床旁診斷化驗(yàn)測(cè)試(以下，也稱(chēng)之為P0CT)領(lǐng)域。這樣的免疫測(cè)定法的檢查器具幾乎是伴隨BF分離的檢查器具。作為那樣的檢查器具，已知免疫層析檢查器具(專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。作為此檢查器具，使用例如，在作為液體可通過(guò)毛細(xì)管現(xiàn)象移動(dòng)的多孔質(zhì)材的片上，將針對(duì)可在樣品溶液中存在的分析對(duì)象物質(zhì)的第一抗體固定到層析儀介質(zhì)的檢查器具。從該檢查器具的色譜的末端展開(kāi)含針對(duì)該分析對(duì)象物質(zhì)的標(biāo)記化的第二抗體、例如用膠體金標(biāo)記化的第二抗體的該樣品溶液，接下來(lái)，在固定化的第一抗體部位捕捉第一抗體、分析對(duì)象物質(zhì)和標(biāo)記第二抗體的復(fù)合物。由于未反應(yīng)的標(biāo)記抗體移動(dòng)到了下游，在固定化抗體部位，僅當(dāng)分析對(duì)象物質(zhì)存在于樣品中時(shí)，觀察到由膠體金等的著色。但是，此方法根本就是僅通過(guò)目測(cè)是否有膠體金等的著色來(lái)判斷分析對(duì)象物質(zhì)的有無(wú)，具有無(wú)法定量測(cè)定的問(wèn)題。另外，為了定量分析對(duì)象物質(zhì)，也已知由泵吸引將樣品經(jīng)由空間流路移送的檢查器具(專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。此器具具有樣品供給口、具備標(biāo)記抗體的樣品處理室、具備固定化抗體的測(cè)定室、廢液室及泵連接口，各自通過(guò)流路連通。將樣品供應(yīng)到樣品供給口，將該樣品通過(guò)吸引移送到樣品處理室，從而將標(biāo)記抗體游離，同時(shí)使樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)和標(biāo)記抗體反應(yīng)，接下來(lái)，再吸引而將樣品移送到測(cè)定室，生成固定化抗體、分析對(duì)象物質(zhì)和標(biāo)記抗體的結(jié)合物，然后使停止一定時(shí)間，吸引樣品中的分析對(duì)象物以外的成分而移送到廢液室。然后，通過(guò)測(cè)光在測(cè)定室中的分析對(duì)象物質(zhì)來(lái)源的結(jié)合物而可實(shí)施樣品中含的分析對(duì)象物質(zhì)的定量測(cè)定。但是，此器具由于由泵的樣品移送以多個(gè)階段進(jìn)行，有控制比較難，測(cè)定結(jié)果依賴(lài)于條件受大影響的問(wèn)題。為了解決該問(wèn)題，也已知在同樣的測(cè)定原理中，組合流路開(kāi)閉可能的閉塞部件和泵加壓的方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。但是，此方法有檢查器具的結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜的問(wèn)題。另一方面，盡管開(kāi)發(fā)例少，在POCT的領(lǐng)域也已知可基于不需要BF分離的乳膠免疫凝集反應(yīng)的定量測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的檢查器具(專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。此方法是將抗體致敏乳膠等干化(干燥)而組合到檢查器具，但在那樣的情況中，預(yù)先僅將液體試劑通過(guò)簡(jiǎn)單的自然干燥還不夠，必需進(jìn)行耗時(shí)間的煩瑣的冷凍干燥而制備。另外，由于抗體致敏粒子根本就是不完全溶于水而僅分散，干化的抗體致敏粒子有難再分散的難點(diǎn)。但是，在乳膠免疫凝集反應(yīng)的方法中，與伴隨BF分離的方法不同，有必要完全地再分散抗體致敏粒子。因此，在干燥化學(xué)中使用乳膠免疫凝集測(cè)定法時(shí)，為了再分散乳膠，必需加旋轉(zhuǎn)、振動(dòng)等的空間處理手段而進(jìn)行免疫分析，結(jié)果，有檢查器具易變得復(fù)雜的問(wèn)題。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)I:特開(kāi)平4-299262號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2:特開(kāi)平9-196920號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3:特開(kāi)2009-270878號(hào)公報(bào) 專(zhuān)利文獻(xiàn)4:特開(kāi)2007-114162號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的技術(shù)課題本發(fā)明的課題是通過(guò)干燥化學(xué)可正確地測(cè)定樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)，并且簡(jiǎn)便的檢查器具及使用其的可短時(shí)間測(cè)定的分析對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定方法，在于提供適宜于POCT領(lǐng)域的檢查器具及測(cè)定方法。而且，由于可基于在可見(jiàn)光區(qū)的吸光度的測(cè)定，可適用于使用常用的可見(jiàn)光光度計(jì)的裝置，并且，在于提供可正確地測(cè)定分析對(duì)象物質(zhì)的檢查器具及使用其的測(cè)定方法。解決課題的技術(shù)方案基于這樣的狀況，本發(fā)明人檢查了可測(cè)定分析對(duì)象物質(zhì)的簡(jiǎn)便的檢查器具的開(kāi)發(fā)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為用于致敏抗體的粒子而使用貴金屬膠體，將其附著干燥到流路系統(tǒng)的檢查器具的反應(yīng)室，使用血球分離膜以由全血除去血球的程度加壓，則干燥試劑容易再分散，結(jié)果，不加旋轉(zhuǎn)操作或振動(dòng)等的其他空間移動(dòng)處理手段而可正確地測(cè)定分析對(duì)象物質(zhì)。本發(fā)明基于上述見(jiàn)解經(jīng)重復(fù)再研究而完成。gp，本發(fā)明涉及[I]檢查器具，其是用于將液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的檢查器具；至少具有使液狀樣品與試劑反應(yīng)的反應(yīng)室，試劑干燥附著于構(gòu)成反應(yīng)室的面的至少一部分，并且，試劑是可將分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的試劑；再者，具備用于供給液狀樣品的供給部；及用于將供給到該供給部的液狀樣品移送至反應(yīng)室的流路；能在供給部與反應(yīng)室之間產(chǎn)生壓力差，所述供給部用于使供給到供給部的液狀樣品經(jīng)由流路移送到反應(yīng)室內(nèi)，使干燥附著的試劑與液狀樣品接觸而分散到液狀樣品中；[2]上述[I]所述的檢查器具，其中可將分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的試劑是含與分析對(duì)象物質(zhì)特異性地結(jié)合的偶體致敏貴金屬膠體的試劑、或者是含該偶體和與該分析對(duì)象物質(zhì)相同的物質(zhì)致敏貴金屬膠體的試劑；[3]上述[I]或[2]所述的檢查器具，其中反應(yīng)室由第I平面、面對(duì)所述第I平面的第2平面、及分別與第I平面及第2平面連接而在第I平面和第2平面之間形成空間的第3面形成，含與分析對(duì)象物質(zhì)特異性地結(jié)合的偶體致敏貴金屬膠體的試劑干燥附著于第I平面或面對(duì)所述第I平面的第2平面，或者，在含該偶體和與該分析對(duì)象物質(zhì)相同的物質(zhì)致敏貴金屬膠體的試劑中，該偶體干燥附著于第I平面或面對(duì)所述第I平面的第2平面之任何，與該分析對(duì)象物質(zhì)相同的物質(zhì)致敏貴金屬膠體干燥附著于另一平面；[4]上述[I] [3]之任一項(xiàng)所述的檢查器具,其中貴金屬膠體是膠體金或鈕膠體；[5]上述[I] [4]之任一項(xiàng)所述的檢查器具，其中流路及反應(yīng)室經(jīng)有通氣性，并且非通液性的多孔性膜與檢查器具外部連接；[6]上述[I] [5]之任一項(xiàng)所述的檢查器具，其中通過(guò)加壓產(chǎn)生壓力差；[7]上述[I] [6]之任一項(xiàng)所述的檢查器具，其中能將供給到供給部的液狀樣品由加壓部加壓而移送到反應(yīng)室內(nèi)；
[8]上述[I] [7]之任一項(xiàng)所述的檢查器具，其中液狀樣品是活體樣品，而分析對(duì)象物質(zhì)是活體成分；[9]上述[I] [8]之任一項(xiàng)所述的檢查器具，其中在供給部和流路之間具有用于從液狀樣品分離固體的膜；[ 10]液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定方法，將包括疑似含分析對(duì)象物質(zhì)的液狀樣品供給到上述[I ] [9]之任一項(xiàng)所述的檢查器具的供給部，接下來(lái)，在供給部和反應(yīng)室之間產(chǎn)生壓力差而經(jīng)由流路將液狀樣品移送至反應(yīng)室，使反應(yīng)室中的試劑與液狀樣品接觸而將試劑分散到液狀樣品中，使液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)與試劑反應(yīng)，向得到的混合液照射光，以及基于透射光或反射光來(lái)源的吸光度變化測(cè)定液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)；[11]上述[10]所述的測(cè)定方法，其中向混合液照射光之時(shí)、向反應(yīng)室照射；[12]上述[10]或[11]所述的測(cè)定方法，其中照射的光的波長(zhǎng)在340 800nm的范圍內(nèi)；[13]上述[12]所述的測(cè)定方法，其中照射的光的波長(zhǎng)在390 420nm的范圍內(nèi)；及[14]用于測(cè)定液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)的裝置，其下列之組合上述[I] [9]之任一項(xiàng)所述的檢查器具，和用于向反應(yīng)室照射光而讀取透射光或反射光的可見(jiàn)光光度計(jì)。發(fā)明效果在本發(fā)明中，通過(guò)干燥化學(xué)使用簡(jiǎn)便的檢查器具而可正確地測(cè)定液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)。而且，由于可基于在可見(jiàn)光區(qū)的吸光度的測(cè)定，可適用于使用常用的可見(jiàn)光光度計(jì)的裝置，并且，可短時(shí)間內(nèi)正確地測(cè)定分析對(duì)象物，本發(fā)明的檢查器具及測(cè)定方法適宜于POCT領(lǐng)域。

圖I是示本發(fā)明中使用的檢查器具之一例的縱截面圖。圖2是示本發(fā)明中使用的檢查器具之一例的上面圖。圖3是示本發(fā)明中使用的檢查器具之一例的分解斜視圖。圖4是示通過(guò)使用本發(fā)明的膠體金的干燥化學(xué)的測(cè)定方法和由以往的液狀試劑法的測(cè)定方法測(cè)定人CRP之時(shí)的相關(guān)性的圖。
圖5是示通過(guò)使用本發(fā)明的膠體金的干燥化學(xué)的測(cè)定方法和由以往的液狀試劑法的測(cè)定方法測(cè)定人半胱氨酸蛋白酶抑制物C之時(shí)的相關(guān)性的圖。圖6是示通過(guò)使用本發(fā)明的鈀膠體的干燥化學(xué)的測(cè)定方法和由以往的液狀試劑法的測(cè)定方法測(cè)定人CRP之時(shí)的相關(guān)性的圖。實(shí)施方式本發(fā)明的測(cè)定方法基于干燥化學(xué)技術(shù)。在本說(shuō)明書(shū)中，干燥化學(xué)是指，用于測(cè)定分析對(duì)象物質(zhì)的試劑在干燥狀態(tài)下在檢查器具中利用，該處添加液體狀的樣品，則以樣品中的水分作為溶劑而試劑被分散，液體狀的樣品和分散的試劑在檢查器具的反應(yīng)室中反應(yīng)。 本發(fā)明的檢查器具是如下檢查器具，其是用于將液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的檢查器具；至少具有使液狀樣品與試劑反應(yīng)的反應(yīng)室，試劑干燥附著于構(gòu)成反應(yīng)室的面的至少一部分，并且，試劑是可將分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的試劑、例如，該與分析對(duì)象物質(zhì)特異性地結(jié)合的偶體致敏貴金屬膠體、或者含該偶體和與該分析對(duì)象物質(zhì)相同的物質(zhì)致敏貴金屬膠體的試劑；再者，具備用于供給液狀樣品的供給部；及用于將供給到該供給部的液狀樣品移送至反應(yīng)室的流路；能在供給部與反應(yīng)室之間產(chǎn)生壓力差，所述供給部用于使供給到供給部的液狀樣品經(jīng)由流路移送到反應(yīng)室內(nèi)，使干燥附著的試劑與液狀樣品接觸而分散到液狀樣品中。本發(fā)明的檢查器具是如下檢查器具，其具備例如，用于供給液狀樣品的供給部；設(shè)置在檢查器具內(nèi)，使液狀樣品與試劑反應(yīng)的反應(yīng)室；及用于將供給到供給部的液狀樣品移送至反應(yīng)室的流路，流路及反應(yīng)室經(jīng)有通氣性、且非通液性的多孔性膜與檢查器具外部連接，反應(yīng)室由第I平面、面對(duì)所述第I平面的第2平面、及分別與第I平面及第2平面連接而在第I平面和第2平面之間形成空間的第3面形成，流路和反應(yīng)室通過(guò)在第3面形成連結(jié)孔而連結(jié)，試劑干燥附著在平面的至少一個(gè)面，將供給到供給部的液狀樣品由設(shè)置在供給部的加壓部加壓，移送到反應(yīng)室內(nèi)。在本發(fā)明中，液狀樣品只要含液體即可，但優(yōu)選是活體樣品，可例示例如，血液樣品、尿、髓液等。作為血液樣品，可例示血清、血漿、全血等。在本發(fā)明中，優(yōu)選在供給部和流路之間有用于從液狀樣品分離固體的膜。特別是在液狀樣品是全血等，含血細(xì)胞等的固體成分時(shí)，為了進(jìn)行固液分離，在本發(fā)明中，在供給部和流路之間有用于從液狀樣品分離固體的膜是優(yōu)選的。當(dāng)使用膜時(shí)，將液狀樣品適用于供給部之后，壓力差、優(yōu)選利用押壓而膜分離、例如，分離除去血細(xì)胞等的固體分而，使僅液狀樣品經(jīng)由流路送入反應(yīng)室。結(jié)果，通過(guò)使液狀樣品沖擊干燥附著的試劑而溶解，將貴金屬膠體分散到液狀樣品中，可通過(guò)貴金屬膠體凝集法測(cè)定液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)。一般而言，由于全血含大量的復(fù)雜的活體成分或血細(xì)胞等的固體，正確地測(cè)定其中的僅分析對(duì)象物質(zhì)通常是困難的。但是，在本發(fā)明中，當(dāng)使用由壓力差的膜分離時(shí)，可簡(jiǎn)單地從指尖等采集的全血不稀釋而可測(cè)定全血中的分析對(duì)象物質(zhì)。如此，在本發(fā)明的檢查器具中，有可不將液狀樣品用試劑等稀釋而適用的長(zhǎng)處。即，當(dāng)液狀樣品是血液樣品等的活體樣品時(shí)，即便該樣品的粘性變高而難以分散膠體，在本發(fā)明中，通過(guò)使用貴金屬膠體等而不稀釋樣品而可測(cè)定分析對(duì)象物質(zhì)。在本說(shuō)明書(shū)中，貴金屬膠體凝集測(cè)定法是指代替乳膠凝集測(cè)定法的乳膠而使用貴金屬膠體的方法，例如，將特定成分被致敏的貴金屬膠體試劑，和樣品混合而引起凝集反應(yīng)，從該凝集的程度測(cè)定該分析對(duì)象物質(zhì)的方法。在本發(fā)明中，試劑只要是可將分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的試齊U，就不特別限定。作為那樣的試劑，可例示含與分析對(duì)象物質(zhì)特異性地結(jié)合的偶體致敏貴金屬膠體的試劑、含該偶體和與該分析對(duì)象物質(zhì)相同的物質(zhì)致敏貴金屬膠體的試劑。作為與分析對(duì) 象物質(zhì)特異性地結(jié)合的偶體，在分析對(duì)象物質(zhì)是抗原的情況中，可例示針對(duì)該抗原的抗體，在分析對(duì)象物質(zhì)是抗體的情況中，可例示針對(duì)抗體的抗原。作為分析對(duì)象物質(zhì)和與其特異性地結(jié)合的偶體的其他組合，可舉出例如，生物素和親和素或鏈霉親和素、凝集素和凝集素結(jié)合性糖類(lèi)、激素和激素受體、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體、蛋白A和IgG、DNA或RNA和與它們互補(bǔ)的DNA或RNA等的組合。以下，以分析對(duì)象物質(zhì)是CRP或半胱氨酸蛋白酶抑制物C等的抗原、其偶體是抗CRP抗體或抗半胱氨酸蛋白酶抑制物C抗體等的抗體的情況為例對(duì)試劑進(jìn)行說(shuō)明。再有，在分析對(duì)象物質(zhì)是抗體的情況中，則在說(shuō)明中，將抗原和抗體倒過(guò)來(lái)即可。作為試劑使用與分析對(duì)象物質(zhì)(抗原)特異性地結(jié)合的偶體(抗體)致敏貴金屬膠體時(shí)，反應(yīng)中生成的免疫凝集復(fù)合物(抗原抗體復(fù)合物)隨著分析對(duì)象物質(zhì)(抗原)的量而變大?？蓮脑撟兇蟮某潭葴y(cè)定分析對(duì)象物質(zhì)(抗原)的濃度。另一方面，作為試劑使用含該偶體(抗體)和與該分析對(duì)象物質(zhì)(抗原)相同的物質(zhì)(抗原)致敏貴金屬膠體二者的試劑時(shí)，反應(yīng)中生成的免疫凝集復(fù)合物(抗原抗體復(fù)合物)隨著分析對(duì)象物質(zhì)(抗原)的量而變小。這也一般被稱(chēng)為免疫凝集阻止法，是使對(duì)于作為試劑的貴金屬膠體致敏的抗原，和試劑的抗體凝集反應(yīng)的方法。在此方法中，如果樣品的抗原進(jìn)入測(cè)定系統(tǒng)內(nèi)，則試劑的抗原致敏貴金屬膠體和試劑的抗體的凝集反應(yīng)被抑制，結(jié)果凝集變小，其量減少。作為分析對(duì)象物質(zhì)和與其特異性地結(jié)合的偶體，在使用例如，生物素和親和素或鏈霉親和素、凝集素和凝集素結(jié)合性糖類(lèi)、激素和激素受體、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體、蛋白A和IgG、DNA或RNA和與它們互補(bǔ)的DNA或RNA等的組合時(shí)，與上述的抗原或抗體和抗體或抗原的組合同樣，可通過(guò)貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定。在本發(fā)明中使用的試劑中，加賦形劑、穩(wěn)定化劑、緩沖劑、表面活性劑也可。作為上述賦形劑，可例示例如，白蛋白等的蛋白質(zhì)、甘氨酸等的氨基酸、甘露糖醇等的醇類(lèi)、葡萄糖等的烴化合物。作為穩(wěn)定化劑，易將水保持在分子中的物質(zhì)、山梨糖醇等的糖類(lèi)一般是優(yōu)選的。作為試劑的抗體致敏貴金屬膠體或抗原致敏貴金屬膠體等的物質(zhì)致敏貴金屬膠體試劑，例如，可如以下一樣制備。向貴金屬膠體溶液加抗體等的致敏對(duì)象物質(zhì)而在緩沖液中制備而于室溫靜置之后，加BSA包被溶液。接下來(lái)，進(jìn)行離心分離，廢棄上清而回收沉淀物。向此沉淀物加BSA包被溶液而懸浮沉淀物，進(jìn)行超聲波處理而完全地分散。接下來(lái)向進(jìn)行離心分離而得到的沉淀物加懸浮液而懸浮，得到物質(zhì)致敏貴金屬膠體。接下來(lái)，向得到的物質(zhì)致敏貴金屬膠體加山梨糖醇、表面活性劑等，通過(guò)根據(jù)情況加其他必要的成分而可制備可將分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的試劑。為了制備本發(fā)明的檢查器具，可將分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的試劑干燥附著于構(gòu)成反應(yīng)室的面的至少一部分。此時(shí)，例如，將液狀的該試劑涂布于構(gòu)成反應(yīng)室的面的至少一部分，接下來(lái)使干燥即可。作為該液狀試劑的干燥，可舉出例如，自然干燥或冷凍干燥，但在本發(fā)明中，與乳膠試劑不同，從試劑穩(wěn)定性來(lái)看自然干燥法是優(yōu)選的。將用于測(cè)定分析對(duì)象物質(zhì)的試劑作為一個(gè)整體試劑，干燥附著于構(gòu)成檢查器具的反應(yīng)室的面也可，但考慮到試劑的穩(wěn)定性等，分成二試劑而各自附著于第I平面及第2平面也可。作為試劑而使用含針對(duì)分析對(duì)象物質(zhì)的偶體和與分析對(duì)象物質(zhì)相同的物質(zhì)致敏貴金屬膠體的試劑時(shí)，將各自分別干燥附著于第I平面和第2平面是優(yōu)選的。凝集測(cè)定法，通常，作為粒子使用乳膠，但在本發(fā)明中，使用貴金屬膠體。作為貴金屬膠體中使用的貴金屬，可例示金、銀、鉬、鈀等，但金、銀或鈀是優(yōu)選的，金或鈀更優(yōu)選，金再優(yōu)選。這是因?yàn)椋谑褂媚z體金或鈀膠體、特別是膠體金時(shí)，可使用本發(fā)明的檢查器具非常正確地測(cè)定分析對(duì)象物質(zhì)。膠體金的吸收波長(zhǎng)的極大波長(zhǎng)是500nm以上，但在本發(fā)明 中，作為貴金屬膠體使用膠體金時(shí)，在免疫凝集反應(yīng)等的凝集反應(yīng)后，向得到的混合液照射光，基于透射光或反射光來(lái)源的吸光度變化測(cè)定液狀樣品中的物質(zhì)之時(shí)，在波長(zhǎng)是390 420nm，也可測(cè)定。另外，鈀膠體的吸收波長(zhǎng)的極大波長(zhǎng)是250nm以下，但在本發(fā)明中，作為貴金屬膠體而使用鈀膠體時(shí)，在免疫凝集反應(yīng)等的凝集反應(yīng)后，向得到的混合液照射光，基于透射光或反射光來(lái)源的吸光度變化測(cè)定液狀樣品中的物質(zhì)之時(shí)，在波長(zhǎng)是390 420nm也可測(cè)定。此時(shí)，用于照射光的光源(LED)容易得到是優(yōu)選的。在本發(fā)明中，貴金屬膠體的粒徑通常是I 200nm、優(yōu)選是20 150nm。作為貴金屬膠體，由壓力差與液狀樣品接觸或沖擊之時(shí)，容易分散的貴金屬膠體是優(yōu)選的，貴金屬微粒子被保護(hù)成分保護(hù)也可。作為那樣的貴金屬膠體，只要由本發(fā)明的壓力差與液狀樣品接觸之時(shí)分散可能就不特別限定，但可例示季銨鹽型貴金屬絡(luò)合物化合物(特開(kāi)2001-192712號(hào)公報(bào))、被高分子染料分散劑保護(hù)的貴金屬膠體(特開(kāi)平11-76800號(hào)公報(bào)、特開(kāi)平11-80647號(hào)公報(bào))、作為分散劑使用檸檬酸鈉的貴金屬膠體(特開(kāi)平10-66861號(hào)公報(bào))、被肽的氧化物或葡萄糖胺化合物的氧化物保護(hù)的貴金屬膠體(國(guó)際公開(kāi)W02005/023468號(hào)單行本)、被如氨基酸一樣的具有氨基和羧基的化合物保護(hù)的貴金屬膠體(特開(kāi)2002-245854號(hào)公報(bào))。在本發(fā)明中，為了實(shí)現(xiàn)壓力差，流路及反應(yīng)室經(jīng)有通氣性、且非通液性的多孔性膜與檢查器具外部連接是優(yōu)選的。在本發(fā)明中，作為用于產(chǎn)生壓力差的手段，只要是可在反應(yīng)室和供給部之間產(chǎn)生壓力差，結(jié)果，液狀樣品從供給部經(jīng)由流路送入反應(yīng)室而將干燥試劑分散的程度的手段即可。具體而言，可例示加壓手段、引壓手段，但為了使檢查器具成為簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，使用加壓手段是優(yōu)選的。即，將供給到供給部的樣品由設(shè)置在供給部的加壓部加壓，使得可移送到反應(yīng)室內(nèi)是優(yōu)選的。在本發(fā)明中，在使用引壓手段之時(shí)，可經(jīng)過(guò)例如，向反應(yīng)室通氣體，不通液體的膜或物質(zhì)，通過(guò)用泵吸引來(lái)產(chǎn)生壓力差。在本發(fā)明中，向混合液照射光之時(shí)，向反應(yīng)室照射是優(yōu)選的。因此，反應(yīng)室之上下的面是透明是優(yōu)選的。即，反應(yīng)室兼用測(cè)定室是優(yōu)選的。
此時(shí)，向混合液照射光之時(shí)，為了向反應(yīng)室照射，使用可見(jiàn)光光度計(jì)是優(yōu)選的。因此，反應(yīng)室之上下的面的至少一部分是透明是優(yōu)選的。此時(shí)，可使用從上照射光而讀取透射光或反射光來(lái)源的吸光度變化的可見(jiàn)光光度計(jì)，測(cè)定反應(yīng)后的吸光度變化，基于其變化的增減定量分析對(duì)象物質(zhì)。本發(fā)明的測(cè)定方法使用組合了本發(fā)明的檢查器具和用于向反應(yīng)室照射光而讀取透射光或反射光的可見(jiàn)光光度計(jì)的2者的裝置也可。在此裝置中，例如，具備構(gòu)成對(duì)供給部加壓的加壓手段的泵也可。本發(fā)明的測(cè)定方法是如下液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定方法，其使用以上詳細(xì)地說(shuō)明的本發(fā)明的檢查器具，將液狀樣品供給到本發(fā)明的檢查器具的供給部，接下來(lái)，在供給部和反應(yīng)室之間產(chǎn)生壓力差而經(jīng)由流路移送到反應(yīng)室，使反應(yīng)室中的試劑與液狀樣品接觸而將試劑分散到液狀試劑中，使液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)與試劑反應(yīng)，向得到的混合液照射光，以及基于透射光或反射光來(lái)源的吸光度變化測(cè)定液狀樣品中 的分析對(duì)象物質(zhì)。在本發(fā)明中，致敏貴金屬膠體的狀態(tài)隨著抗原抗體反應(yīng)等而狀態(tài)發(fā)生變化，結(jié)果，在反應(yīng)前后照射光時(shí)，透射光或反射光來(lái)源的吸光度發(fā)生變化。反應(yīng)前的數(shù)據(jù)，作為樣品而可使用不含分析對(duì)象物質(zhì)的樣品來(lái)測(cè)定，可從反應(yīng)前后的吸光度的差求出分析對(duì)象物質(zhì)的濃度。在本發(fā)明的測(cè)定方法中，照射的光的波長(zhǎng)是340 800nm是優(yōu)選的，390 420nm是再優(yōu)選的。這是由于在390 420nm，可作為在干燥化學(xué)中使用的光源有常用性。以下，為了作為分析對(duì)象物質(zhì)測(cè)定抗原，以使用抗體致敏貴金屬膠體時(shí)為例進(jìn)行說(shuō)明(在抗體測(cè)定的情況中，將抗原和抗體倒過(guò)來(lái)即可)。在貴金屬膠體是膠體金的情況中，通常，試劑的抗體致敏膠體金溶液的極大吸收波長(zhǎng)是500nm以上?？贵w致敏膠體金溶液在極大吸收波長(zhǎng)附近與其抗原(分析對(duì)象物質(zhì))反應(yīng)，則吸光度發(fā)生大的變化。另一方面，在390 420nm，抗體致敏膠體金溶液與抗原反應(yīng)，則也發(fā)生吸光度的變化。另外，在貴金屬膠體是鈀膠體的情況中，抗體致敏鈀膠體溶液的極大吸收波長(zhǎng)是通常250nm以下，在與其抗原反應(yīng)之時(shí),在此極大吸收波長(zhǎng)附近發(fā)生吸光度的大的變化,但在390 420nm，抗體致敏鈀膠體溶液和抗原反應(yīng)，則也發(fā)生吸光度的變化。在本發(fā)明中，可從由抗原抗體反應(yīng)等的液狀樣品和試劑的反應(yīng)的吸光度的變化的程度定量抗原的濃度。作為分析對(duì)象物質(zhì)和與其特異性地結(jié)合的偶體，在使用其他組合時(shí)，也與上述同樣，可用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定。在反應(yīng)室中，由液狀樣品溶解該試劑而使反應(yīng)之時(shí)，可通過(guò)例如，在20 40°C、優(yōu)選在37 °C附近反應(yīng)而實(shí)施。在本發(fā)明的測(cè)定方法中，可不對(duì)檢查器具加旋轉(zhuǎn)操作或振動(dòng)操作，S卩，不特別進(jìn)行空間移動(dòng)而實(shí)施。即，在本發(fā)明中，除了在檢查器具的供給部和反應(yīng)室之間產(chǎn)生壓力差以夕卜，可不特別加自外部的物理移動(dòng)或操作而不移動(dòng)檢查器具自體而分散干燥試劑，從而實(shí)施免疫反應(yīng)等的反應(yīng)。另外，在本發(fā)明的測(cè)定方法中，無(wú)必要進(jìn)行BF分離。結(jié)果，可使用極其簡(jiǎn)單的檢查器具正確地測(cè)定樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)。接下來(lái)，基于附圖，對(duì)本發(fā)明的測(cè)定方法及其中使用的檢查器具再進(jìn)行具體說(shuō)明。作為本發(fā)明中涉及的檢查器具的優(yōu)選的一實(shí)施方式，將檢查器具基于附圖進(jìn)行說(shuō)明。圖I示檢查器具的縱截面圖、圖2示檢查器具之上面圖、圖3示檢查器具的分解斜視圖。檢查器具是，如圖I 3所示，第I板I、印刷面I (圖中符號(hào)2)、由多孔性膜形成的中間板6、印刷面2 (圖中符號(hào)3)及第2板4以上下方向積層而具有一體化的結(jié)構(gòu)。在上層側(cè)的第I板I上形成圓形的樣品供給部7。再有，印刷面是被涂黑的層，但設(shè)定成在用于涂干試劑的部分，為了不是印刷面而形成凹陷，可在該凹陷涂布干試劑。印刷面I (印刷面2)在第I板I (第2板4)或中間板6之一面由包被或絲網(wǎng)印刷等形成也可，作為與這些板獨(dú)立的膜形成之后，積層在這些板間也可。在樣品供給部7之上部周?chē)钥蛇B離的方式設(shè)置有底圓筒形狀的栓體8。在第I板I及第2板4，使用容易加工的樹(shù)脂材料，例如，使用苯乙烯一丙烯腈樹(shù)脂(ABS樹(shù)脂)等。在中間板6使用非通液性而通氣性的多孔質(zhì)材、例如，四氟化乙烯樹(shù)脂(PTFE樹(shù)脂)等。在第I板I和第2板4之間設(shè)置中間板6，經(jīng)印刷面I (2)及印刷面2 (3)附著。在中間板6設(shè)置液狀試劑的流路10，通過(guò)流路10設(shè)置反應(yīng)室11。在樣品供給部7和流路10之間設(shè)置有通氣性、且通液性的多孔性的膜9。 試劑以指定量涂布在反應(yīng)室11的第I平面及第2平面之任何，或者兩者而干燥附著，形成干試劑I (圖中符號(hào)5)及/或干試劑2 (圖中符號(hào)12)。在實(shí)際進(jìn)行測(cè)定時(shí)，從樣品供給部7供給液狀樣品。然后，用栓體8蓋住樣品供給部7，例如，用指對(duì)栓體8加壓。由此，反應(yīng)室11或流路10內(nèi)的空氣從中間板6排出到外部，液狀樣品被送入反應(yīng)室11內(nèi)。試劑干燥附著到反應(yīng)室11的第I平面及第2平面之任何，或者兩者，液狀樣品被搬送到反應(yīng)室11的空間內(nèi)，則試劑分散到液狀樣品中，開(kāi)始液狀樣品和試劑的反應(yīng)。由于在一個(gè)空間內(nèi)樣品和試劑互相混合，從而被均一地混合。在反應(yīng)室11的液狀樣品和試劑的反應(yīng)后的混合液的測(cè)定可使用透射光或反射光來(lái)測(cè)定。使用透射光或反射光的光學(xué)測(cè)定是，使第I板I及第2板4的全體由有光透過(guò)性的樹(shù)脂形成，在反應(yīng)室11使試劑和液狀樣品的反應(yīng)后，向混合液，例如，從第2板4之下方向第I板1，照射例如，波長(zhǎng)405nm的透射光，通過(guò)在反應(yīng)室11的透射光的吸收測(cè)定即可。實(shí)施例以下，使用實(shí)施例及比較例再詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些例。實(shí)施例I使用根據(jù)本發(fā)明的膠體金的人CRP的測(cè)定方法I.方法[(I)抗人CRP抗體致敏膠體金的制備如以下一樣進(jìn)行向膠體金的抗人CRP抗體的致敏。向平均粒徑50nm的膠體金溶液(Nacalai公司銷(xiāo)售、保護(hù)膠體金溶液)IOmL加將抗人CRP抗體在Tris緩沖液中調(diào)節(jié)到O. 2mg/mL的溶液10mL，于室溫靜置15分鐘之后，力口IOmL BSA包被溶液。其后，以15，OOOrpm進(jìn)行10分鐘離心分離，廢棄上清而回收沉淀物。向此沉淀物加20mL的BSA包被溶液而懸浮沉淀物，進(jìn)行30秒鐘超聲波處理而使完全地分散。接下來(lái)進(jìn)行離心分離，向得到的沉淀物加ImL懸浮液而懸浮，得到抗人CRP抗體致敏膠體金。(2)干試劑的制備向上述(I)中得到的抗人CRP抗體致敏膠體金添加山梨糖醇至終濃度2%、添加表面活性劑至終濃度0.1%。(3)檢查器具的制備及其操作將如上所述制備的試劑向2個(gè)PET片上各涂布至O. 375 μ L、O. 5 μ L，通過(guò)自然放置干燥。干燥后，涂布的片與含待測(cè)樣品流路的片夾合，制備如圖I 3所示構(gòu)成的檢查器具。將樣品導(dǎo)入供給部至成為反應(yīng)池體積2. 5容積中的I容積，通過(guò)押壓經(jīng)由流路導(dǎo)入反應(yīng)室，溶解試劑。測(cè)定是在樣品導(dǎo)入后，于37°C反應(yīng)10分鐘，對(duì)涂布試劑的部分以波長(zhǎng)405nm測(cè)光，求出反應(yīng)后的吸光度。使用的試劑、及樣品具體而言如下。膠體金制備用試劑BSA包被溶液
權(quán)利要求
1.檢查器具，其為用于將液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的檢查器具； 至少具有使液狀樣品與試劑反應(yīng)的反應(yīng)室， 試劑干燥附著于構(gòu)成反應(yīng)室的面的至少一部分，并且， 試劑是可將分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的試劑； 再者，具備 用于供給液狀樣品的供給部；及 用于將供給到該供給部的液狀樣品移送至反應(yīng)室的流路； 能在供給部與反應(yīng)室之間產(chǎn)生壓力差，所述供給部用于 使供給到供給部的液狀樣品經(jīng)由流路移送到反應(yīng)室內(nèi)， 使干燥附著的試劑與液狀樣品接觸而分散到液狀樣品中。
2.權(quán)利要求I所述的檢查器具，其中可將分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的試劑 是含與分析對(duì)象物質(zhì)特異性地結(jié)合的偶體致敏貴金屬膠體的試劑、或者 是含該偶體和與該分析對(duì)象物質(zhì)相同的物質(zhì)致敏貴金屬膠體的試劑。
3.權(quán)利要求I或2所述的檢查器具，其中 反應(yīng)室由 ■第I平面、 ■面對(duì)所述第I平面的第2平面、及 ■分別與第I平面及第2平面連接而在第I平面和第2平面之間形成空間的第3面 形成， 籲含與分析對(duì)象物質(zhì)特異性地結(jié)合的偶體致敏貴金屬膠體的試劑干燥附著于第I平面或面對(duì)所述第I平面的第2平面，或者， 在含該偶體和與該分析對(duì)象物質(zhì)相同的物質(zhì)致敏貴金屬膠體的試劑中， ■該偶體干燥附著于第I平面或面對(duì)所述第I平面的第2平面之任何， ■與該分析對(duì)象物質(zhì)相同的物質(zhì)致敏貴金屬膠體干燥附著于另一平面。
4.權(quán)利要求I 3之任一項(xiàng)所述的檢查器具，其中貴金屬膠體是膠體金或鈀膠體。
5.權(quán)利要求I 4之任一項(xiàng)所述的檢查器具，其中流路及反應(yīng)室經(jīng)有通氣性、且非通液性的多孔性膜與檢查器具外部連接。
6.權(quán)利要求I 5之任一項(xiàng)所述的檢查器具，其中通過(guò)加壓產(chǎn)生壓力差。
7.權(quán)利要求I 6之任一項(xiàng)所述的檢查器具，其能將供給到供給部的液狀樣品由加壓部加壓而移送到反應(yīng)室內(nèi)。
8.權(quán)利要求I 7之任一項(xiàng)所述的檢查器具，其中 液狀樣品是活體樣品，而 分析對(duì)象物質(zhì)是活體成分。
9.權(quán)利要求I 8之任一項(xiàng)所述的檢查器具，其中在供給部和流路之間有用于從液狀樣品分離固體的膜。
10.液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定方法，其包括 將疑似含分析對(duì)象物質(zhì)的液狀樣品供給到權(quán)利要求I 9之任一項(xiàng)所述的檢查器具的供給部，接下來(lái)， 在供給部和反應(yīng)室之間產(chǎn)生壓力差而經(jīng)由流路將液狀樣品移送至反應(yīng)室， 使反應(yīng)室中的試劑與液狀樣品接觸而將試劑分散到液狀樣品中， 使液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)與試劑反應(yīng)， 向得到的混合液照射光，以及 基于透射光或反射光來(lái)源的吸光度變化測(cè)定液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)。
11.權(quán)利要求10所述的測(cè)定方法，其中向混合液照射光之時(shí)，向反應(yīng)室照射。
12.權(quán)利要求10或11所述的測(cè)定方法，其中照射的光的波長(zhǎng)在340 800nm的范圍內(nèi)。
13.權(quán)利要求12所述的測(cè)定方法，其中照射的光的波長(zhǎng)在390 420nm的范圍內(nèi)。
14.用于測(cè)定液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)的裝置，其為下列之組合 權(quán)利要求I 9之任一項(xiàng)所述的檢查器具，和 用于向反應(yīng)室照射光而讀取透射光或反射光的可見(jiàn)光光度計(jì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于將液狀樣品中的分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的檢查器具；其至少具有使液狀樣品與試劑反應(yīng)的反應(yīng)室，試劑干燥附著于構(gòu)成反應(yīng)室的面的至少一部分，并且，試劑是可將分析對(duì)象物質(zhì)用貴金屬膠體凝集測(cè)定法測(cè)定的試劑；再者，具備用于供給液狀樣品的供給部；及用于將供給到該供給部的液狀樣品移送至反應(yīng)室的流路；能在供給部與反應(yīng)室之間產(chǎn)生壓力差，所述供給部用于使供給到供給部的液狀樣品經(jīng)由流路移送到反應(yīng)室內(nèi)，使干燥附著的試劑與液狀樣品接觸而分散到液狀樣品中。通過(guò)使用這樣的檢查器具，能進(jìn)行基于在可視部的吸光度的測(cè)定，可短時(shí)間內(nèi)正確地測(cè)定分析對(duì)象物，適宜于POCT領(lǐng)域的測(cè)定成為可能。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102906567SQ201180024890
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
發(fā)明者小島良, 野田健太, 佐藤善郎, 佐藤七月, 蘆澤一穗 申請(qǐng)人:日東紡績(jī)株式會(huì)社