油菜nf-yb基因家族基因的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及油菜NF-YB基因家族基因的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 真核生物在轉(zhuǎn)錄時不僅需要RNA聚合酶，往往還需要多種蛋白質(zhì)因子的協(xié)助，而 這類蛋白質(zhì)因子則被稱為轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor)。轉(zhuǎn)錄因子，又稱為反式作用 因子（trans-acting factor)，是一群能與基因5'端上游或3'端下游特定序列（順式作 用元件，cis-acting element)專一,性結(jié)合，對基因的表達起抑制或增強的作用，從而保證 目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質(zhì)分子。一般可將轉(zhuǎn)錄因子分為兩 個類：通用轉(zhuǎn)錄因子和特異性轉(zhuǎn)錄因子（包括轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄抑制因子）。NF-Y，全稱 為Nuclear Factor Y，是一類特異性轉(zhuǎn)錄因子，也被稱為Heme Activator ￡rotein(HAP) S￡CAAT-box finding Eactor(CBF)，有三個亞單位組成，分別是 NF-YA(CBF-B、HAP2)、 NF-YB(CBF-A、HAP3)及NF-YC(CBF-C、HAP5)，NF-Y就是特異性轉(zhuǎn)錄因子（包括轉(zhuǎn)錄激活因 子和轉(zhuǎn)錄抑制因子）。
[0003] NF-Y與其他蛋白結(jié)合形成蛋白復合物結(jié)合在許多基因啟動子上游的CCAAT框上， 從而發(fā)揮功能。在植物體中約30%基因的啟動子中含有CCAAT框。在植物中，NF-YA、NF-YB 和NF-YC分別是以多基因家族的形式存在的。然而，在動物及酵母中NF-YA、NF-YB和NF-YC 是單基因。
[0004] NF-Y在動物、植物及微生物中均有研究。NF-Y在微生物的研究涉及的生物有釀 酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)、乳 酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis)、紅褐肉座菌（Hypocrea jecorina)、構(gòu)巢曲霉 (Aspergillus nidulans)〇
[0005]在酵母中，HAP2、HAP3和HAP5能與線粒體上的CYC1 (iso-1-cytochrome c)的UAS2 結(jié)合，其中任何一個HAP2、HAP3或者HAP5的突變失活都會阻礙CYC1基因表達，從而導致 酵母在以乳酸為碳源的培養(yǎng)基中無法生長。進一步研究中發(fā)現(xiàn)，HAP2、HAP3和HAP5蛋白可 以通過形成HAP復合體來調(diào)節(jié)CYC1基因表達。此外，HAP4是酵母的第四個HAP亞基，其在 HAP復合體中能夠協(xié)助該復合體與CCAAT-box結(jié)合。酵母的LPD1基因編碼硫辛酰胺脫氫酶 (lipoamide dehydrogenase，LPDH)，其與 CYC1 -樣，可由 HAP 復合體正向調(diào)控。
[0006] NF-Y在動物的研究涉及的生物有小鼠、大鼠、人、果蠅和線蟲等，研究表明NF-Y參 與調(diào)控細胞周期、細胞凋亡、細胞衰老和細胞癌變等重要的生理過程NF-Y作為一類關(guān)鍵的 調(diào)節(jié)因子在植物許多生理過程（比如抗干旱、花期、種子發(fā)育等）中扮演著重要的角色。甘 藍型油菜是一種重要的油料作物，可以用作工業(yè)原料、生物能源、食品添加劑、動物飼料等， 在其生長發(fā)育過程中，受各種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，以響應體外體內(nèi)的各種信號。在甘藍型油菜 (Brassica napus L.)中，首先鑒定的 NF-Y 是 BnCBF-Bl 和 BnCBF-B2,它們是一個 BnCBF-B 基因的兩個不同的選擇性剪切（選擇性剪切發(fā)生在5'端），分別編碼314個氨基酸和303 個氨基酸的蛋白質(zhì)（這兩種蛋白質(zhì)的區(qū)別在N端），它們在不同的組織中都有表達。后續(xù)研 究表明，該基因在油菜生殖器官發(fā)育中扮演著十分重要的作用，在油菜的生殖器官中表達 BnCBF-B反義轉(zhuǎn)錄本可導致可育花粉粒的減少并伴有雌性可育能力的。
[0007]在 2011 年，BnLECl(grassica napus LEAFY S0TYLED0N1)和 BnLlL(grassica napus LEAFY C0TYLED0N1-LIKE)得到鑒定，并發(fā)現(xiàn)在油菜種子形成時期過表達BnLECl和 BnLIL能夠?qū)⒎N子的含油量提高2~20%。在這些轉(zhuǎn)基因油菜的種子形成過程中，許多參 與脂肪酸生物合成和糖酵解的基因表達發(fā)生了上調(diào)。另外，在轉(zhuǎn)BnLECl基因植株發(fā)育的種 子和長角果鞘中，發(fā)現(xiàn)一些參與蔗糖合成和轉(zhuǎn)運的基因的表達得到增強。同時還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn) 基因油菜發(fā)育的種子中蔗糖和果糖的積累，這表明流向脂肪酸合成的碳增加了。
[0008] 研究報道發(fā)現(xiàn)，在長日照條件下，擬南芥中的AtNF_YB2和AtNF_YB3可以通過激活 FT 的表達，F(xiàn)T 又可以激活 SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1(S0C1)的表達，進而促 進擬南芥開花。
[0009] 二穗短柄草的BdNF-YB6和大麥的HvNF-YBl是AtNF-YB2和AtNF-YB3的同源基因， 研究報道表明均能促進植物的開花。
[0010] 在擬南芥中，過表達AtNF-YBl可以增強擬南芥抵抗干旱的能力。在水分充足 的條件下，AtNF-YBl在擬南芥的各個器官和組織中均有不同程度的表達，在干旱試驗中， AtNF-YBl在成熟葉中的表達增加了 12倍。在玉米（Zea mays)中，與AtNF-YBl同源的 ZmNF-YB2同樣也表現(xiàn)出相應的抵抗干旱的功能。
[0011] 目前對油菜的NF-YB家族基因的研究報道的還不是太多，對其功能的研究還不深 入，我們目前的研究對他人及后續(xù)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供油菜NF-YB基因家族基因的應 用。
[0013] 本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0014]油菜 NF-YB 基因家族中的五個成員 BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/ BnNF-YB6基因在促進植物提前開花、增加根伸長率、提高植物抗逆性中的應用；其中所述 的 BnNF-YB2 基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示，BnNF-YB3 基因 cDNA 序列如 SEQ ID N0. 2 所示，BnNF-YB4基因cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，BnNF-YB5基因cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示，BnNF-YB6基因基因cDNA序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0015] 其中，所述的抗逆性優(yōu)選抗干旱和/或抗鹽。
[0016] 含有油菜NF-YB基因家族中的五個成員BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/ BnNF-YB5/BnNF-YB6基因的重組表達載體在促進植物提前開花、增加根伸長率、提高植物抗 逆性中的應用；其中所述的BnNF-YB2基因cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，BnNF-YB3基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 2 所示，BnNF-YB4 基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 3 所示，BnNF-YB5 基因cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示，BnNF-YB6基因基因cDNA序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0017] 其中，所述的抗逆性優(yōu)選抗干旱和/或抗鹽。
[0018] 所述的重組表達載體優(yōu)選將所述的BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/ BnNF_YB6基因分別插入在表達載體Binary vector pCAMBIA-1302的Nco I和Spe I兩個 酶切位之間所得。
[0019] 有益效果：
[0020] 本發(fā)明克隆得到油菜NF-YB基因家族中的五個成員BnNF-YB2/BnNF-YB3/ BnNF-YB4/BnNF-YB5/BnNF-YB6 基因，BnNF-YB2 和 BnNF-YB3/ 都是 AtNF-YB2 的同源基 因，BnNF-YB2 和 BnNF-YB3/ 與 AtNF-YB2 相似度分別是 61. 9 % 和 61. 4 %。BnNF-YB4/ BnNF-YB5/BnNF-YB6 都是 AtNF-YB3 的同源基因，BnNF-YB4/BnNF-YB5/BnNF-YB6 與 AtNF-YB3 的相似度分別是 59. 3%、69. 2%和 66. 6%。
[0021] 我們實驗研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn) BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/BnNF-YB6 不 僅參與植物光周期花期調(diào)控，均能促進擬南芥提前開花，在植物抗逆境途徑中也發(fā)揮著正 調(diào)控作用。過表達的擬南芥比野生型的擬南芥根的伸長率增加。在鹽（75mMNaCl)及干旱 (lOOmMmannitol)脅迫處理下，與野生型擬南芥相比，過表達擬南芥根伸長率仍然增加。這 為培育耐鹽、耐干旱的油菜新品種提供了一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
【附圖說明】
[0022] 圖1.高保真PCR擴增BnNF-YB2/3/4/5/6的結(jié)果
[0023] M:Marker I ;A、B、C、D、E 分別是 BnNF-YB2/3/4/5/6
[0024] 圖2?雙酶切結(jié)果
[0025] Ml ：Maker I ；M2 ：DL2000DNA Marker ；M3 ：DL15000DNA Marker ； 1 ：BnNF-YB2 ； 2 ：BnNF-YB4 ；3 ：BnNF-YB3 ；4 ：BnNF-YB5 (483) ；5 ：BnNF-YB5 (489) ；6 ：BnNF-YB6 (579) ；7 ： BnNF-YB6(570) ；8 ：Binary vector pCAMBIA-1302
[0026] 圖3. 35S: :BnNF-YB2/3/4/5/6轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性苗PCR檢測驗證
[0027] 注（A)、（C)、（E)和（F)所用驗證引物為35S GFP