本發(fā)明涉及生物
技術領域：
：，特別是涉及改造的轉鐵蛋白dna結合域、重組dna聚合酶及制備方法。
背景技術：
：：脫氧核糖核酸(dna)是生命遺傳信息保存和傳遞的載體，細胞內參與脫氧核糖核酸合成的dna聚合酶(dnapolymerase)是實現dna分子自體復制和遺傳信息傳遞功能的關鍵分子。生物技術的發(fā)展提供了dna分子的體外復制方法，并由此發(fā)展起來的核酸分子檢測技術已日益成為各種生物檢測的關鍵技術，廣泛應用于藥物開發(fā)、食品安全性檢測、病原微生物鑒定、疾病機理和藥物靶向治療等理論研究與檢驗之中。體外酶法合成dna分子的關鍵是得到滿足不同需要的耐熱dna聚合酶(thermostablednapolymerase)。例如：進行pcr擴增的耐熱dna聚合酶、抗酶抑制劑(inhibitors)的耐熱dna聚合酶、能在超低模板濃度下擴增dna的耐熱dna聚合酶等。臨床體外診斷中經常需要對體液中的核酸進行擴增檢測，而在體液中存在多種pcr反應抑制劑，如：氯化血紅素、鈣離子、血紅蛋白、轉鐵蛋白、免疫球蛋白等。這些pcr抑制劑的存在限制了直接采用體液進行pcr擴增，通常需進行核酸純化去除pcr反應抑制劑后，采用純化后的核酸進行pcr擴增。國外的研究發(fā)現，利用古細菌(archaebacteria)核酸結合蛋白的dna結合結構域(dnabindingmotif)與耐熱dna聚合酶(thermostablednapolymerase)重組(chimericrecombination)，可構建出對模板dna親和力(infinitytodnatemplate)提高、且保留原dna聚合酶各種功能的新型耐熱dna聚合酶。這種重組耐熱dna聚合酶具有以下特點：(1)與模板dna分子的親和力大大提高，能在模板dna分子濃度很低的情況下與之結合，開啟dna合成；(2)與模板dna分子親和力提高的重組耐熱dna聚合酶，能在更加復雜的反應環(huán)境中，例如：含有污染物或干擾分子的dna初級制品或原始材料溶液中，啟動dna合成；(3)與特異病原物基因組dna的某些區(qū)段具有顯著提高的親和力，能在更低的模板dna濃度或更加復雜的干擾分子存在時，開啟dna合成。這些特點，可改善核酸分子檢測的過程(使之更簡化和可規(guī)?；僮?和提高檢測靈敏度及穩(wěn)定性。而目前具有上述優(yōu)點的重組dna聚合酶數量較少，因此，急需加強這方面研發(fā)工作。技術實現要素：本發(fā)明要解決的技術問題在于獲得不易受生物大分子(多糖、蛋白質)、有機和無機污染分子(為釋放dna和變性生物大分子加入化合物)等抑制的新型重組dna聚合酶，實現直接pcr；獲得與模板分子親和力提高的新型重組dna聚合酶，實現對更低濃度模板的擴增，提高檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：一種改造的轉鐵蛋白dna結合域，所述轉鐵蛋白為乳轉鐵蛋白ltf、血清鐵傳遞蛋白tf、黑素轉鐵蛋白mtf或卵轉鐵蛋白otf，所述各轉鐵蛋白的n端具有一段同源的dna結合域，其中，dna結合域的第10位、第20位分別為c；所述改造的轉鐵蛋白dna結合域的氨基酸序列為：將所述dna結合域中第10位與第20位的c換為其他氨基酸，使其不能形成二硫鍵。進一步地，所述第10位的c換為r，第20位的c換為a或者g。進一步地，將所述dna結合域第1-5位的氨基酸換為kfkyk和/或第28-31位換為kkvk。進一步地，所述乳轉鐵蛋白ltf的dna結合域采用人源，如seqidno.1所示，或采用鼠源，如seqidno.2所示；所述血清鐵傳遞蛋白tf的dna結合域采用人源，如seqidno.3所示，或采用鼠源，如seqidno.4所示；所述黑素轉鐵蛋白mtf的dna結合域采用人源，如seqidno.5所示，或采用鼠源，如seqidno.6所示；所述卵轉鐵蛋白otf的dna結合域采用雞源，如seqidno.7所示。本發(fā)明還提供了一種重組dna聚合酶的制備方法，采用上述改造的轉鐵蛋白dna結合域與dna聚合酶進行偶聯(lián)，構建重組dna聚合酶；或采用上述改造的轉鐵蛋白dna結合域中相同的dna結合域或不同的dna結合域串聯(lián)在一起后再與dna聚合酶偶聯(lián)，構建重組dna聚合酶；或將上述構建的重組dna酶與其他重組dna聚合酶或未改造的dna聚合酶混合后獲得復合的重組dna聚合酶。進一步地，所述dna聚合酶為耐熱dna聚合酶或逆轉錄酶。進一步地，所述耐熱dna聚合酶為taqdna聚合酶。本發(fā)明還提供一種采用上述制備方法制備的新型的重組dna聚合酶。本發(fā)明還提供了一種包含上述重組dna聚合酶的pcr檢測試劑盒。通過采用上述技術方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點：本發(fā)明獲得了一種新型的dna結合域—轉鐵蛋白dna結合域，可用于與dna聚合酶偶聯(lián)構建重組dna聚合酶，構建成的重組dna聚合酶，不受生物大分子(多糖、蛋白質)、有機和無機污染分子(為釋放dna和變性生物大分子加入化合物)等抑制，可以實現直接pcr；進而可以簡化檢測程序，提高效率，便于操作；同時可以降低費用、減少成本、縮短檢測時間，增加效益。另外，構建成的重組dna聚合酶，與模板分子親和力提高，可實現對更低濃度模板的擴增，提高檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。附圖說明上述僅是本發(fā)明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術手段，以下結合附圖與具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明。圖1是實施例3中的重組耐熱dna聚合酶與taqdna聚合酶擴增效率比較結果圖；圖2是實施例3中的重組耐熱dna聚合酶與taqdna聚合酶擴增速度比較結果圖；圖3是實施例3中的重組耐熱dna聚合酶與taqdna聚合酶血清耐受性比較結果圖。具體實施方式為了獲得不易受抑制、對模板濃度要求低的新型的dna聚合酶，本發(fā)明選擇了通過重組的方式構建重組dna聚合酶，通過大量研究發(fā)現，轉鐵蛋白的dna結合域經過部分氨基酸替換改造后可用于構建具有上述效果的重組dna聚合酶。轉鐵蛋白共有4種同源蛋白：乳轉鐵蛋白(lactotransferrin，ltf)、血清鐵傳遞蛋白(serotransferrin，tf)、黑素轉鐵蛋白(melanotransferrin，mtf)、卵轉鐵蛋白(ovotransferrin，otf)。這4種蛋白的n端具有一段同源的dna結合域。其中，dna結合域的第10位、第20位分別為c。實施例1本實施例檢測了3種人源、3種鼠源、1種雞源的轉鐵蛋白的dna結合域，氨基酸序列分別如下：人ltf(hltf)：grrrrsvqwcavsqpeatkcfqwqrnmrkvr(seqidno.1)人tf(htf)：avpdktvrwcavseheatkcqsfrdhmksvi(seqidno.3)人mtf(hmtf)：vlggmevrwcatsdpeqhkcgnmseafreag(seqidno.5)鼠ltf(mltf):lakattvqwcavsnseeekclrwqnemrkvg(seqidno.2)鼠tf(mtf)：avpdktvkwcavsehentkcisfrdhmktvl(seqidno.4)鼠mtf(mmtf)：vvcvmevqwctisdaeqqkckdmseafqgag(seqidno.6)雞otf(gotf)：appksvirwctisspeekkcnnlrdltqqer(seqidno.7)上述dna結合域的改造方法為：由于轉鐵蛋白的dna結合域中有2個c氨基酸可形成二硫鍵，二硫鍵在高溫下不穩(wěn)定，可將第10位與第20位的c換為其他氨基酸，使其不能形成二硫鍵。例如，優(yōu)選地，可將片段中第10位的c換成r,第20位的c換為a，或者g這2種較小的氨基酸。這段改造后的dna結合域可直接與耐熱dna聚合酶偶聯(lián)形成重組耐熱dna聚合酶。改造后的轉鐵蛋白dna結合域氨基酸序列如下：人ltf’(hltf’)：grrrrsvqwravsqpeatkafqwqrnmrkvr(seqidno.8)人tf’(htf’)：avpdktvrwravseheatkaqsfrdhmksvi(seqidno.9)人mtf’(hmtf’)：vlggmevrwratsdpeqhkagnmseafreag(seqidno.10)鼠ltf’(mltf’):lakattvqwravsnseeekalrwqnemrkvg(seqidno.11)鼠tf’(mtf’)：avpdktvkwravsehentkaisfrdhmktvl(seqidno.12)鼠mtf’(mmtf’)：vvcvmevqwrtisdaeqqkakdmseafqgag(seqidno.13)雞otf’(gotf’)：appksvirwrtisspeekkannlrdltqqer(seqidno.14)實施例2可將實施例1中的獲得的轉鐵蛋白dna結合域進行進一步改造，將轉鐵蛋白dna結合域第1-5位的氨基酸換為kfkyk，第28-31位換為kkvk，其中1-5位的氨基酸改造相對重要。dna聚合酶的性能可得到進一步提升。第二步改造后的轉鐵蛋白dna結合域氨基酸序列如下：人ltf”(hltf”)：kfkyksvqwravsqpeatkafqwqrnmkkvk(seqidno.15)人tf”(htf”)：kfkyktvrwravseheatkaqsfrdhmkkvk(seqidno.16)人mtf”(hmtf”)：kfkykevrwratsdpeqhkagnmseafkkvk(seqidno.17)鼠ltf”(mltf”):kfkyktvqwravsnseeekalrwqnemkkvk(seqidno.18)鼠tf”(mtf”)：kfkyktvkwravsehentkaisfrdhmkkvk(seqidno.19)鼠mtf”(mmtf”)：kfkykevqwrtisdaeqqkakdmseafkkvk(seqidno.20)雞otf”(gotf”)：kfkykvirwrtisspeekkannlrdltkkvk(seqidno.21)實施例3將實施例1、2中改造后的轉鐵蛋白dna結合域與taqdna聚合酶進行偶聯(lián)，形成重組耐熱dna聚合酶。(一)擴增效率對比實驗：純化的taq，hltf’-taq，hltf”-taq，htf’-taq，htf”-taq，mmtf’-taq，mmtf”-taq，gotf’-taq，gotf”-taq連續(xù)對半稀釋,取各稀釋度1μl于20μl反應體積中擴增1.5kbdna片段(25cycles)。如圖1所示，瓊脂糖凝膠電泳(loading5μl/lane)1-6道分別為相等酶蛋白濃度的taq或重組耐熱dna聚合酶連續(xù)對半稀釋(1,1/2,1/4,1/8,1/16,1/32)的擴增結果。(二)擴增速度對比實驗：如圖2所示，taq，hltf’-taq，hltf”-taq，htf’-taq，htf”-taq，mmtf’-taq，mmtf”-taq，gotf’-taq，gotf”-taq在20秒延伸條件下擴增1.5kb、2.5kb、3.5kb和4.5kbdna片段。實驗結果證明，重組耐熱dna聚合酶相對taqdna聚合酶擴增效率更高(如圖1所示)、擴增速度更快(如圖2所示)。(三)血清耐受性對比實驗以taq，hltf’-taq，hltf”-taq，htf’-taq，htf”-taq，mmtf’-taq，mmtf”-taq，gotf’-taq，gotf”-taq配制定量pcr反應體系(sybrgreen),加入pcv2dna病毒粒子(103pcv2particles/reaction),pcv2引物,和不同量的豬血清(each0，1，2，3，4μlofpigserumintotal20μlofqpcrsolution),進行pcr擴增。加入血清的樣品(1-4μl)比未加入(0μl)的樣品擴增效率明顯下降,但使用重組耐熱dna聚合酶和taq擴增的樣品具有極顯著的下降速率差異。(如圖3所示)，實驗結果證明，重組耐熱dna聚合酶相對taqdna聚合酶血清耐受性更高。實施例4將實施例1、2中改造后的轉鐵蛋白dna結合域與逆轉錄酶進行偶聯(lián)，形成重組逆轉錄酶。進行rt-pcr實驗分析，經與實施例3類似的擴增效率對比實驗、擴增速度對比實驗、血清耐受性對比實驗，基本得到相似的結果，擴增效率更高、擴增速度更快、血清耐受性更高。實施例5將實施例1、2中改造后的轉鐵蛋白dna結合域中相同的dna結合域聯(lián)在一起后再與dna聚合酶偶聯(lián)，構建重組dna聚合酶；或將實施例1、2中改造后的轉鐵蛋白dna結合域中不同的dna結合域串聯(lián)在一起后再與dna聚合酶偶聯(lián)，構建重組dna聚合酶；均可得到類似的實驗結果，擴增效率更高、擴增速度更快、血清耐受性更高。另外，將實施例1、2中構建的重組dna酶、或本實施例中構建的上述重組dna酶與其他現有技術中的重組dna聚合酶或未改造的dna聚合酶混合后可獲得復合的重組dna聚合酶，其相對于普通的dna聚合酶也具有擴增效率更高、擴增速度更快、血清耐受性更高的優(yōu)點。最后需要說明的是，本發(fā)明中所述的第10位、第20位并非為固定位置，其表明的是該兩個位置對應的氨基酸均為c，兩個c相差10個氨基酸，其它第1-5位、第28-31位均是相對于第10位而言的位置。即對于一個40個氨基酸的dna結合域，其中有兩個氨基酸均為c，且兩者之間相差10個氨基酸，則將這兩個氨基酸對應的位置定為第10、第20位。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，本領域技術人員利用上述揭示的技術內容做出些許簡單修改、等同變化或修飾，均落在本發(fā)明的保護范圍內。當前第1頁12當前第1頁12