專利名稱：油菜BnRabGDI3基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種控制油菜和擬南芥花粉育性的RabGDI3基因，同時(shí)還涉及一種控制植物花粉育性的RabGDI3基因的制備方法，還涉及一種控制植物花粉育性的RabGDI3基因的用途。本發(fā)明還涉及含有該基因或其同源核苷酸序列的載體和涉及利用該基因在油菜基因工程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Rab蛋白是小分子GTP(鳥苷三磷酸)結(jié)合蛋白家族中最大的亞家族，作為囊泡運(yùn)輸?shù)姆肿娱_關(guān)起重要調(diào)控作用(吳文林，吳穗潔.Rab蛋白的結(jié)構(gòu)、功能與研究展望.臺灣海峽，2006，25 (4) :599-605)。Rab蛋白作用循環(huán)是Rab-GDP與Rab-GTP兩種不同結(jié)合狀態(tài)的轉(zhuǎn)化過程。其中存在于細(xì)胞質(zhì)中的Rab-GDP為無活性狀態(tài)，而與膜結(jié)合的Rab-GTP為有活性的狀態(tài)并參與調(diào)控囊泡的運(yùn)輸(Vanessa Vernoud, Amy C. Horton, Zhenbiao Yang, et al. Analysis of the Small GTPase Gene Superfamily of Arabidopsis. PlantPhysiology, 2003, 131:1191-1208)。對于大多數(shù)Rab蛋白，與特定膜的連接是通過其蛋白C端保守的半胱氨酸異戍二烯化修飾實(shí)現(xiàn)的，這一過程需要GGTase (Rab geranylgeranyltransferase,猶牛兒猶牛兒基轉(zhuǎn)移酶)和REP (Rab escort protein, Rab護(hù)送蛋白)的共同參與來完成(樊俊蝶，王偉，梁愛華.Rab蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及進(jìn)化.《生命的化學(xué)》，2004，24(1) :31-33)。而經(jīng)過修飾的Rab蛋白的穩(wěn)定狀態(tài)則受到Rab⑶I的控制。RabGDI (Rab GDP dissociation inhibitor proteins)是一種 GDP 解離抑制齊IJ，是Rab⑶P/RabGTP轉(zhuǎn)化過程所需的調(diào)控因子之一。該因子在Rab蛋白調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著重要作用。它能夠抑制Rab蛋白釋放GDP (鳥苷二磷酸)，從而使Rab蛋白不能與GTP (鳥苷三磷酸)結(jié)合，使其維持在無活性狀態(tài)。膜結(jié)合的有活性的Rab-GTP，參與囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)，最后轉(zhuǎn)變成Rab-GDP，在Rab⑶I的作用下與膜分離。Rab⑶I分離Rab-GDP的過程可能是自發(fā)的，但此過程還需要其它因子的調(diào)節(jié)，例如GTPase激活蛋白(GTPaseactivating protein, GAP)和鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotideexchange factor, GEF, Yao-ffen Wu, Ku1-Thong Tan, Herbert ffaldmann, et al. Alexandrovinteraction analysis ofprenylated Rab GTPase with Rab escort protein and GDPdissociation inhibitor explains the needfor both regulators. PNAS, 2007, 104(30):12294-12299)。RabGDI，最早是從牛腦細(xì)胞質(zhì)中分離得到的，起初的研究發(fā)現(xiàn)GDI是一種抑制⑶P從Rab3A解離的蛋白。隨后的研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)⑶I可以使失去活性的Rab⑶P從膜上分離，回到胞液中從而進(jìn)入下個(gè)循環(huán)。GDI有廣泛作用的特性，例如對Rab3A起作用的GDI對已檢測得到的哺乳動物中的其它Rab蛋白都起作用，因此將其統(tǒng)一命名為“ RabGD I ”(Takashi Ueda, Noriyuki Matsuda, Toyoaki Anai, et al. An Arabidopsis gene Isolatedby a novel method for detecting genetic interaction in Yeast encodes the GDPdissociation inhibitor of Ara4 GTPase. ThePlant Cell, 1996，8:2079-2091 )。隨后的研究發(fā)現(xiàn)在酵母中只有I個(gè)GDI基因，是由GDI1/SEC19編碼的，該基因的突變體表現(xiàn)出多種表型，并對囊泡運(yùn)輸途徑造成影響。而在老鼠的基因組中至少存在5個(gè)GDI基因(Janoueix-Lerosey1.,Jollivet F. ,Camonis J. , et al.Two-hybrid systemscreenwith the small GTP-binding protein Rab6.Biol Chem, 1995，270:14801-14808)。Uedal996年發(fā)現(xiàn)了一個(gè)編碼擬南芥Rab⑶I的基因，即AtRab⑶II，這是第一個(gè)在高等植物里定位的GDI。后續(xù)的研究又在擬南芥中又發(fā)現(xiàn)了 AtRabGDI2。目前發(fā)現(xiàn)在擬南芥中存在三個(gè)編碼Rab⑶I的基因4七1^1^0114七1^1^013。其中通過酵母突變體 secl9 功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí) AtRab⑶Il (At2g44100)和 AtRab⑶ 12 (At3g59920)在酵母和植物中具有保守的功能活性。研究表明AtRabGDIl在各組織中均有表達(dá)，而AtRab⑶12在根中表達(dá)量較高，在花中少量表達(dá)，而在其它組織中表達(dá)量極低(UedaT. , MatsudaN. , Anai T.,et al. An Arabidopsis geneisolated by a novel method fordetecting genetic interaction in yeast encodes the GDP dissociationinhibitor of Ara4 GTPase. Plant Cell, 1996, 8:2079-2091;Ueda T. , Yoshizumi T. , Anai T. , etal. AtGDI2, a novel Arabidopsis gene encoding a Rab GDP dissociation inhibitor.Gene, 1998, 206:137-143;Zarsky V. , Cvrckova F. , Bischoff F.,et al. At-GDIl fromArabidopsis thaliana encodes arab-specific GDP dissociation inhibitorthat complements the sec 19 mutation of Saccharomycescerevisiae.FEBSLett, 1997,403:303-308。Kim等在通過真菌侵染水稻的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)侵染早期，水稻中的兩個(gè)Rab⑶I (Os⑶Il和Os⑶12)表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)。雖然具體的分子機(jī)制還不清楚，但推測OsGDI在植物對病原侵害早期的抵御信號擴(kuò)散具有重要作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)它們與煙草GDI的蛋白同源性為86%-87%，與擬南芥蛋白同源性為82%-84%，說明該基因可能在植物抗性方面也具有一定的研究價(jià)值(Kim W. Y. , Kim C. Y. , Cheong N. E. , et al. Characterizationof two fungal-eIicitor induced rice cDNAs encoding functional homologuesofthe rab-specific GDP-dissociation inhibitor. Planta 1999,210:143-149)。關(guān)于AtRab⑶13及BnRab⑶13的表達(dá)分析以及其它相關(guān)研究未見報(bào)道。近年來，基于微RNA (microRNA, miRNA)作用原理而發(fā)展的人工微RNA(artificialmiRNA, amiRNA)技術(shù)是一種新型的RNA干擾技術(shù)。它利用目標(biāo)基因的特定序列置換植物miRNA的莖序列(一般為21-22nt)，構(gòu)建amiRNA表達(dá)載體來干擾目標(biāo)基因的表達(dá)。該技術(shù)不僅能夠像傳統(tǒng)RNAi技術(shù)一樣同時(shí)干擾沉默所有目標(biāo)序列或基因，同時(shí)也可以精確的干擾基因家族或者等位基因中的單個(gè)特殊目標(biāo)基因，具有聞度的特異性和聞效性，克服了基因代謝補(bǔ)償作用，而且能夠克服傳統(tǒng)RNAi技術(shù)(效應(yīng)分子為小干擾RNA，smallinterfering RNA, siRNA)在實(shí)驗(yàn)操作過程中出現(xiàn)的“脫革巴”等問題(Ossowski S, SchwabR, Weigel D. Genesilencing in plants using artificial microRNAs and other smallRNAs. Plant J. 53:674-690.，2008)，有效的提高了基因干擾的效率。油菜作為中國主要的油料作物，在長江流域廣泛種植，對國計(jì)民生具有重要影響。油菜雜種優(yōu)勢明顯，利用細(xì)胞核雄性不育配制雜種優(yōu)勢組合是雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)了多種類型的細(xì)胞核雄性不育材料，并在理論和應(yīng)用方面取得了重要進(jìn)展，而新型不育源的發(fā)現(xiàn)和研究一直是雜種優(yōu)勢研究的基礎(chǔ)，并以此創(chuàng)造出更多的天然和人工不育材料，為育種和生產(chǎn)所應(yīng)用。
因此，本發(fā)明開發(fā)了一個(gè)和油菜花粉發(fā)育和育性調(diào)控相關(guān)的基因BnRab⑶13。通過熒光定量PCR檢測該基因在可育植株的雄蕊中高量表達(dá)。通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，抑制AtRabGDI3的表達(dá)會造成擬南芥花藥發(fā)育異常，導(dǎo)致雄性不育；而通過在擬南芥中過表達(dá)BnRabGD13基因，和雄性不育轉(zhuǎn)基因植株雜交可以使雜交后代中RabGdDI3基因的表達(dá)水平得到恢復(fù)，同時(shí)花藥和花粉粒的育性也恢復(fù)到正常水平。申請人的結(jié)果預(yù)示著RabGDI3在控制油菜和擬南芥花粉育性，創(chuàng)造雄性不育轉(zhuǎn)基因新材料中具有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種油菜BnRab⑶13基因，該基因在油菜的花蕾及雄蕊中高效表達(dá)，通過抑制該基因的表達(dá)可以降低植物花藥的育性，從而獲得雄性不育植株，應(yīng)用于雜交育種。而且該基因在其它大部分植物組織中不表達(dá)，因此在植物基因工程中沉默該基因的表達(dá)不會引起植物營養(yǎng)生長階段的變化。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種油菜BnRab⑶13基因的制備方法，通過BLAST比對擬南芥及油菜、白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜序基因組測序列數(shù)據(jù)庫，在包含基因全長的序列兩端設(shè)計(jì)同源引物，應(yīng)用簡單的PCR方法即可以獲得該基因的序列。本發(fā)明還有一個(gè)目的是在于提供了一種油菜BnRab⑶13基因在控制油菜和擬南芥花粉育性中的應(yīng)用。通過沉默該基因的表達(dá)，發(fā)明人可以人工創(chuàng)造雄性不育系材料；而利用基因工程技術(shù)過表達(dá)該基因得到的恢復(fù)系材料，可以使雄性不育材料花粉的育性得到恢復(fù)。這一對材料可以在油菜雜交育種生產(chǎn)中應(yīng)用。為了完成上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案為了獲得本發(fā)明，發(fā)明人對花粉發(fā)育過程中的相關(guān)基因進(jìn)行了深入和全面的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新基因BnRabGDI3，在可育植株的花藥中高效表達(dá)，而在不育植株中幾乎不表達(dá)，因此該基因和植物花粉的育性調(diào)控有關(guān)。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)抑制該基因的表達(dá)會造成擬南芥花藥發(fā)育異常，導(dǎo)致雄性不育。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，上述目的可以通過提供油菜花藥高效表達(dá)基因BnRab⑶13來實(shí)現(xiàn)，所述基因含有SEQ ID No.1所述核苷酸序列或與它們實(shí)質(zhì)上同源的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，上述目的可以通過提供植物油菜花藥高效表達(dá)多肽BnRab⑶13來實(shí)現(xiàn)，所述多肽含有SEQ ID No. 2氨基酸序列或與它們實(shí)質(zhì)上同源的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，上述目的通過提供含有BnRab⑶13基因靶標(biāo)(AATUTUTATATUUTGTUGAG)序列的人工微RNA干擾重組載體(pamiRNA1-Rab⑶13)來實(shí)現(xiàn)對擬南芥中RabGDI3基因表達(dá)量的抑制。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，上述目的可以通過提供用所述重組載體(pamiRNA1-BnRab⑶13)轉(zhuǎn)化的微生物(根癌農(nóng)桿菌EHA105，購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)來實(shí)現(xiàn)對擬南芥的轉(zhuǎn)化，從而抑制擬南芥中RabGDI3基因的表達(dá)量。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，上述目的可以通過提供用所述微生物(包含有pamiRNA1- Rab⑶13重組載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物來實(shí)現(xiàn)對花藥育性的調(diào)控，獲得雄性不育轉(zhuǎn)基因植株。
一種油菜BnRab⑶13基因的制備方法，其步驟是1、油菜花藥高效表達(dá)基因的克隆1.1油菜BnRab⑶13基因的引物序列根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)基因組測序資源，通過ORFFinder和BLAST軟件對所有已測資源序列進(jìn)行分析，確定BnRab⑶13序列。所以通過比對分析后，在已知的油菜序列中包含ORF的同源區(qū)域設(shè)計(jì)引物，從而確保擴(kuò)增產(chǎn)物為全長序列。引物為BnRab⑶I3S :5' -GTAAGATAGGAGGTGGTGG-3'和 BnRabOHSA = S' -CGTAAAACCACTCAGCCAA-3,。1. 2油菜BnRab⑶13基因的制備本發(fā)明所用油菜為甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)中雙九號(油料作物研究所 王新發(fā)副研究員提供，以下相同)。中雙九號播種于大田，正常田間管理。利用SDS裂解法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)提取基因組DNA。以此為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(

圖1)。步驟是提取基因組DNA25y 1，以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μ 1，分別添加IOXEx Taq buffer 5 μ 1，dNTP4 μ 1，5，弓丨物 1μ 1，3’引物 I μ I7ExTaq O. 5 μ 1，DNA 模版 I μ I 約 IOOng, ddH20 37. 5 μ I。根據(jù)油菜全基因組測序獲得的BnRab⑶13基因序列設(shè)計(jì)PCR所用引物為BnRab⑶13S和BnRab⑶13Α (前面已述)。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2064bp，PCR反應(yīng)程序?yàn)?40C 5分鐘，94°C I分鐘，60°C I分鐘，720C 2分鐘，33個(gè)循環(huán)，720C 10分鐘，16°C 3小時(shí)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0% (瓊脂糖凝膠/TE溶液質(zhì)量體積比，以下相同)瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技北京有限公司，以下相同)純化回收后，連接到PMD18-T載體(購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，熱激法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)轉(zhuǎn)化gold菌株的感受態(tài)細(xì)胞(購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，涂布于含有氨節(jié)青霉素50 μ g/mL (質(zhì)量體積比，以下相同)的LB固體培養(yǎng)基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859 X 104Pa下高壓消毒20分鐘。分裝到培養(yǎng)皿中，4°C冷藏備用，以下相同)平板上，37 °C培養(yǎng)過夜，挑選白斑6個(gè)。采用Ml3引物5 ' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3 '和 5 ' -CAGGAAACAGCTATGACC-3'，做菌落 PCR 檢測。菌落PCR具體方法(以下相同)是用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模版，反應(yīng)體系為IOyL內(nèi)含:10XTaq buffer (含 MgCl2)ly I,1. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5，引物(lOymol/L)0. 5μ 1，3，引物(10ymol/L)0. 5μ 1，Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 6· 5μ I。反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，94°C I分鐘，55°C I分鐘，72°C 2分鐘30秒，33個(gè)循環(huán)，72°C 10分鐘，擴(kuò)增大小為2744bp，1. 0%(前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確后。將PCR檢測大小正確的菌斑接種到含氨芐青霉素50 μ g/mL的液體LB培養(yǎng)基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升，121 °C，6. 859X 104Pa下高壓消毒20分鐘，以下相同)，37°C下200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，小量堿法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)提取質(zhì)粒，1. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA大小正確后(為2064bp)，采用Kpn I /Xba I酶(2種酶購自TaKaRa公司，以下相同)切對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(以下相同)，酶切體系(以下相同)為10 μ 1，包含質(zhì)粒 DNA5y 1，Kpn I 0. 5 μ 1，Xba I O. 5 μ 1，ddH20 4 μ 1，37°C過夜，1. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測。將檢測正確的陽性重組克隆命名為pMD18-BnRabOTI3 (將目的基因序列BnRab⑶13連入pMD18_T載體構(gòu)建而成，以下相同)，為了確保載體中啟動子的序列信息，將PMDlS-BnRab⑶13送上海英駿公司進(jìn)行測序，分析結(jié)果顯示，獲得了一種分離的油菜BnRab⑶13基因全長，其序列為SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。通過在線軟件Genescan(http://genes, mit. edu/GENSCAN. html)分析得到該基因的⑶S序列以及氨基酸序列。將基因的⑶S序列與擬南芥⑶S序列通過NCBI比對分析，發(fā)現(xiàn)該段區(qū)域中含有完整的ORF閱讀框及起始密碼子ATG。獲得了一種分離的油菜BnRabGDI3蛋白全長，其序列為SEQ ID N0:2所示氨基酸序列。對蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點(diǎn)進(jìn)行在線計(jì)算(http://us. expasyorg/tools/pi tool.htm)。BLAST 發(fā)現(xiàn) BnRabGDI3 與 AtRabGDI3CDS核苷酸同源性大于90%，利用DNA MAN以及在線軟件TCOFFEE (http://www. tcoffee.org/)它們的氨基酸同源性達(dá)到97%。結(jié)果表明所克隆的油菜Rab⑶13是AtRab⑶13的同·源基因，將其命名為BnRab⑶13。通過 GSDS (Gene Structure Display Server) (http: //gsds. cb1. pku. edu. cn/)分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)BnRab⑶13與AtRab⑶13基因結(jié)構(gòu)非常相似。該基因起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。含有12個(gè)外顯子，11個(gè)內(nèi)含子，每個(gè)內(nèi)含子、外顯子的大小、分布等都與AtRabGD13 相同。通過在線軟件 Genescan (http://genes. mit. edu/GENSCAN. html)分析得到該基因的⑶S序列以及氨基酸序列。BLAST發(fā)現(xiàn)與AtRab⑶13⑶S核苷酸同源性大于90%，AtRab⑶13和BnRab⑶13同源基因分別編碼了 445、436個(gè)氨基酸。應(yīng)用SOPMA預(yù)測發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因所編碼蛋白在二級結(jié)構(gòu)上非常保守，其α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲等組成比例極為相似。通過在線軟件 ProtScale(http://www. expasy. ch/tools/protscale.html)分析二者氨基酸的親疏水性的排布較一致，兩序列大部分的氨基酸在O軸線的下方，因此大部分的氨基酸屬于親水氨基酸。我們利用TMHMM在線軟件(http://www. cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)對2個(gè)Rab⑶13蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析。擬南芥和甘藍(lán)型油菜的蛋白序列的AAs值表明兩條序列沒有信號肽段，沒有明顯的跨膜區(qū)域，且兩個(gè)蛋白序列的N-1n值都較低，因此Rab⑶13不是一個(gè)膜蛋白。應(yīng)用PSORT程序(http://psort. hgc.jp/)對其進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明該蛋白可能存在于細(xì)胞質(zhì)中。軟件預(yù)測結(jié)果與GDI在Rab蛋白循環(huán)中的作用環(huán)境一致。因此BnRab⑶13和其他⑶I基因一樣在Rab蛋白調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著重要作用，具有控制囊泡運(yùn)輸?shù)墓δ堋１景l(fā)明通過構(gòu)建RabGDI3的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化擬南芥后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株由于RabGDI3的表達(dá)受到抑制而均出現(xiàn)了雄性不育的表型。說明RabGDI3具有控制擬南芥花藥發(fā)育和花粉育性的新功能。2、油菜BnRab⑶13基因的表達(dá)模式本發(fā)明所用另一種油菜為甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)顯性核不育雜合不育系JOSAI^Msmsrfrf^msmsrfrf )。系經(jīng)多年回交和姐妹交而育成。不育株命名為A,可育株命名為B，二者可視為一對近等基因系，僅存在不育位點(diǎn)差異(胡勝武，于澄宇，趙惠賢，路明，油菜顯性核不育材料Shaan — GMS純合兩型系803AB的選育。西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，ii (4)25 - 2)。供試材料播種于大田，正常田間管理。從同一大田生長條件相同的可育植株上取根、莖、葉、花蕾、角果，從花蕾中解剖分離雌蕊和雄蕊(花藥)，每種材料至少取三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)至少一株，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮中，-80°C保存。在大田分別從油菜可育植株和不育植株上取花蕾，帶回實(shí)驗(yàn)室后，在冰盒上分別挑取可育植株和不育植株花蕾中的雄蕊和雌蕊，每種材料至少取三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)至少一株，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮中，_80°C保存。提取RNA時(shí),在液氮中將植物樣品研磨至粉狀,利用Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，以下相同)的要求進(jìn)行RNA的提取。所提總RNA溶于無RNase的雙蒸水中。DNase I (購自Promega公司，以下相同)去除可能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650 BECKMAN，USA)分別檢測RNA在260納米和280納米光吸收值，結(jié)合1% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以獲得的RNA為模板，根據(jù)Promega公司逆轉(zhuǎn)錄酶的說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA分裝后于_80°C保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR儀為IQ5 (美國伯樂公司)，采用油菜Actin作為內(nèi)標(biāo)基因(登錄號 AF111812)，Actin 基因引物為 5 ' CTGGAATTGCTGACCGTATGAG3 '和5 ' ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG 3 '。根據(jù)擬南芥和油菜Rab⑶13基因CDS序列的保守區(qū)段設(shè)計(jì)的BnRab⑶13基因引物為5 ' -CCCCGACTACTATGGAGGAGAA-3 '和5' -AGCGTGTGGATTAGGGTTTGA-3'。
熒光定量PCR反應(yīng)每組實(shí)驗(yàn)均完成三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)至少做三次技術(shù)重復(fù)。分別檢測BnRab⑶13在油菜組織(根、莖、葉、花、角果，大、中、小花蕾，雄蕊、雌蕊)中的表達(dá)。用比較Ct法(Λ ACt)計(jì)算基因的相對表達(dá)量。通過2_Λ w估算目的基因的相對表達(dá)量和系統(tǒng)誤差(Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001, Analysis of RelativeGeneExpression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2_& &CT Method.METHODS 25，402 - 408.)。在計(jì)算相對表達(dá)量時(shí)，以根的樣本為參照，即將其值轉(zhuǎn)換成I (標(biāo)準(zhǔn)值)，其它樣品再與其比較，獲得相對表達(dá)值。3、Rab⑶13基因的功能驗(yàn)證3.1Rab⑶13基因人工微RNA干擾植物表達(dá)載體pamiRNAi_AtRab⑶13的構(gòu)建為了研究本發(fā)明中的花粉高效表達(dá)基因BnRab⑶13的功能，采用了 amiRNAi(artif icialmicroRNA interference,人工微RNA干擾，以下相同)技術(shù)。由于油菜BnRabGD13和擬南芥的RabGDI3具有相似的表達(dá)模式、基因結(jié)構(gòu)(李振波.油菜小孢子發(fā)育相關(guān)基因BnRabGDI3的功能研究.[碩士學(xué)位論文].湖北武漢中南民族大學(xué))以及90%以上的蛋白同源性，推測兩者具有相同的功能，因此油菜BnRabGDI3的功能是通過研究擬南芥AtRab⑶13的功能獲得的。人工微RNA干擾載體的構(gòu)建原理如圖3所示(SchwabR. ,Ossowski S. , Riester M. , et al. Highly specific gene silencing by artificialmicroRNAs in Arabidopsis. Plant Cell, 2006，18 (5) : 1121-1133)。選取的革巴序列為TTACACAGCACTCAAACGTGG，相應(yīng)的 Oligo DNA 為AATGTGTCGTGAGTTTGCACC。在此方法基礎(chǔ)上Yan等發(fā)明提出了一種快速高效的植物人工微RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法(Yan H.，DengX. , et al. A novel approach for the construction ofplant amiRNA expressionvectors. Journal of Biotechnology, 2011, 151:9_14),參照上述文獻(xiàn)報(bào)道方法完成了本實(shí)驗(yàn)中人工微RNA干擾載體pamiRNA1-AtRab⑶13的構(gòu)建。通過凍融法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)將含有上述獲得的pamiRNA1-AtRabGDI3載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 (購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)步驟如下
1:取O. 2ml感受態(tài)農(nóng)桿菌，于冰中緩慢融化。2 :加入約2 μ g重組質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰浴30min后，投入液氮速凍lmin，然后37°C水浴5min，融化細(xì)胞。3 :加入800 μ I不含抗生素LB液體培養(yǎng)基(前面已述)，28°C輕搖培養(yǎng)4_5h。4:12000rpm，30s，去上清，細(xì)胞重懸于O. 2ml LB液體培養(yǎng)基(前面已述)培養(yǎng)基。5 :將培養(yǎng)物均勻涂布在含Rif (50mg/L)和Str (50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基(前面已述)瓊脂板上，28°C培養(yǎng)2天，待平板上出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子 后挑菌，以BarF:5' -TTTCGGTGACGGGCAGGAC-3'和 BarR:5' -CTGCACCATCGTCAACCAC-3'為引物進(jìn)行菌落PCR檢測。檢測方法如下是用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模板，反應(yīng)體系為10 μ I 內(nèi)含模板 DNA 模板 I μ L(約 IOOng)，IOXTaq buffer (含 MgCl 2)1 μ I,1. 5mmol/L dNTP (IOmmoI/L) I μ 1，5，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，3，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ l，Taq(5U/μ 1)0. 5μ l，ddH20 5· 5μ I。反應(yīng)條件為 94°C 5 分鐘，94°C 30 秒，55。。80 秒，72。。I 分鐘，32個(gè)循環(huán)，72°C 10分鐘，擴(kuò)增大小為1028bp。將pamiRNA1-AtRab⑶13轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105 (前面已述)，用利福平(50μ g/mL)抗性平板篩選，挑取菌斑，菌落PCR檢測驗(yàn)證(前面已述)。3. 2amiRNAi植物表達(dá)載體pamiRNA1-AtRab⑶13在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選采用花序侵染法(Zhang X. R. et al.Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsisthaliana using the floral dip method. Nature, 2006,1:1-6,以下相同)進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化。制備含有重組載體pamiRNA1-AtRab⑶13的根癌農(nóng)桿菌EHA105 (前面已述)菌液，在轉(zhuǎn)化前一天轉(zhuǎn)入含有利福平50 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基((前面已述)中，28 °C過夜培養(yǎng)。第二天，用紫外分光光度計(jì)(SPEK0L 1300)于276nm納米波長下檢測菌液的吸光值，當(dāng)菌液的吸光值達(dá)到在1. 6-2. O之間時(shí)取出。室溫(20-25°C，以下相同)以4000g離心IOmin,棄上清，沉淀懸浮于等體積的5%蔗糖溶液(蔗糖與蒸餾水的質(zhì)量體積比，以下相同)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)化前加入終濃度為0. 02% (體積比)的Silwet1-77 (購自北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心，以下相同)?；靹蚝蟀汛D(zhuǎn)化的擬南芥整個(gè)花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數(shù)15秒，取出植株。轉(zhuǎn)化后的植株用一個(gè)黑色塑料袋包好，放在生長箱培養(yǎng)。第二天將塑料袋揭開，放在光強(qiáng)的地方培養(yǎng)。隔一周再做一次轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)一個(gè)月左右收獲種子，種子在培養(yǎng)箱或者日光下干燥3-5天。將轉(zhuǎn)化收獲的TO代種子播在混有PNS營養(yǎng)液的蛭石中，(PNS營養(yǎng)液成份為每升含 5ml IM KN03，2ml IM Ca (N03) 2 . 4H20, 2ml IM MgS04 . 7Η20，2· 5ml 20mMFe. EDTA, 2. 5ml IM磷酸緩沖液(pH5. 5)，Iml MS微量元素)。轉(zhuǎn)移到溫度20-25 °C，光照強(qiáng)度5000-10000流明，光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，空氣濕度大于80%以上的培養(yǎng)間中，正常管理。根據(jù)表達(dá)載體上特有的草胺磷(Bar)抗性篩選陽性植株。擬南芥長出一片真葉后，噴灑30ppm的除草劑Basta (購自拜爾公司)。一星期后，噴灑50ppm的Basta，獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性苗。篩選得到的轉(zhuǎn)化植株，稱Tl代轉(zhuǎn)化植株(以下相同)。葉片長到足夠大小時(shí)(3-4葉期)，取少許綠苗葉片，提取DNA (前面已述)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化材料的PCR陽性檢測(以下相同)。引物序列為BarF: 5 ' -TTTCGGTGACGGGCAGGAC-3 '和BarR: 5 ' -CTGCACCATCGTCAACCAC-3 '，反應(yīng)體系為 10 μ I 內(nèi)含模板 DNA 模板 I μ L (約IOOng)，IOXTaq buffer (含 MgCl 2) I μ 1，1. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’ 弓丨物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，3，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 5· 5μ I。反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，94°C 30秒，55°C 80秒，72°C I分鐘，32個(gè)循環(huán)，72°C 10分鐘，擴(kuò)增大小為1028bp。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(前面已述)，結(jié)果表明，Rab⑶13基因人工微RNA干擾植物表達(dá)載體PamiRNA1-AtRab⑶13已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入擬南芥。共獲得了 11株轉(zhuǎn)基因陽性植株(含有檢測目的片段的植株稱陽性植株，以下相同，圖4)，分別命名為ΜΙ-1，ΜΙ-2等(以下相同)。3. 3人工微RNA干擾載體pamiRNA1-AtRab⑶13轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察經(jīng)過除草劑篩選和PCR檢測后獲得的轉(zhuǎn)基因陽性植株在生長間中正常管理并觀察其表型。在開花期，選取各個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的分支頂端已經(jīng)漏白但未開放的花朵，撥開花蕾。在放大鏡(3倍)以及體視顯微鏡(OLYMPUS SZ61TRC)下觀察花藥以及花粉。用解剖針分離出花藥，參照亞歷山大染色法(Alexander, M. P. Differential staining of abortedandnon-aborted pollen. Stain Technol,, 44:117-122. , 1969,以下相同)，40 °C 水浴加 熱亞歷山大染色液(以配制大約100毫升染色液為例乙醇10ml，1%的孔雀石綠酒精溶液lml，蒸餾水50ml，甘油25ml，1%的酸性品紅水溶液5ml，1%的橙黃G水溶液0. 5ml，冰醋酸
l-4ml，苯酚5克，水合氯醛5克，以下相同)并浸泡花藥過夜(10-15小時(shí))，用壓片法在顯微鏡(OLYMPUS 1X71)下觀察小孢子。通過觀察并統(tǒng)計(jì)正常小孢子(染成桔紅色)和敗育小孢子(染成綠色)的比例判斷小孢子的敗育程度。結(jié)實(shí)期用肉眼觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥的結(jié)實(shí)情況。染色觀察結(jié)果顯示野生型擬南芥的花藥飽滿并且充滿了小孢子，小孢子均染成橘紅色，說明小孢子發(fā)育正常。而轉(zhuǎn)基因擬南芥的花藥中小孢子數(shù)目都遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于野生型，有少量正常的小孢子數(shù)目，其它均為空癟或被染成綠色的敗育的小孢子(圖5)。經(jīng)過對所有轉(zhuǎn)基因后代植株進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示大部分轉(zhuǎn)基因后代擬南芥均出現(xiàn)了雄性不育表型，說明AtRabGDI3干擾轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)了典型的雄性不育表型。4、BnRab⑶13基因的互補(bǔ)功能驗(yàn)證4.1BnRab⑶13基因過表達(dá)植物表達(dá)載體OX-BnRab⑶13的構(gòu)建和根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105的轉(zhuǎn)化。為了進(jìn)一步證實(shí)油菜BnRab⑶13基因和擬南芥AtRab⑶13基因具有相同的功能，我們構(gòu)建BnRab⑶13基因過表達(dá)植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。用獲得的OX-BnRab⑶13轉(zhuǎn)基因后代為父本，以人工微RNA干擾的pamiRNA1-AtRabGDI3雄性不育轉(zhuǎn)基因后代為母本進(jìn)行雜交，檢測雜交后代植株的花藥育性是否能夠得到恢復(fù)。過表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下油菜花期，在田間收集油菜花蕾，投入液氮速凍。按照Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，前面已述)的要求提取中雙九號(前面已述)花蕾的RNA,以獲得的RNA為模板，根據(jù)Promega公司逆轉(zhuǎn)錄酶的說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(前面已述)，得到的cDNA分裝后于_80°C保存?zhèn)溆?。以獲得的花蕾cDNA為模板進(jìn)行BnRab⑶13基因⑶NA片段的PCR擴(kuò)增。根據(jù)甘藍(lán)型油菜BnPABP5基因序列(SEQ ID NO:1)設(shè)計(jì)引物，Rab⑶I3F:GACGAGCTCTCACTCCGTTGAGGAGGG和 Rab⑶I3R:GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC。引物序列的 5'末端分別引AT XbalI和SacI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為25 μ L內(nèi)含:1 XPCR buffer, MgCI1.5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L (毫摩爾每升)、引物濃度為0. 5mol/L,Pfu酶1. 5單位,模板約100ng。PCR 反應(yīng)程序如下-MV 5min ；94°C 30sec, 55°C 45sec, 72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72° C延伸8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測(前面已述)。完成后用凝膠回收試劑盒回收純化目的片段(前面已述)，獲得BnRab⑶13基因⑶NA全長序列。用獲得的BnRab⑶13基因⑶NA全長序列替換pBI121植物表達(dá)載體中的⑶S基因序列，獲得BnRab⑶13基因的植物過表達(dá)載體。為完成此目的，首先用Xba I/SacI雙酶切(2種酶購自TaKaRa公司)BnRab⑶13基因 CDNA 片段，同時(shí)用 Xba I/SacI 酶切 pBI121 (Chen, P. Y. , Wang, C. K.，Soong, S. C. To, Κ.Y. Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloningT-DNAinsertion from transgenic plants. Mol. Breed. 11，287-293)質(zhì)粒的 GUS 片段。酶切體系為10 μ I (前面已述)，酶切反應(yīng)在37度培養(yǎng)箱中進(jìn)行，約4-6個(gè)小時(shí)之后，用1% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖膠電泳檢測。 將BnRab⑶13基因⑶NA片段的酶切產(chǎn)物和克隆載體ρΒΙ121上切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按BnRab⑶13基因⑶NA片段的酶切產(chǎn)物比ρΒΙ121載體片段(150ng BnRab⑶13基因⑶NA片段50ng載體片段)=3:1的比例(摩爾濃度t匕)混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，10 X反應(yīng)緩沖液，無菌水補(bǔ)充體積至20 μ L，16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化后，在含有卡那霉素(50 μ g/mL)固體LB平板上篩選，挑斑后以NPT II F 5' -GATGGATTGCACGCAGGT-3'和 NPT II R 5/ -TCAGAAGAACTCGTCAAG-3 '引物進(jìn)行菌落PCR檢測。菌落PCR具體方法(以下相同)是用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模版，反應(yīng)體系為 IOyL 內(nèi)含10XTaq buffer (含 MgCl 2) I μ I,1. 5mmol/L dNTP (I Ommo I/L) I μ 1，5，弓 I物(10 μ mol/L) 0. 5 μ 1，3，引物(10 μ mol/L) 0. 5 μ 1，Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 6· 5μ I。反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，94°C I分鐘，55°C 30秒，72°C 2分鐘30秒，33個(gè)循環(huán)，72 °C 10分鐘，擴(kuò)增大小為800bp，1. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確后。以BarF和BarR(前面已述)為引物進(jìn)行做菌落PCR (前面已述)，選擇陽性菌株提質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為OX-BnRab⑶13。然后利用凍融法(前面已述)將OX-BnRab⑶13轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105 (前面已述),卡那霉素(50 μ g/mL)和利福平(50 μ g/mL)雙抗性平板篩選,挑斑,進(jìn)行菌落PCR檢測驗(yàn)證(前面已述)。4. 20X_BnRab⑶13在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選采用花序侵染法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化(前面已述)。在轉(zhuǎn)化擬南芥前一天，將制備含有載體OX-BnRab⑶13的根癌農(nóng)桿菌EHA105 (前面已述)菌液轉(zhuǎn)入含有卡那霉素50 μ g/ml、利福平50μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基中，28°C過夜培養(yǎng)。第二天，用紫外分光光度計(jì)(SPEK0L1300)于276納米波長下檢測吸光值，當(dāng)菌液的吸光值在1.6-2. O之間時(shí)取出。室溫(20-25°C,以下相同)以4000g離心IOmin,棄上清,沉淀懸浮于等體積的5%(質(zhì)量體積比)鹿糖中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)化前加入終濃度為0. 02%(體積比)的Silwet
1-77 (購自北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心，以下相同)。混勻后把待轉(zhuǎn)化的擬南芥整個(gè)花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數(shù)15秒，取出植株。轉(zhuǎn)化后的植株用一個(gè)黑色塑料袋包好，放在生長箱培養(yǎng)。第二天將塑料袋揭開，放在光強(qiáng)的地方培養(yǎng)。隔一周再做一次轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)一個(gè)月左右收獲種子，種子在培養(yǎng)箱或者日光下干燥3-5天。將轉(zhuǎn)化收獲的TO代種子用70%(體積比)酒精和0. 01% (體積比)的升汞表面消毒10分鐘后用蒸餾水洗滌數(shù)次(5 7次)，然后均勻地吹打到MS固體篩選培養(yǎng)基(MS大量元素母液100ml ;MS微量元素母液10ml ;MS有機(jī)母液10ml ；MS鐵鹽IOml ;肌醇IOml ;蔗糖30g ;用IM NaOH調(diào)PH至5. 8，12g瓊脂粉，定容至1L，高壓121度滅菌后備用。加入Sg瓊脂粉可配置成固體培養(yǎng)基。各種母液配方見表I)表面。4°C春化4-6天，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)表達(dá)載體上所特有的卡那霉素抗性篩選陽性苗。葉片長到足夠大小時(shí)(3-4葉期)，取少許綠苗葉片進(jìn)行PCR陽性檢測，引物為NPT II F 和NPT II R(前面已述)，反應(yīng)體系為10 μ I。內(nèi)含:模板DNA I μ L (約IOOng)，10 X Taqbuffer(含 MgCl 2) I μ 1，1. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’ 引物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，3’ 引物(10 μ mol/L)O. 5 μ l,Taq(5U/y 1)0. 5 μ l,ddH20 5· 5μ I。反應(yīng)條件為 94°C 5 分鐘，94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，32個(gè)循環(huán)，72°C 10分鐘，擴(kuò)增大小為800bp。結(jié)果表明(圖7)獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株(含有檢測目的片段的植株稱陽性植株，以下相同)。將陽性植株自交3代以上，獲得8個(gè)純合T3代株系。分別命名為OX-1，0X-7等(以下相同)。表IMS培養(yǎng)基母液配方
權(quán)利要求
1.一種分離的基因，其序列為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的一種分離的基因在控制擬南芥花粉育性中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的一種分離的多肽在控制擬南芥花粉育性中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的一種分離的基因在控制油菜花粉育性中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的一種分離的多肽在控制油菜花粉育性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種油菜BnRabGDI3基因及其應(yīng)用，一種分離的基因，其序列為SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示。RabGDI3是一種GDP解離抑制劑，是RabGDP/RabGTP轉(zhuǎn)化過程所需的調(diào)控因子之一，在Rab蛋白調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著重要作用。BnRabGDI3在油菜花藥和小孢子中呈顯著的優(yōu)勢表達(dá)。干擾擬南芥AtRabGDI3基因的表達(dá)能夠使其小孢子敗育。利用過表達(dá)BnRabGDI3的轉(zhuǎn)基因擬南芥作為父本，和干擾RabGDI3基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥授粉，雜交后代植株的花藥和花粉育性得到恢復(fù)。這一互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)油菜BnRabGDI3和擬南芥AtRabGDI3具有相同的功能控制油菜、擬南芥花藥發(fā)育以及花粉育性。通過基因工程技術(shù)調(diào)控RabGDI3的表達(dá)水平可以控制花粉的育性，創(chuàng)造雄性不育系材料和恢復(fù)系材料，可用于雄配子發(fā)育研究及農(nóng)作物品質(zhì)改良。
文檔編號C12N15/29GK103014018SQ20121049454
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者劉勝毅, 董彩華, 黃軍艷, 李振波, 童超波, 劉越英, 程曉輝 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所