專利名稱:轉(zhuǎn)基因油菜ms1品系pcr-dhplc檢測引物及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本申請涉及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測,特別是涉及一種轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測弓I物及檢測方法。
背景技術(shù):
目前對轉(zhuǎn)基因油菜的檢測方法主要采用常規(guī)PCR,實時熒光PCR、PCR_基因芯片等檢測方法。傳統(tǒng)的常規(guī)PCR檢測方法在平臺擴展方面具有一定的局限性,隨著待檢目標(biāo)的增加,需要對體系中的每套引物的用量及比例重新進行優(yōu)化,并且兼顧擴增效率等因素,工作量較大;另一方面,通常采用的凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物的方法,區(qū)分效率不高,檢測結(jié)果不理想。實時熒光PCR雖然在檢測靈敏度等方面較多重常規(guī)PCR檢測方法有優(yōu)勢,但是由于目前儀器自身及熒光染料研制的限制,僅能同時提供互不干擾的4個熒光通道,也限制了該技術(shù)在檢測通量擴展 ,并且檢測成本高。常規(guī)的多套PCR-基因芯片檢測方法,需要多套引物進行擴增,操作步驟繁瑣,并不適合大規(guī)模的高通量檢測。變性高效液相色譜技術(shù)(Denaturing High-performance Liquid Chromatography,DHPLC)是一種簡單、快速、非凝膠的核酸分析方法,具有分辨率好、擴展性強、靈敏度高等優(yōu)點。該方法在50°C條件分析樣品,樣品峰的洗脫只由堿基對的數(shù)量決定,樣品的堿基對數(shù)量不同洗脫順序也不同,從而產(chǎn)生不同的樣品峰。具體的,當(dāng)過柱的乙腈濃度提高,核酸片段會根據(jù)分子量從小到大的順序被洗脫出來。通過得到的洗脫峰與DNA marker比較確定分子量大小,從而判定樣品中是否含有目標(biāo)檢測基因。PCR-DHPLC,是將PCR與DHPLC相結(jié)合的技術(shù),即先采用PCR擴增出靶標(biāo)序列,然后再對擴增產(chǎn)物進行DHPLC分析,從而提高檢測的靈敏度和特異性。目前,尚沒有轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC的檢測方法。
發(fā)明內(nèi)容
本申請的目的是提供一種新的用于轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測的引物,基于該引物的轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測方法。為實現(xiàn)上述目的,本申請采用了以下技術(shù)方案:本申請公開了一種用于轉(zhuǎn)基因油菜MSI品系的PCR-DHPLC檢測的引物,該引物的上游引物含有Seq ID N0.1所示序列,下游引物含有Seq ID N0.2所示序列;Seq ID N0.1:5,-GAATTTGGCCTGTAGACCTCAAT-3,Seq ID N0.2:5,-ATGGTGAAACCGGTGTTAAAGAG-3,。需要說明的是,本申請的引物是針對轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系而設(shè)計的特異性引物,能夠?qū)D(zhuǎn)基因油菜MSl品系進行特異性擴增,因此,可以理解,該引物除了用于本申請的PCR-DHPLC檢測以外,同樣適用于常規(guī)的PCR檢測,以及其它的基于PCR擴增的檢測,如實時熒光PCR、基因芯片等等。本申請的另一面還公開了一種轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測方法,該檢測方法包括采用本申請設(shè)計的引物,以待檢測樣品的DNA為模板進行PCR擴增,對PCR擴增的產(chǎn)物進行變性高效液相色譜分析。需要說明的是,本申請設(shè)計的引物是針對轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的特異性引物,因此,可以理解,如果待檢測樣品中含有足量的轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系成分,即可擴增出相應(yīng)的靶標(biāo)片段,并在DHPLC分析時產(chǎn)生相應(yīng)的洗脫峰。進一步的,本申請的檢測方法還包括以DNA marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進行變性高效液相色譜分析,將PCR擴增產(chǎn)物的變性高效液相色譜分析結(jié)果與DNA marker的變性高效液相色譜分析結(jié)果進行比對。優(yōu)選的本申請的檢測方法包括如下步驟:(A)采用本申請的引物,以待檢測樣品的DNA為模板,進行PCR擴增;(B)以步驟(A)的PCR擴增產(chǎn)物為樣品進行DHPLC分析,同時以DNAmarker為參考標(biāo)準(zhǔn)進行DHPLC分析;(C)將步驟(B)中PCR擴增產(chǎn)物的DHPLC分析結(jié)果與DNA marker的DHPLC分析結(jié)果進行比較,確定PCR擴增產(chǎn)物的分子量大小,從而判斷是否含有檢測的靶標(biāo)序列。需要說明的是,理論上,本申請的引物是根據(jù)轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系設(shè)計的特異性引物,能夠?qū)Υ龣z測樣品中的轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系成分擴增出約307bp的片段,因此,能夠通過DHPLC分析出307bp的洗脫峰;而對其它成分不會有擴增,即不會有其它洗脫峰出現(xiàn)。本申請中,判斷是否含有轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的靶標(biāo)序列的依據(jù)即,是否有307bp的洗脫峰。由于采用以上技術(shù)方案,本申請的有益效果在于:本申請的轉(zhuǎn)基因油菜 MSl品系檢測引物具有較強的特異性,能夠用于后續(xù)的多重PCR擴增以及DHPLC分析。本申請針對傳統(tǒng)的電泳分析PCR擴增結(jié)果不理想的問題,將PCR與DHPLC相結(jié)合,提供了一種操作簡便、擴展性能好、分辨率高的轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系檢測方法。利用DHPLC對PCR擴增產(chǎn)物進行分析,對不同大小的PCR產(chǎn)物片段區(qū)分率可達數(shù)個堿基,甚至能夠區(qū)分出I個堿基大小差異的片段。本申請的引物和檢測方法為轉(zhuǎn)基因油菜MSI品系的檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測方法,特別適合用于口岸檢驗檢疫等部門使用。
圖1:是本申請實施例中PCR擴增產(chǎn)物的DHPLC分析的部分結(jié)果圖;圖2:是本申請實施例中PCR擴增產(chǎn)物的DHPLC分析的部分結(jié)果圖;圖3:是本申請實施例中PCR擴增產(chǎn)物的DHPLC分析的部分結(jié)果圖;圖4:是本申請實施例中PCR擴增產(chǎn)物的DHPLC分析的部分結(jié)果圖;圖1中自上而下的曲線分別代表al為轉(zhuǎn)基因油菜品系MS1、bl為DNAmarker、Cl水對照、dl為轉(zhuǎn)基因油菜品系RF1、el為轉(zhuǎn)基因油菜品系RF2、fl為轉(zhuǎn)基因油菜品系RF3、gl為轉(zhuǎn)基因油菜品系RT73、hl為轉(zhuǎn)基因油菜品系MS8,圖2中自上而下的曲線分別代表a2為轉(zhuǎn)基因油菜品系T45、b2為轉(zhuǎn)基因油菜品系Topasl9/2、C2為非轉(zhuǎn)基因油菜、d2為轉(zhuǎn)基因玉米品系3272、e2為轉(zhuǎn)基因玉米品系59122、f2為轉(zhuǎn)基因玉米品系Btll、g2為轉(zhuǎn)基因玉米品系Btl76、h2為轉(zhuǎn)基因玉米品系GA21、i2為轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604、J2為轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810、k2為轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N863,圖3中自上而下的曲線分別代表a3為轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N88017、b3為轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034、c3為轉(zhuǎn)基因玉米品系NK603、d3為轉(zhuǎn)基因玉米品系TC1507、e3為轉(zhuǎn)基因玉米品系T25、f3為非轉(zhuǎn)基因玉米、g3為非轉(zhuǎn)基因玉米、h3為轉(zhuǎn)基因大豆品系A(chǔ)2704-12、 3為轉(zhuǎn)基因大豆品系A(chǔ)5547-127、J3為轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2、k3為轉(zhuǎn)基因大豆品系M0N89788,圖4中自上而下的曲線分別代表a4為非轉(zhuǎn)基因大豆、b4為大豆盲樣、c4為轉(zhuǎn)基因棉花品系GHB614、d4為轉(zhuǎn)基因棉花品系LLCotton25、e4為非轉(zhuǎn)基因棉花、f4為轉(zhuǎn)基因水稻品系LL Rice62、g4為非轉(zhuǎn)基因水稻、h4為轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系EH92-527-1、 4為木瓜。marker的各峰值從左至右依次為80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。
具體實施方式
本申請?zhí)峁┝擞糜谵D(zhuǎn)基因油菜MS I品系的PCR-DHPLC檢測的引物,該引物針對轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的特異序列進行設(shè)計,能夠用于轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的特異性擴增檢測。在此基礎(chǔ)上本申請還提供了基于本申請的引物的轉(zhuǎn)基因油菜MSI品系的PCR-DHPLC檢測方法。
需要說明的是,本申請的引物是針對轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測而設(shè)計的,但是,可以理解,該引物本身也是作為PCR擴增使用的,因此,同樣可以用于常規(guī)的PCR擴增、實時熒光PCR擴增、與基因芯片結(jié)合的PCR擴增等。
下面通過具體實驗例并結(jié)合附圖對本申請作進一步詳細說明。以下實驗例僅僅對本申請進行進一步的說明,不應(yīng)理解為對本申請的限制。
實施例1DNA提取
(I)DNA提取:參照植物基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN, Cat.N0.69104)所提供的方法稍作改進提取DNA,具體操作步驟如下:
①65°C 預(yù)熱的 APl 溶液和 Buffer AE ;
②液氮研磨樣品至粉末狀后,取適量樣品入1.5mL的離心管中;
③向離心管中加入400 μ L預(yù)熱的APl溶液和4 μ L100mg/mL的RNA酶,充分混勻后,65°C水浴10min-15min,期間振蕩混勻2-3次;
④水浴完成后,直接加入130 μ L ΑΡ2溶液,充分振蕩混勻后冰浴5min冰浴時不可震蕩,然后14000r/min離心5min ;
⑤吸取上清加入到QIA shredder Mini spin column柱子中,即試劑盒中的紫色柱子,14000rpm/min離心2min,記錄吸取的上清液的體積數(shù);
⑥棄上面的柱子,向過濾后的溶液中加入1.5倍體積的Buffer AP3/E溶液,用移液槍輕輕混勻;
⑦每次取650 μ L步驟⑥的混勻的溶液轉(zhuǎn)移到DNeasy Mini spin column柱子內(nèi),即試劑盒中白色的柱子,14000rpm/min離心Imin,棄濾液,直至步驟⑥的混勻的溶液完全過濾完;需要說明的是,進行過濾時DNeasy Mini spin column柱所能容納的體積約為650 μ L,而步驟⑥的溶液一般都是大于650 μ L的,因此,每次只能取650 μ L溶液,過濾、棄濾液后才能再加入剩余的溶液;
⑧棄下面的收集管,將spin column柱放入一個新的2mL收集管中,加入500 μ LBuffer Aff溶液,14000rpm/min 離心Imin洗脫雜質(zhì),重復(fù)洗脫雜質(zhì)的操作一次,棄濾液,12000rpm/min 空管離心 lmin ;⑨棄下面的收集管,換一新的1.5mL離心管,加入100 μ L預(yù)熱后的Buffer AE溶解DNA,室溫靜置5min沉淀DNA,12000rpm/min離心lmin,收集的溶液即DNA溶液;需要說明的是100 μ L預(yù)熱后的Buffer AE可以分兩次或多次加入;⑩棄上面的柱子,_20°C保存DNA溶液。(2)DNA純化:當(dāng)DNA中含蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的量較高時,其純度不能滿足實驗要求,需要對其進行純化,具體純化步驟如下:①將提取的DNA溶液稀釋到500 μ L-700 μ L后,加入等體積的酚和氯仿,充分混勻;②14000rpm/min 離心 IOmin,取上清液;③在上清液中加入0.6倍體積的異丙醇,-20°C靜置30min以上;④在4°C條件下14000rpm/min離心lOmin,棄上清;⑤向步驟④中棄上清液的沉淀中加入lmL4°C預(yù)冷的70%的乙醇,14000rpm/min離心lOmin,棄上清,重復(fù)操作一次;⑥將經(jīng)過步驟⑤的乙醇洗滌的沉淀在無菌條件下風(fēng)干,加適量AE Buffer溶解DNA,即獲得純度較高的DNA溶液。需要說明的是,AE Buffer的加入量根據(jù)具體實驗要求而定,如果希望獲得DNA溶液的濃度較高,則可以加入較少量的AE Buffer,如10 μ L-50 μ L,也可以直接再加入IOOyL Buffer AE,則DNA濃度與純化前相當(dāng),或者加入更多量的BufferAE以獲得較低濃度的DNA溶液。實施例2DNA濃度測定對提取的樣品DNA進行濃度和純度測定;采用紫外分光光度計測定260nm和280nm處吸收值,分別計算核酸的純度和濃度,計算公式如下:DNA 純度=0D260/0D280DNA 濃度=5O X 0D260mg/mLDNA的純度比值在1.7 L 9之間,濃度大于IOng/μ L。實施例3PCR擴增根據(jù)轉(zhuǎn)基因油菜MSI品系的DNA序列設(shè)計引物(表I ),并提取以下樣品的DNA進行特異性檢測:轉(zhuǎn)基因油菜品系MS1、轉(zhuǎn)基因油菜品系RF1、轉(zhuǎn)基因油菜品系RF2、轉(zhuǎn)基因油菜品系RF3、轉(zhuǎn)基因油菜品系RT73、轉(zhuǎn)基因油菜品系MS8、轉(zhuǎn)基因油菜品系T45、轉(zhuǎn)基因油菜品系Topasl9/2、非轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因玉米品系3272、轉(zhuǎn)基因玉米品系59122、轉(zhuǎn)基因玉米品系Btll、轉(zhuǎn)基因玉米品系Btl76、轉(zhuǎn)基因玉米品系GA21、轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604、轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810、轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N863、轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N88017、轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系NK603、轉(zhuǎn)基因玉米品系TC1507、轉(zhuǎn)基因玉米品系T25、非轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆品系A(chǔ)2704-12、轉(zhuǎn)基因大豆品系A(chǔ)5547-127、轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2、 轉(zhuǎn)基因大豆品系M0N89788、非轉(zhuǎn)基因大豆、大豆盲樣、轉(zhuǎn)基因棉花品系GHB614、轉(zhuǎn)基因棉花品系LLCotton25、非轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因水稻品系LL Rice62、非轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系EH92-527-1、木瓜。表I轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的檢測引物
權(quán)利要求
1.一種用于轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測的引物,其特征在于:所述引物包括上游引物和下游引物,所述上游引物含有Seq ID N0.1所示序列,所述下游引物含有SeqID N0.2所示序列;Seq ID N0.1:5’ -GAATTTGGCCTGTAGACCTCAAT-3’Seq ID N0.2:5,-ATGGTGAAACCGGTGTTAAAGAG-3,。
2.—種轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測方法,其特征在于:所述檢測方法包括采用權(quán)利要求1中的引物,以待檢測樣品的DNA為模板進行PCR擴增,對PCR擴增的產(chǎn)物進行變性高效液相色譜分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法,其特征在于:所述檢測方法還包括以DNAmarker為參考標(biāo)準(zhǔn)進行變性高效液相色譜分析,將PCR擴增產(chǎn)物的變性高效液相色譜分析結(jié)果與DNA marker的變性高效液 相色譜分析結(jié)果進行比對。
全文摘要
本申請公開了一種轉(zhuǎn)基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法,該引物具有較強的特異性,能夠用于PCR,并特異性的擴增出轉(zhuǎn)基因油菜MS1品系的DNA片段,并且其擴增產(chǎn)物能夠適合于后續(xù)的DHPLC分析。該檢測方法提供了一種操作簡便、擴展性能好、特異性強的轉(zhuǎn)基因油菜MS1品系的檢測方法。利用DHPLC對PCR擴增產(chǎn)物進行分析,其片段大小區(qū)分率可達數(shù)個堿基,分辨率高。本申請的引物和檢測方法為轉(zhuǎn)基因油菜MS1品系的檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測方法,特別適合用于口岸檢驗檢疫等部門使用。
文檔編號G01N30/02GK103173551SQ20131007939
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者向才玉, 章桂明, 潘廣, 凌杏園 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心