專利名稱：油菜呼吸代謝相關(guān)基因BnAOX1及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，更具體涉及一種油菜呼吸代謝相關(guān)酶基因BnAOXl,同時(shí)還涉及一種油菜呼吸代謝相關(guān)酶基因BnAOXl在提高油料作物的產(chǎn)量和含油量中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
油菜籽是世界上食用植物油和飼用蛋白質(zhì)的最主要來(lái)源之一，也是歐洲生物柴油最重要的原料。油菜是我國(guó)種植面積最大的油料作物，也是繼水稻、小麥、玉米和大豆之后我國(guó)的第五大農(nóng)作物。菜籽油是我國(guó)居民的主要食用油，占國(guó)產(chǎn)植物油消費(fèi)總量的40%以上。我國(guó)作為世界第一植物油消費(fèi)大國(guó)，植物油的自給率不足40%。為解決這些需求矛盾，除擴(kuò)大種植面積外，提高油菜含油量和產(chǎn)量是提高其單位面積產(chǎn)油量的最有效途徑。高產(chǎn)油量能夠顯著提高油菜生產(chǎn)效益，提高油菜籽的總體利潤(rùn)。植物線粒體電子傳遞鏈有多條途徑存在，其中主要有細(xì)胞色素主路和抗氰交替途徑支路兩條途徑?？骨韬粑?交替途徑)指的是對(duì)氰化物不敏感的一條呼吸途徑。交替氧化酶(alter native oxidase, A0X)是植物線粒體呼吸鏈中抗氰呼吸途徑(cyanide-resistant respiration pathway)的末端氧化酶，它廣泛存在于高等植物及部分真菌和藻類中。交替氧化酶作為交替途徑的末端氧化酶，其內(nèi)源底物包括還原泛醌和02。交替途徑的呼吸電子流從主路(細(xì)胞色素途徑)泛醌處分支出來(lái)，繞過(guò)復(fù)合物III和IV兩個(gè)ATP形成位點(diǎn)，直接由AOX催化分子氧的4個(gè)電子還原成水，而未用來(lái)合成ATP的能量則以熱的形式被散失掉。交替氧化酶是一種雙鐵羧基蛋白(di-iron carboxylate protein),它不僅具有其它雙鐵羧基蛋白共有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及去除分子氧的功能，更重要的是它還可以通過(guò)改變自身結(jié)構(gòu)等方式來(lái)主動(dòng)調(diào)節(jié)抗氰呼吸途徑的運(yùn)行程度，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞多方面的代謝和功能，以適應(yīng)環(huán)境條件的改變，增強(qiáng)植物適應(yīng)各種逆境的能力，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)速率，并與細(xì)胞凋亡和光合作用相關(guān)。AOX活性調(diào)控受多種因素影響，環(huán)境脅迫、植物受傷、凍害、干旱、滲透壓及病菌等都可誘導(dǎo)AOX表達(dá)。水楊酸(SA)、過(guò)氧化氫、乙烯和主呼吸鏈抑制劑也同樣能誘導(dǎo)AOX在植物中的表達(dá)?？骨韬粑钚院虯OX表達(dá)在產(chǎn)熱植物的佛焰花序中較高。在非產(chǎn)熱植物中，AOX表達(dá)水平與發(fā)育狀態(tài)有關(guān)，如在衰老和果實(shí)成熟過(guò)程中都有AOX的表達(dá)。AOX調(diào)節(jié)能量代謝，當(dāng)能量代謝飽和時(shí)，AOX途徑以散熱方式釋放能量，維持電子傳遞和TCA。LamberS(1982)提出的能量溢滿理論認(rèn)為當(dāng)主呼吸鏈活性受到抑制時(shí)，或細(xì)胞還原力偏高時(shí)，電子通過(guò)AOX傳遞可使TCA循環(huán)和糖酵解繼續(xù)進(jìn)行。AOX活性能為T(mén)CA循環(huán)底物丙酮酸激活，說(shuō)明TCA循環(huán)的底物過(guò)高時(shí)可誘導(dǎo)AOX途徑轉(zhuǎn)移部分電子。環(huán)境變化導(dǎo)致AOX表達(dá)差異，不僅改變線粒體功能，也影響線粒體外細(xì)胞功能。氧脅迫誘導(dǎo)AOX表達(dá)并抗氧化，當(dāng)細(xì)胞色素途徑受抑時(shí)，主呼吸鏈產(chǎn)生活性氧(ROS)，AOX氧化可使ROS下降。在 轉(zhuǎn)基因煙草中AOX的超量表達(dá)時(shí)ROS水平下降，反之ROS水平則提高。Hansen等(2002)測(cè)量熱呼吸發(fā)現(xiàn)環(huán)境變化能改變植物生長(zhǎng)率，AOX對(duì)植物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)起平衡作用。產(chǎn)熱植物通過(guò)AOX釋放的熱量可使花粉散發(fā)芳香氣味吸引蟲(chóng)媒(Meeuse等，1975)。非產(chǎn)熱植物組織中AOX的表達(dá)與此同產(chǎn)熱無(wú)關(guān)(Borecky and Vercesi，2005)。AOX可有效調(diào)控呼吸率保持細(xì)胞能量恒定以保證植物在環(huán)境變化時(shí)正常生長(zhǎng)(Hansen等，2002)。AOX不僅使擬南芥在低溫下發(fā)芽，而且AOX能防止植物組織在逆境中產(chǎn)生過(guò)氧化物而廣泛影響細(xì)胞功能(Fiorani等，2005)。AOX在細(xì)胞質(zhì)和一些碳代謝途徑中發(fā)揮重要作用(Umbach等，2005)。各種環(huán)境脅迫都能改變植物抗氰途徑的運(yùn)行，但這些研究還很膚淺，其運(yùn)行的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制和生理意義還不清楚
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種油菜呼吸代謝相關(guān)基因BnAOXl，本發(fā)明提供了這個(gè)基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO 1所示的DNA序列，也包括與SEQID NO 1所示的DNA序列至少有70%同源性的本物種及其它物種中的基因序列。該基因?qū)儆谥参锝惶嫜趸讣易逯械囊粏T，它通過(guò)調(diào)節(jié)抗氰呼吸途徑的運(yùn)行程度，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞多方面的代謝和功能，以適應(yīng)環(huán)境條件的改變，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)速率，并與細(xì)胞凋亡和光合作用相關(guān)。在擬南芥中該基因被抑制可導(dǎo)致部分基因表達(dá)量發(fā)生改變，但未見(jiàn)對(duì)其表型的影響報(bào)道。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種油菜呼吸代謝相關(guān)基因BnAOXl在提高油料植物含油量中的應(yīng)用。將此基因應(yīng)用于油料作物育種，可以提高油料作物種子的含油量，最大限度的提高油料作物的產(chǎn)油量。本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供了一種油菜呼吸代謝相關(guān)基因BnAOXl在提高擬南芥植物種子千粒重中的應(yīng)用。通過(guò)模式植物擬南芥證實(shí)BnAOXl基因不但可調(diào)控種子含油量的變化，同時(shí)還增加了千粒重。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施本發(fā)明申請(qǐng)人通過(guò)分析油菜含油量差異顯著的兩親本及F2代分離群體混合樣本的基因表達(dá)差異，篩選出一類在親本及F2代極端分離材料中同時(shí)存在表達(dá)差異的基因，其中包括BnAOXl基因。為了驗(yàn)證該基因是否影響種子含油量或種子其它性狀，申請(qǐng)人通過(guò)基因全長(zhǎng)的克隆，表達(dá)載體的構(gòu)建以及模式植物擬南芥的轉(zhuǎn)化。該油菜呼吸代謝相關(guān)基因BnAOXl在提高油料植物含油量和千粒重中應(yīng)用。一、基因的來(lái)源一種油菜呼吸代謝相關(guān)基因BnAOXl的制備方法，其步驟是以高低含油量品系z(mì)y036與y817(含油量分別為51%和35% )雜交構(gòu)建F2代群體共得到169個(gè)后代單株為材料；分別收集各F2單株開(kāi)花后25天左右的角果(帶角果皮和胚珠);各單株成熟種子進(jìn)行含油量檢測(cè)，將含油量檢測(cè)大于47%和小于38. 5%的單株的角果分別取等量200mg混合組成兩極端含油量混合樣本分別編號(hào)H(含油量大于47%的有11株)和L(含油量小于38. 5%的有11株)，兩個(gè)混樣平均含油量相差11. 1%。分析兩親本及兩混樣表達(dá)基因，找出親本與F2代混樣表達(dá)量同時(shí)表現(xiàn)差異的基因，BnAOXl基因即源于此。本研究中所用的親本材料zy036和Y817，均由中國(guó)農(nóng)科院油料所生物技術(shù)育種課題組技術(shù)人員在王漢中研究員帶領(lǐng)下育成。zy036品系是由中雙4號(hào)、中雙7號(hào)、中雙9號(hào)、華雙3號(hào)、油研9號(hào)(中雙4號(hào)、中雙7號(hào)、中雙9號(hào)、華雙3號(hào)、油研9號(hào))構(gòu)建輪回選擇群體，輪回選擇兩代后選優(yōu)良單株進(jìn)行小孢子培養(yǎng)輪回選擇第三代，最終經(jīng)高油定向選擇得到。Y817是雜交品種中油雜I號(hào)的保持系(中油雜一號(hào)制種技術(shù)研究與應(yīng)用，農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技，2001年第10期)。二、基因的全長(zhǎng)克隆通過(guò)篩選基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)BnAOXl基因在油菜高油親本及高油F2混合群體中表達(dá)量高于低油親本及低油F2混合群體。因此申請(qǐng)人根據(jù)arabidopsis網(wǎng)站擬南芥AOXl基因的序列和申請(qǐng)人自己的測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找與之同源的油菜基因組序列拼接，并設(shè)計(jì)基因編碼區(qū)序列的兩側(cè)引物。以親本zy036cDNA第一鏈為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行測(cè)序，獲得BnAOXl基因的編碼區(qū)序列，還包括在添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸而產(chǎn)生的突變體等位基因或衍生物。一種分離的蛋白質(zhì)，其堿基序列為SEQ IDNO :I所不的核昔酸序列。一種分尚的蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)序列為SEQ ID NO :2所不的氣基酸序列。同時(shí)，利用arabidopsis網(wǎng)站上的基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增擬南芥中同源基因AtAOXl序列。利用擬南芥作為受體的轉(zhuǎn)基因結(jié)果證實(shí)，此類基因的過(guò)量表達(dá)可以提高擬南芥種子的含油量，同時(shí)也增加了種子的粒重。因此，此類基因在油菜及其他油料作物的產(chǎn)油量育種中具有很好的應(yīng)用前景。三、轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證通過(guò)上述方法獲得了油菜BnAOXl基因，采用一種提高油菜基因表達(dá)活性的轉(zhuǎn)基因擬南芥，其特征在于與受體對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因植株)相比，轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)為基因表達(dá)量增力口，其具體措施是一種PCR8/GW/T0P0質(zhì)粒(invitrogen公司購(gòu)買(mǎi))，可以與表達(dá)載體質(zhì)粒重組構(gòu)建基因表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)方法(invitrogen公司購(gòu)買(mǎi))。一種質(zhì)粒表達(dá)載體PearleygatelOO (invitrogen公司購(gòu)買(mǎi)),它含有35S啟動(dòng)子和翻譯控制件。一種可在植物中表達(dá)的宿主菌(如GV3101，LBA4404等)，本發(fā)明優(yōu)選的是農(nóng)桿菌(GV3101, invitrogen 公司購(gòu)買(mǎi))。一種能夠過(guò)量表達(dá)某基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥，其特征在于擬南芥中所轉(zhuǎn)基因表達(dá)量增加。其應(yīng)用過(guò)程包括下列步驟I)將克隆得到的油菜基因與PCR8/GW/T0P0質(zhì)粒連接，利用PCR8/GW/T0P0質(zhì)粒與質(zhì)粒表達(dá)載體PearleygatelOO可以體外重組的特性將油菜基因轉(zhuǎn)移至表達(dá)載體；2)將步驟I)中制備的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，再導(dǎo)入擬南芥植株中。3)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株P(guān)CR鑒定，除草劑(Bar，草苷膦)篩選后正常條件生長(zhǎng)并收獲種子測(cè)定含油量。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的含油量與對(duì)照擬南芥相比有較大幅度的提聞。本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因植物”是指含有導(dǎo)入的基因并能夠穩(wěn)定地增強(qiáng)或抑制所導(dǎo)入的基因表達(dá)并產(chǎn)生具有特定的生物學(xué)性狀的植物。克隆本發(fā)明中所述的油菜基因的方法是本領(lǐng)域中所常采用的方法如利用CTAB法提取植物葉片DNA，提取mRNA的方法也有多種成熟的技術(shù)，如米用 T RIzol Reagent, Invetrogen 公司或 Total RNA extraction,qiagen公司，可從商業(yè)途徑獲得。構(gòu)建cDNA文庫(kù)也是常用的分子生物學(xué)技術(shù)。構(gòu)建本發(fā)明中所述的載體和將載體轉(zhuǎn)染入植株也是本領(lǐng)域中所常采用的方法。其中所涉及的質(zhì)粒(入門(mén)載體PCR8/GW/T0P0，質(zhì)粒表達(dá)載體PearleygatelOO)，轉(zhuǎn)染用媒體(如根癌農(nóng)桿菌GV3101和所用試劑(蔗糖等)可從商業(yè)途徑獲得。聚丙烯酰胺凝膠電泳是分子標(biāo)記的多態(tài)性分析的最常用手段，所有試劑如丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺等均可從商業(yè)途徑獲得。轉(zhuǎn)基因擬南芥分析通過(guò)在野生擬南芥中過(guò)量表達(dá)BnAOXl、AtAOXl基因，轉(zhuǎn)基因擬南芥整 體植株表型與野生型沒(méi)有明顯區(qū)別。收獲種子后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)AOXl基因的植株種子明顯大于野生型對(duì)照。通過(guò)脈沖式核磁共振儀測(cè)定含油量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照相比，含油量均有不同程度的提高，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子含油量與野生型擬南芥相比有明顯提高，最聞幅度可達(dá)20%以上。而千粒重也有所增加，增加幅度最聞達(dá)25% (見(jiàn)表I)。上述結(jié)果表明，不僅油菜AOXl基因可以提高種子含油量，同時(shí)還可以增加粒重，而且與此類油菜基因序列有70%同源性的其它物種基因同樣可以提高含油量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明中油菜BnAOXl基因?yàn)槭状螆?bào)導(dǎo)與種子含油量、粒重相關(guān)。交替氧化酶(AOXl)具有其它雙鐵羧基蛋白共有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及去除分子氧的功能，屬于植物交替氧化酶家族中的一員。它通過(guò)調(diào)節(jié)抗氰呼吸途徑的運(yùn)行程度，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞多方面的代謝和功能，以適應(yīng)環(huán)境條件的改變，增強(qiáng)植物適應(yīng)各種逆境的能力，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)速率，并與細(xì)胞凋亡和光合作用相關(guān)。在擬南芥中該基因被抑制可導(dǎo)致部分基因表達(dá)量發(fā)生改變，但未見(jiàn)對(duì)其表型的影響報(bào)道。通過(guò)在擬南芥中的轉(zhuǎn)基因研究證實(shí)，此類基因確實(shí)可以提高種子含油量，同時(shí)還可以增加種子粒重。此類基因可以應(yīng)用于油菜高含油量育種，通過(guò)使用組成型啟動(dòng)子35S在油菜品種中超量表達(dá)此類基因，得到含油量提高且千粒重增加的油菜新品種，加快油菜含油量育種的步伐。同時(shí)，將其擴(kuò)展到其他油料作物如大豆、花生、芝麻等的育種應(yīng)用中，最大限度的提高油料作物的產(chǎn)油量。


圖I為一種油采呼吸代謝相關(guān)基因BnAOXl的擬南介表達(dá)載體不意2為一種油菜呼吸代謝相關(guān)基因BnAOXl的擬南芥Tl代的轉(zhuǎn)基因鑒定結(jié)果。圖3為一種油菜呼吸代謝相關(guān)基因BnAOXl的野生型對(duì)照種子的大小比較示意圖。其中圖3A為野生對(duì)照，圖3B為轉(zhuǎn)基因株系的種子。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :BnA0Xl、AtAOXlcDNA 編碼區(qū)序列一種油菜呼吸代謝相關(guān)基因BnAOXl的制備方法，其步驟是在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索已發(fā)表的擬南芥基因序列，BLAST NCBI網(wǎng)站的油菜EST序列，并結(jié)合擬南芥序列設(shè)計(jì)基因編碼序列的兩側(cè)引物(BnAOXlF :正向引物[5，-atgatgatgagtcgctacgg_3，],反向引物:[5，_tcaatgatccaattggag_3，]用來(lái)從油菜 15天角果cDNA中擴(kuò)增對(duì)應(yīng)序列。擬南芥中的擴(kuò)增引物分別為AtA0Xl (arabidopsis網(wǎng)站)正向引物[5，-atgatgatgagtcgtcgcta-3，],反向引物[5，-tcaatgatatccaatgggagc-3，],直接在擬南芥10天角果cDNA中擴(kuò)增。I、提取油菜、擬南芥mRNA。RNA的提取(TRIZ0L TM Kit提取RNA)，液氮研磨IOOmg材料。A.加 lmlTRIZOL，室溫(20_25°C，以下相同)放置 5min。B.加入200ul氯仿，劇烈振蕩30s，室溫放置2min。
C. 12000g，15min，4 °C，取上清至新管中，加入500uI異丙醇，混勻后室溫放置15min。D. 12000g, 15min, 4°C,去上清,加入 lml70*% (體積比)乙醇。E. 7500g，7min，4°C，去上清，空氣干燥。F. DEPC-H2O 溶解。2、cDNA 第一鏈的反轉(zhuǎn)錄米用 RevertAid H Minus First Strand cDNASynthesisKit (Fermentas),操作參照所用試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。3、以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了 BnAOXl及AtAOXl基因序列如一種油菜呼吸代謝相關(guān)基因BnAOXl，一種分離的蛋白質(zhì)，其堿基序列為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。一種分尚的蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)序列為SEQ ID NO :2所不的氣基酸序列所不以及NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的擬南芥基因序列。實(shí)施例2 :轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥的轉(zhuǎn)化將PCR擴(kuò)增得到的基因序列與TOPO A門(mén)載體(invitrogen公司)連接后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5 a (invitrogen公司)中，壯觀酶素篩選，載體引物(T7引物，TAATACGACTCACTATAGGG)與基因引物(基因上游引物，引物序列見(jiàn)實(shí)施例I)擴(kuò)增鑒定正向插入克隆，質(zhì)粒經(jīng)小量制備后與PearleygatelOO (invitrogen公司)進(jìn)行重組,并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5ci中，卡那霉素篩選，其插入片段經(jīng)載體引物(35S啟動(dòng)子序列引物，CACGTCTTCAAAGCAAGTGGA)與基因引物(基因下游引物，引物序列見(jiàn)實(shí)施例1)PCR鑒定，示意圖見(jiàn)圖I。擬南芥的轉(zhuǎn)化過(guò)程試劑配制滲透培養(yǎng)基(IL)l/2xMurashige-Skoog ；5% (質(zhì)量比)蔗糖；0. 5 克 MES ;用 KOH調(diào)至pH5. 7 ;再加10ul lmg/ml的6_BA(6_芐氨基嘌呤)母液；200微升Silwet L-77。轉(zhuǎn)化步驟(I)制備好已轉(zhuǎn)化了相應(yīng)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌(GV3101，市場(chǎng)可購(gòu)買(mǎi))菌液10ml，在轉(zhuǎn)化前一天晚上，轉(zhuǎn)入大瓶培養(yǎng)過(guò)夜，第二天取出使用時(shí)農(nóng)桿菌液0. D600當(dāng)在I. 2到I. 6之間。(2)室溫 5OOOrpm 離心 15 分鐘。(3)棄上清，將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于相應(yīng)體積的滲透培養(yǎng)基里，使0. D600在0. 8左右。(4)將整個(gè)植株直接浸泡至農(nóng)桿菌懸浮液30s。(5)避光培養(yǎng)過(guò)夜，然后正常培養(yǎng)至結(jié)子，收獲種子作下一步篩選鑒定。實(shí)施例3 :轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選和驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的篩選將春化過(guò)的擬南芥種子種于澆過(guò)飽和花寶二號(hào)(商業(yè)購(gòu)買(mǎi))營(yíng)養(yǎng)液的人工土中，并用保鮮膜罩上。兩天后光照，三天后揭膜。人工培養(yǎng)室條件相對(duì)濕度80%，恒溫20-240C，光照強(qiáng)度80_200umol/M2/S，光照周期為8h黑暗、16h光照培養(yǎng)。一周左右，噴除草劑(草苷膦)篩選陽(yáng)性植株。PCR 鑒定 (I)用于PCR的轉(zhuǎn)化植株總DNA的提取
A. 70% (體積比)乙醇擦洗葉片，稱取大約IOOmgB.加入 600ul 抽提緩沖液(0. 2M Tris-Cl, 0. 25NaCl,25mM EDTA，0. 5% (質(zhì)量比)SDS，pH 7. 5)，室溫快速研磨。C. I. 5ml Ependorff 管中潤(rùn)旋混勻 5_10s。D. 12000rpm, 25min,室溫。取上清,加等體積異丙醇，-20攝氏度沉淀過(guò)夜。E. 12000rpm, 15min,室溫。加入70% (體積比)乙醇200ul泡洗DNA沉淀。F. 12000rpm, 15min,室溫。去乙醇。倒置于紙巾上，待乙醇揮發(fā)干凈。G.加無(wú)菌水IOOul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度計(jì)測(cè)定或電泳估測(cè)其濃度。H.以總DNA為模板，進(jìn)行PCR。(2) PCR 程序PCR反應(yīng)混合液的配比同質(zhì)粒PCR鑒定，依據(jù)植物表達(dá)載體中35S啟動(dòng)子序列和 BnAOXKAtAOXl 基因下游引物 5’ -tcaatgatccaattggag-3’，5’ -tcaatgatatccaatgggagc-3’，反應(yīng)的時(shí)間和溫度如下94°C 3min, 94°C 45s, 59°C 45s,72°C 2min 30s, 30cycles, 72°C 5min。檢測(cè)結(jié)果顯示，大多數(shù)轉(zhuǎn)化植株均能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的電泳條帶，而陰性對(duì)照則沒(méi)有，表明已經(jīng)獲得多株轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。實(shí)施例4.:轉(zhuǎn)基因擬南芥種子含油量及千粒重檢測(cè)轉(zhuǎn)基因純合株系生長(zhǎng)于21_23°C溫室中，收獲種子后測(cè)其含油量及千粒重的變化(圖3)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子含油量與野生型擬南芥相比有明顯提高，最高幅度可達(dá)20%以上。而千粒重也有所增加，增加幅度最高達(dá)25%。表I過(guò)量表達(dá)BnAOXl、AtAOXl基因的擬南芥含油量及千粒重測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種分離的基因序列，其堿基序列為SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列。
2.一種分離的蛋白質(zhì)序列，其序列為SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求I或2所述的ー種分離的蛋白質(zhì)在提高擬南芥植物種子千粒重中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I或2所述的ー種分離的蛋白質(zhì) 在提高擬南芥植物種子含油量中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種油菜呼吸代謝相關(guān)基因BnAOX1及應(yīng)用，通過(guò)篩選基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)BnAOX1基因在油菜高油親本及高油F2混合群體中表達(dá)量高于低油親本及低油F2混合群體。通過(guò)arabidopsis網(wǎng)站擬南芥AOX1基因的序列和測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找與之同源的油菜基因組序列拼接，并設(shè)計(jì)基因編碼區(qū)序列的兩側(cè)引物。以親本zy036cDNA第一鏈為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行測(cè)序，獲得BnAOX1基因的編碼區(qū)序列，還包括在添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸而產(chǎn)生的突變體等位基因或衍生物。利用擬南芥作為受體的轉(zhuǎn)基因結(jié)果證實(shí)，此類基因的過(guò)量表達(dá)可以提高擬南芥種子的含油量，同時(shí)也增加了種子的粒重。因此，此類基因在油菜及其他油料作物的產(chǎn)油量育種中具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102618560SQ201110031200
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2011年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月27日
發(fā)明者劉貴華, 劉靜, 華瑋, 王新發(fā), 王漢中, 胡志勇, 詹高淼 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所