專利名稱：油菜BnPAB5基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種控制油菜和擬南芥花粉育性的PAB5基因，同時還涉及一種控制植物花粉育性的PAB5基因的制備方法，還涉及一種控制植物花粉育性的PAB5基因的用途。本發(fā)明還涉及含有該基因或其同源核苷酸序列的載體和涉及利用該基因在油菜基因工程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大多數(shù)真核生物成熟mRNA分子都有一段poly (A)尾巴，它與mRNA的穩(wěn)定性及翻譯的起始調(diào)節(jié)有關(guān)。Poly (A)結(jié)合蛋白(poly(A)binding protein, PAB)廣泛存在于真核生物不同類型的細(xì)胞中，與25bp或更長的poly (A)有很強(qiáng)的親和力(Sachs AB，Davis R W and Kornberg R. D. A single domain of yeast poly(A)-binding proteinis necessary and suffi·cient for RNA binding and cell viability. Mol CellBiol.，1987，7(9) :3268-3276. )。PAB蛋白可以和最短包括12個腺嘌呤的聚合體結(jié)合，形成一個復(fù)合體，該復(fù)合體最多可以覆蓋27個腺_呤片段(Baer W，Kornberg D. Repeatingstructure of cytoplasmic poly (A)-ribonucleoprotein.Proc Natl Acad Sci USA1980, 77:1890-1892. )，PAB 蛋白主要是通過三級結(jié)構(gòu)中的 RRM (RNA recognition motif)來識別 Poly (A)序列(Burd G, Dreyfuss G. Conserved structures and diversity offunctions of RNA-binding proteins.Sciencel994,265:615-621.)。目前對細(xì)胞核PAB蛋白的研究比細(xì)胞質(zhì)PAB蛋白研究要落后，主要是因?yàn)樗鼈兊木w和NMR (nuclear magnetic resonance)結(jié)構(gòu)還沒有確定。盡管如此，目前已有研究確定在其N末端有一個RRM結(jié)構(gòu)域，在C末端有一個富含精氨酸的結(jié)構(gòu)域(Wahle E，Ruegse gger U: 3-end processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMSMicrobiol Revl999，23:277-295.)。酵母的存活必須有細(xì)胞核PAB的存在，它由基因 NAP2 編碼(David A Mangus, Ma tthew C Evans,Allan Jacobson. Poly (A)-bindingproteins!multifunctional scaffolds for the posttranscriptional control of geneexpression Genome Biol.2003;4 (7):223.)。PAB蛋白在基因表達(dá)過程中起著重要的作用。作為順式作用因子結(jié)合在新合成或者成熟的mRNA上，在轉(zhuǎn)錄本的多腺嘌呤化、運(yùn)輸、翻譯的起始等過程起著特殊的作用。它通過與poly (A)尾巴的結(jié)合至少在以下三個方面調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工mRNA的生物合成，mRNA降解和蛋白質(zhì)合成的起始(Dmitry A. Belostotsky. UnexpectedComplexity of Poly (A)-Binding Protein Gene Families in Flowering Plants:ThreeConserved Lineages Th at Are at Least200Million Years Old and Possible Auto—andCross-RegulationGenetics. 163 (I) :311 - 319) 0 對 Poly (A)結(jié)合蛋白的研究表明它們都存在四個串聯(lián)的RNA識別結(jié)構(gòu)域(RNA recognition motif，RRM)。盡管這四個RRM存在差異，但其二維結(jié)構(gòu)相似，都包含能夠識別并結(jié)合Poly (A)的01-a1-0 2_ 3_ a 2_ 3 4結(jié)構(gòu)(Dreyfuss G，M J Mat unis, S Pinol-Roma，and C G Burd. hnRNP Proteins and theBiogenesis of mRNA. Annual Review of Biochemistry. 1993，62:289-321.)。對PAB基因的研究主要集中在酵母和動物中，它們的一級結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)都具有保守性，而對高等植物的研究較少。在酵母細(xì)胞中PAB基因的缺失突變體是致死型的，這表明該基因在生命過程中起著重要的作用，而擬南芥PAB5基因是花藥特異性表達(dá)的，并且它可以互補(bǔ)酵母的缺失突變體，恢復(fù)酵母細(xì)胞的活性(Belostotsky D A, Meagher R B. A pollen-, ovule-, and earlyembryo-specific poly (A)binding protein from Arabidopsis complements essentialfunctions in yeast. Plant Cell, 1996, 8 (8) : 1261-75. ) 由此推測該基因在小抱子發(fā)育過程中可能也起到重要的作用，它的缺失可能會引起植物的敗育。目前已經(jīng)從酵母(SachsA. B，Bond M. ff. and Kongherg R. D. A single gene from yeast for both nuclear andcytoplasmic polyadenylate-binding proteins:domain structure and expression.Cell,1986, 20;45(6):827-35.)> 爪娃(Leflore V, Vincent A, Amalric F. Drosophilamelanogaster poly(A)-binding protein:cDNA cloning reveals an unusualIylong3 ' -untranslated region of the mRNA, also present in other eukaryoticspecies. Gene, 1990，15;96(2):219-25.)、人(Grange T, de Sa CM, Oddos J, Pictet Ral.Human mRNA polyadenylate binding protein:evolutionary conservation of anucleic acid binding motif. Nucleic Acids Res. 1987June, 15(12):4771-4787.)>擬南芥(Belostotsky D A, Meagher R B. Differential organ-specific expressionof three poly(A)-binding-protein genes from Arabidopsis thaliana. Proc NatlAcad Sci U S A. 1993，90 (14) : 6686-6690.)、胡蘿卜(林慧馨，張雷，楊志攀，黃美娟，吳乃虎.胡蘿卜DcPAB基因的分離及其結(jié)構(gòu)與功能分析.生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2004，20(3) :319-324.)、小麥(Hanh. Le, Su-chih. Chang, Tanguay R. L, Gallie D. R. Thewheat poly (A)-binding protein functionally complements pabl in yeast. Eur.J. Biochem, 1997，243(1-2) :350-7)等物種中分離到了 PAB基因，但是尚無油菜PAB基因的相關(guān)研究報(bào)告。油菜作為中國主要的油料作物，在長江流域廣泛種植，對國計(jì)民生具有重要影響。油菜雜種優(yōu)勢明顯，利用細(xì)胞核雄性不育配制雜種優(yōu)勢組合是雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)了多種類型的`細(xì)胞核雄性不育材料，并在理論和應(yīng)用方面取得了重要進(jìn)展，而新型不育源的發(fā)現(xiàn)和研究一直是雜種優(yōu)勢研究的基礎(chǔ)，并以此創(chuàng)造出更多的天然和人工不育材料，為育種和生產(chǎn)所應(yīng)用。因此，本發(fā)明開發(fā)了一個和油菜花粉發(fā)育和育性調(diào)控相關(guān)的基因BnPAB5。通過熒光定量PCR檢測該基因在可育植株的雄蕊中高量表達(dá)。通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，抑制At PAB5的表達(dá)會造成擬南芥花藥發(fā)育異常，導(dǎo)致雄性不育；而通過在擬南芥中過表達(dá)BnPAB5基因，和雄性不育轉(zhuǎn)基因植株雜交可以使雜交后代中PAB5基因的表達(dá)水平得到恢復(fù)，同時花藥和花粉粒的育性也恢復(fù)到正常水平。申請人的結(jié)果預(yù)示著PAB5在控制油菜和擬南芥花粉育性，創(chuàng)造雄性不育轉(zhuǎn)基因新材料中具有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種油菜BnPAB5基因，該基因在油菜的花藥中高效表達(dá)，通過抑制該基因的表達(dá)可以降低植物花藥的育性，從而獲得雄性不育植株，應(yīng)用于雜交育種。而且該基因在其它大部分植物組織中不表達(dá)，因此在植物基因工程中沉默該基因的表達(dá)不會引起植物營養(yǎng)生長階段的變化。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種油菜BnPAB5基因的制備方法，通過BLAST比對油菜的EST數(shù)據(jù)庫，獲得油菜全長序列的電子克隆后，應(yīng)用簡單的PCR方法即可以獲得該基因的序列。本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種油菜BnPAB5基因在控制油菜和擬南芥花粉育性中的應(yīng)用。通過沉默該基因的表達(dá)，發(fā)明人可以人工創(chuàng)造雄性不育系材料；而利用基因工程技術(shù)過表達(dá)該基因得到的恢復(fù)系材料，可以使雄性不育材料花粉的育性得到恢復(fù)。這一對材料可以在油菜雜交育種生產(chǎn)中應(yīng)用。為了完成上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案為了獲得本發(fā)明，發(fā)明人對油菜花粉發(fā)育過程中的相關(guān)基因進(jìn)行了深入和全面的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個新基因，該基因在一種新的啟動子的控制下，在可育植株的花藥中高效表達(dá)，而在不育植株中不表達(dá)。因此該基因和植物花粉的育性調(diào)控有關(guān)。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)抑制該基因的表達(dá)會造成植物花藥發(fā)育異常，導(dǎo)致雄性不育。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，上述目的可以通過提供油菜花藥高效表達(dá)基因Bn PAB5來實(shí)現(xiàn)，所述基因含有SEQ ID No.1所述核苷酸序列或與它們實(shí)質(zhì)上同源的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的可以通過提供植物油菜花藥高效表達(dá)多肽BnPAB5來實(shí)現(xiàn)，所述多肽含有SEQ ID No. 2所述氨基酸序列或與它們實(shí)質(zhì)上同源的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的通過提供含有以BnPAB5和AtPAB5基因同源區(qū)段400bp序列的RNA干擾重組載體(RNA1-AtPAB5)來實(shí)現(xiàn)對擬南芥中PAB5基因表達(dá)量的抑制。 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述重組載體(RNA1-AtPAB5)轉(zhuǎn)化的微生物(根癌農(nóng)桿菌EHA105，購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)來實(shí)現(xiàn)對擬南芥的轉(zhuǎn)化，從而抑制擬南芥中RabGDI3基因的表達(dá)量。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述微生物(包含有RNA1-AtPAB5重組載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物來實(shí)現(xiàn)對花藥育性的調(diào)控，獲得雄性不育轉(zhuǎn)基因植株。一種油菜BnPAB5基因的制備方法，其步驟是1、油采花粉聞效表達(dá)基因的克隆本發(fā)明所用油菜為甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)中雙九號(油料作物研究所王新發(fā)副研究員提供，以下相同)。中雙九號播種于大田，正常田間管理。在液氮中將油菜幼嫩葉片樣品研磨至粉狀，利用Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，以下相同)的要求進(jìn)行RNA的提取。提取的總RNA溶于無RNase的雙蒸水中。DNase I (購自Promega公司，以下相同)去除可能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650 BECKMAN, USA)分別檢測RNA在260納米和280納米光吸收值，結(jié)合1% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以獲得的RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA分裝后于_20°C保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中擬南芥PAB5基因序列在NCBI網(wǎng)站上用BLASTN(http://WWW. ncb1. nlm. nih. gov/BLAST)進(jìn)行比對，分別獲得與擬南芥PAB5基因序列5 '端同源的油菜EST序列以及和3'端同源的油菜EST序列，基于油菜EST文庫的電子延伸得到了全長2196bp的PAB5基因的cDNA序列。然后根據(jù)獲得的油菜EST序列與擬南芥PAB5基因起始密碼子和終止密碼子同源區(qū)域設(shè)計(jì)引物從而確保擴(kuò)增產(chǎn)物為全長序列。油菜 PAB5 擴(kuò)增引物序列分別為 PAB5A 5 ' -GCGATGGTTGATCAAGTCAT-3 '和 PAB5S -TCACTCCGTTGAGGAGGG-3;(以下相同)。以油菜葉片cDNA為模版，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)?4°C,5min ;94°C，45s，57°C，45s，72°C，2min，33個循環(huán)；72°C, IOmin0PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0% (瓊脂糖凝膠/TE溶液質(zhì)量體積比，以下相同)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一條約2.01*左右?guī)?1998&

圖1)。利用凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技北京有限公司，以下相同)純化回收后，連接到PMD18-T載體(購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，熱激法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)轉(zhuǎn)化gold菌株的感受態(tài)細(xì)胞(購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，涂布于含有氨節(jié)青霉素50 V- g/mL (質(zhì)量體積比，以下相同)的LB固體培養(yǎng)基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C，6. 859X104Pa下高壓消毒20分鐘。分裝到培養(yǎng)皿中，4°C冷藏備用，以下相同)平板上，370C培養(yǎng)過夜，挑選白斑6個。采用M13引物5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3 '和 5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3'，做菌落 PCR 檢測。菌落PCR具體方法(以下相同)是用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模版，反應(yīng)體系為10 y L內(nèi)含:10XTaq buffer (含 MgCl2)ly I,1. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I u 1，5，引物(lOumol/L)0. 5u 1，3，引物(10umol/L)0. 5u 1，Taq (5U/ u 1)0. 5 u 1，ddH206. 5 u I。反應(yīng)條件為94°C 5分鐘，94°C I分鐘，55°C I分鐘，72°C 2分鐘30秒，33個循環(huán)，72 °C 10分鐘，擴(kuò)增大小為1998bp，1. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確后。將PCR檢測大小正確的菌斑接種到含氨芐青霉素50 u g/mL的液體LB培養(yǎng)基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升，121°C，6. 859 X 104Pa下高壓消毒20分鐘，以下相同)，37°C下200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，小量堿法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)提取質(zhì)粒，1. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA大小正確后(為2064bp)，采用Kpn I /Xba I酶(2種酶購自TaKaRa公司，以下相同)切對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(以下相同)，酶切體系(以下相同)為 IOu 1，包含質(zhì) 粒DNA5ii I,Kpn I 0. 5 u I,Xba 10. 5 u l,ddH204u 1，37°C過夜，1.0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測。將檢測正確的陽性重組克隆命名為pMD18-BnPAB5(將目的基因序列BnPAB5連入pMDlS-T載體構(gòu)建而成，以下相同)，為了確保載體中啟動子的序列信息，將pMD18-BnPAB5送上海英駿公司進(jìn)行測序。將測序獲得的BnPAB5基因的⑶S序列與擬南芥CDS序列通過NCBI比對分析，發(fā)現(xiàn)該段區(qū)域中含有完整的ORF閱讀框及起始密碼子ATG。分析結(jié)果顯示，獲得了一種分離的油菜BnPAB5基因cDNA全長(⑶S序列，以下相同)，其序列為SEQ ID N0:1所示核苷酸序列。利用NCBI的開放閱讀框?qū)ふ页绦?0RF founder)確定BnPAB5基因的開放閱讀框，推導(dǎo)出蛋白質(zhì)序列編碼的氨基酸。獲得了一種分離的油菜BnPAB5蛋白全長，其序列為SEQID NO:2所示氨基酸序列。該基因的開放讀碼框所推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列編碼682個氨基酸。對蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點(diǎn)進(jìn)行在線計(jì)算(http://us. expasyorR/tools/pi tool, htm)。蛋白質(zhì)的分子量大約為71598. 4Da，理論等電點(diǎn)約為8. 38。通過在線軟件ProtScale (http://www. expasy. ch/tools/protscale. html)和 TMHMM (http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/)對PAB5的CDS序列進(jìn)行的分析表明它是一個非分泌性蛋白，沒有信號肽區(qū)段，也沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。BLASTp在線分析軟件將推導(dǎo)的編碼蛋白與Genebank中的序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該序列與擬南芥AtPAB5、煙草NtPAB、水稻OsPAB、胡蘿卜DcPAB、玉米ZmPAB、黃瓜CsPAB、小麥TaPAB的PAB蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性分別達(dá)到76%、52%、52%、53%、51%、52%、53%。用 NCBI 的 Conserved Domains 工具(http://wwwncb.1nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)在線進(jìn)行保守區(qū)域分析結(jié)果表明該基因?qū)儆赑oly (A)結(jié)合蛋白超家族，含有4個RNA識別位點(diǎn)(RNA recognition motif, RRM),每個RRM包括兩個更為保守的RNP I和RNP II序列元件。BLAST發(fā)現(xiàn)BnPA B5與AtPAB5⑶S核苷酸同源性大于90%，利用DNAMAN以及在線軟件TC0FFEE(http://www. tcoffee. org/)它們的氨基酸同源性達(dá)到76%。結(jié)果表明所克隆的油菜PAB5是AtPAB5的同源基因，將其命名為BnPAB5。因此BnPAB5和其他PAB基因一樣在調(diào)控轉(zhuǎn)錄本的多腺嘌呤化、運(yùn)輸、翻譯的起始等過程起著重要的作用，具有控制基因表達(dá)的功能。本發(fā)明通過構(gòu)建PAB5的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化擬南芥后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株由于PAB5的表達(dá)受到抑制而均出現(xiàn)了雄性不育的表型。說明PAB5具有控制擬南芥花藥發(fā)育和花粉育性的新功能。2、油菜BnPAB5基因的表達(dá)模式本發(fā)明所用另一種油菜為甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)顯性核不育雜合不育系J03AB(Msmsrfrf*msmsrfrf )。系經(jīng)多年回交和姐妹交而育成。不育株命名為A,可育株命名為B，二者可視為一對近等基因系，僅存在不育位點(diǎn)差異(胡勝武，于澄宇，趙惠賢，路明，油菜顯性核不育材料Shaan — GMS純合兩型系803AB的選育。西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，ii (4)25 — 2)。供試材料播種于大田，正常田間管理。從同一大田生長條件相同的可育植株上取根、莖、葉、花蕾、角果，從花蕾中解剖分離雌蕊和雄蕊(花藥)，每種材料至少取三個重復(fù)，每個重復(fù)至少一株，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮中，-80°C保存。在大田分別從油菜可育植株和不育植株上取花蕾，帶回實(shí)驗(yàn)室后，在冰盒上分別挑取可育植株和不育植株花蕾中的雄蕊和雌蕊，每種材料至少取三個重復(fù)，每個重復(fù)至少一株，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮中，_80°C保存。提取RNA時,在液氮中將植物樣品研磨至粉狀,利用Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，以下相同)的要求進(jìn)行RNA的提取。所提總RNA溶于無RNase的雙蒸水中。DNase I (購自Promega公司，以下相同)去除可能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650 BEC KMAN，USA)分別檢測RNA在260納米和280納米光吸收值，結(jié)合1% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以獲得的RNA為模板，根據(jù)Promega公司逆轉(zhuǎn)錄酶的說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA分裝后于_80°C保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR儀為IQ5 (美國伯樂公司)，采用油菜Actin作為內(nèi)標(biāo)基因(登錄號 AF111812)，Actin 基因引物為 5 ' -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 '和5 ' -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3 '。根據(jù)擬南芥和油菜PAB5基因CDS序列的保守區(qū)段設(shè)計(jì)的BnPAB5基因引物為5 ' -TGGACCAAACTGTCAACGAAG-3 '和5' -CCAAGTGAACGACGAGTCAAG-3'。熒光定量PCR反應(yīng)每組實(shí)驗(yàn) 均完成三個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)至少做三次技術(shù)重復(fù)。分別檢測BnPAB5在油菜組織(根、莖、葉、花、角果、花藥、雌蕊)中的表達(dá)。用比較Ct法(A ACt)計(jì)算基因的相對表達(dá)量。通過2_AAet估算目的基因的相對表達(dá)量和系統(tǒng)誤差(Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001, Analysis of RelativeGene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the2_AAcT Method.METH0DS25, 402-408.)。在計(jì)算相對表達(dá)量時，以根的樣本為參照，即將其值轉(zhuǎn)換成I (標(biāo)準(zhǔn)值)，其它樣品再與其比較，獲得相對表達(dá)值。3、PAB5基因的功能驗(yàn)證3. 1PAB5基因RNA干擾植物表達(dá)載體RNAi_AtPAB5的構(gòu)建為了研究本發(fā)明中的花粉高效表達(dá)基因BnPAB5的功能，采用了 RNA干擾(RNAinterference, RNAi，以 下相同)技術(shù)。由于油菜BnPAB5和擬南芥的AtPAB5具有相似的表達(dá)模式(Belostotsky A, Meagher B. A pollen-, ovule-, and early embryo-specificpoly (A)binding protein from Arabidopsis complements essential functions inyeast. Plant Cell, 1996，8 (8) : 1261-75.)、基因結(jié)構(gòu)(石磊 油菜PAB基因家族成員的克隆、表達(dá)模式分析和PAB5功能研究.([博士學(xué)位論文].北京中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009)、76%以上的蛋白同源性，推測兩者具有相同的功能。因此油菜PAB5的功能是通過研究擬南芥AtPAB5基因的功能獲得的。在上述序列分析的基礎(chǔ)上，選擇AtPAB5基因CDS序列中和BnPAB5基因CDS序列同源性最高的一段400bp的序列為RNA干擾靶標(biāo)片段。由此設(shè)計(jì)引物PAB5-R1-1-1 :5' -GACATCTAGAGAGTCGTGCGATGGAAAG-3'和 PAB5-Ri_l_2 :5 ' -CGCGGATCCCTTGCAGGAAGTCACATTC-3,。引物序列的5'末端分別引入了 XbalI和BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。擬南芥哥倫比亞型種植于生長間，花期收集擬南芥花蕾，投入液氮速凍。按照Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，前面已述)的要求提取擬南芥花蕾的RNA,以獲得的RNA為模板，根據(jù)Promega公司逆轉(zhuǎn)錄酶的說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(前面已述)，得到的cDNA分裝后于_80°C保存?zhèn)溆?。以獲得的花蕾cDNA為模板進(jìn)行AtPAB5基因干擾靶標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增。P CR引物為PAB5-R1-1-1和PAB5-R1-l-2 (前面已述)。PCR反應(yīng)體系為25 y L內(nèi)含:1 XPCR buff er, MgCIl. Smmol /T,, dNTPO. 2mmol/L (毫摩爾每升)、引物濃度為 0. 5mol/L，Pfu 酶1. 5 單位，模板約 lOOng。PCR 反應(yīng)程序如下94°C 5min ；94°C 30sec，55°C 45sec,72°C lmin, 35個循環(huán)；72° C延伸8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測(前面已述)。完成后用凝膠回收試劑盒回收純化目的片段(前面已述)，獲得AtPAB5基因干擾靶標(biāo)cDNA片段。用獲得的AtPAB5基因干擾靶標(biāo)cDNA片段替換pCAMBIA1301 (購自武漢競成生物科技有限公司)植物表達(dá)載體中的GUS基因序列，獲得AtPAB5基因的RNA干擾表達(dá)載體。為完成此目的，首先用Xba I/BamHI雙酶切(2種酶購自TaKaRa公司)AtPAB5基因干擾靶標(biāo)⑶NA片段，同時用Xba I/BamHI酶切pCAMBIA1301 (前面已述)質(zhì)粒的⑶S片段。酶切體系為IOul (前面已述)，酶切反應(yīng)在37度培養(yǎng)箱中進(jìn)行，約4-6個小時之后，用1%(質(zhì)量體積比)瓊脂糖膠電泳檢測。將AtPAB5基因干擾靶標(biāo)⑶NA片段的酶切產(chǎn)物和載體pCAMBIA1301上切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按AtPAB5基因干擾靶標(biāo)CDNA片段的酶切產(chǎn)物比pCAMBIA1301載體片段(150ng AtPAB5基因CDNA片段50ng載體片段)=3:1的比例(摩爾濃度比)混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，10 X反應(yīng)緩沖液，無菌水補(bǔ)充體積至20 u L，16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化后，在含有卡那霉素(50 u g/mL)固體LB平板上篩選，挑斑后以BarF:5' -CATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGG-3'和 BarR:5' -CCCGATCTAGTAACATAGATGACACCG-3'(以下相同)引物進(jìn)行菌落PCR檢測。菌落PCR具體方法(以下相同)是用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模版，反應(yīng)體系為10 ii L內(nèi)含:1OXTaq buffer (含MgCl2) I U 1，1. 5mmol/L dNTP (IOmmoI/L) I u 1，5，引物(10 u mol/L) 0. 5 U 1，3，引物(10 u mol/L) 0. 5 u l，Taq(5U/U 1)0. 5u l,ddH206. 5 u I0 反應(yīng)條件為 94 °C 5 分鐘，94 °C I 分鐘，55°C 30 秒，72°C 2 分鐘 30秒，33個循環(huán)，72°C 10分鐘，擴(kuò)增大小為1028bp，1. 0%(前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確后，選擇陽性菌株提質(zhì)粒，酶切(前面已述)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為RNA1-AtPAB5。通過凍融法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)將含有上述獲得的RNA1-AtPAB5載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105(購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)步驟如下1:取0. 2ml感受態(tài)農(nóng)桿菌，于冰中緩慢融化。2 :加入約2 ii g重組質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰浴30min后，投入液氮速凍lmin，然后37°C水浴5min，融化細(xì)胞。3 :加入800iU不含抗生素LB液體培養(yǎng)基(前面已述)，28°C輕搖培養(yǎng)4_5h。4:12000rpm，30s，去上清，細(xì)胞重懸于0. 2ml LB液體培養(yǎng)基(前面已述)培養(yǎng)基。5 :將培養(yǎng)物均勻涂布在含Rif (50mg/L)和Str (50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基(前面已述)瓊脂板上，28°C培養(yǎng)2天，待平板上出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子后挑菌，以BarF和BarR (前面已述)為弓I物進(jìn)行菌落PCR檢測(前面已述)。3. 2RNA干擾載體RNAi_A`tPAB5在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選采用花序侵染法(Zhang X. R. et al.Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006,1:1-6,以下相同)進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化。制備含有重組載體RNA1-AtPAB5的根癌農(nóng)桿菌EHA105 (前面已述)菌液，在轉(zhuǎn)化前一天轉(zhuǎn)入含有利福平50ii g/ml的LB液體培養(yǎng)基((前面已述)中，28°C過夜培養(yǎng)。第二天，用紫外分光光度計(jì)(SPEK0L1300)于276nm納米波長下檢測菌液的吸光值，當(dāng)菌液的吸光值達(dá)到在1.6-2. 0之間時取出。室溫(20-25°C，以下相同)以4000g離心lOmin，棄上清，沉淀懸浮于等體積的5%蔗糖溶液(蔗糖與蒸餾水的質(zhì)量體積比，以下相同)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)化前加入終濃度為0. 02% (體積比)的Silwet 1-77 (購自北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心，以下相同)?；靹蚝蟀汛D(zhuǎn)化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數(shù)15秒，取出植株。轉(zhuǎn)化后的植株用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養(yǎng)。第二天將塑料袋揭開，放在光強(qiáng)的地方培養(yǎng)。隔一周再做一次轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)一個月左右收獲種子，種子在培養(yǎng)箱或者日光下干燥3-5天。將轉(zhuǎn)化收獲的TO代種子播在混有PNS營養(yǎng)液的蛭石中，(PNS營養(yǎng)液成份為每升含 5mllM KN03，2mllM Ca(N03)2 . 4H20，2mllM MgS04 . 7H20，2. 5ml20mM Fe. EDTA,2. 5mllM磷酸緩沖液(pH5. 5)，Iml MS微量元素)。轉(zhuǎn)移到溫度20-25°C，光照強(qiáng)度5000-10000流明，光周期為16小時光照/8小時黑暗，空氣濕度大于80%以上的培養(yǎng)間中，正常管理。根據(jù)表達(dá)載體上特有的草胺磷(Bar)抗性篩選陽性植株。擬南芥長出一片真葉后，噴灑30ppm的除草劑Basta(購自拜爾公司)。一星期后，噴灑50ppm的Basta，獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性苗。篩選得到的轉(zhuǎn)化植株，稱Tl代轉(zhuǎn)化植株(以下相同)。葉片長到足夠大小時(3-4葉期)，取少許綠苗葉片，提取DNA (前面已述)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化材料的PCR陽性檢測(以下相同)。引物序列為BarF和BarR(前面已述)。反應(yīng)體系為10 yl內(nèi)含模板DNA模板I y L (約IOOng)，10 X Taqbuffer (含 MgC12)lii I,1. 5mmol/L dNTP (IOmmoI/L) I U 1，5，引物(10 u mol/L) 0. 5 U 1，3’引物(10umol/L)0. 5u 1，Taq(5U/ u I) 0. 5 u 1，ddH205. 5 u I。反應(yīng)條件為 94。。5 分鐘，94°C 30秒，550C 80秒，72°C I分鐘，32個循環(huán)，72°C 10分鐘，擴(kuò)增大小為1028bp。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(前面已述)，結(jié)果表明，AtPAB5基因RNA干擾植物表達(dá)載體RNAi_AtPAB5已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入擬南芥。共獲得了 10株轉(zhuǎn)基因陽性植株(含有檢測目的片段的植株稱陽性植株，以下相同，圖4)，分別命名為M1-1，M1-2等(以下相同)。3. 3RNA干擾載體RNAi_AtPAB5轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察經(jīng)過除草劑篩選和PCR檢測后獲得的轉(zhuǎn)基因陽性植株在生長間中正常管理并觀察其表型。在開花期，選取各個轉(zhuǎn)基因植株的分支頂端已經(jīng)漏白但未開放的花朵，撥開花蕾。在放大鏡(3倍)以及體視顯微鏡(OLYMPUS SZ61TRC)下觀察花藥以及花粉。用解剖針分離出花藥，參照亞歷山大染色法(Alexander, M. P. Differential staining of abortedand non-ab orted pollen. Stain Technol,，44:117122.，1969,以下相同)，40°C水浴加熱亞歷山大染色液(以配制大約100毫升染色液為例乙醇10ml，1%的孔雀石綠酒精溶液lml，蒸餾水50ml，甘油25ml，1%的酸性品紅水溶液5ml，1%的橙黃G水溶液0. 5ml，冰醋酸
l-4ml，苯酚5克，水合氯醛5克，以下相同)并浸泡花藥過夜(10-15小時)，用壓片法在顯微鏡(OLYMPUS 1X71)下觀察小孢子。通過觀察并統(tǒng)計(jì)正常小孢子(染成桔紅色)和敗育小孢子(染成綠色)的比例判斷小孢子的敗育程度。結(jié)實(shí)期用肉眼觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥的結(jié)實(shí)情況。染色觀察結(jié)果顯示野生型擬南芥的花藥飽滿并且充滿了小孢子，小孢子均染成橘紅色，說明小孢子發(fā)育正常。而轉(zhuǎn)基因擬南芥的花藥中小孢子數(shù)目都遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于野生型，有少量正常的小孢子數(shù)目，其它均為空癟或被染成綠色的敗育的小孢子(圖5)。經(jīng)過對所有轉(zhuǎn)基因后代植株進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示大部分轉(zhuǎn)基因后代擬南芥均出現(xiàn)了雄性不育表型，說明AtPAB5干擾轉(zhuǎn)基因植株出 現(xiàn)了典型的雄性不育表型。4、BnPAB5基因的互補(bǔ)功能驗(yàn)證4.1花藥高效特異表達(dá)啟動子PBnPABP3驅(qū)動的BnPAB5基因過表達(dá)植物表達(dá)載體0X-BnPAB5的構(gòu)建和根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105的轉(zhuǎn)化。為了進(jìn)一步證實(shí)油菜BnPAB5基因和擬南芥AtPAB5基因具有相同的功能，我們構(gòu)建由花藥高效特異表達(dá)啟動子Pbhpabp3 (專利號ZL2011110122101.2，發(fā)明名稱甘藍(lán)型油菜BnPABP3啟動子的制備方法及其應(yīng)用，以下相同)驅(qū)動的BnPAB5基因過表達(dá)植物表達(dá)載體0X-BnPAB5，轉(zhuǎn)化擬南芥。用獲得的0X_BnPAB5轉(zhuǎn)基因后代為父本，以RNA干擾的RNA1-AtPAB5雄性不育轉(zhuǎn)基因后代為母本進(jìn)行雜交，檢測雜交后代植株的花藥育性是否能夠得到恢復(fù)。過表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下中雙九號油菜花期，在田間收集油菜花蕾，投入液氮速凍。按照Trirol提取試劑盒(購自Invitrogen公司，前面已述)的要求提取中雙九號(前面已述)花蕾的RNA,以獲得的RNA為模板，根據(jù)Promega公司逆轉(zhuǎn)錄酶的說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(前面已述)，得到的cDNA分裝后于_80°C保存?zhèn)溆?。以獲得的花蕾cDNA為模板進(jìn)行BnRab⑶13基因⑶NA片段的PCR擴(kuò)增。根據(jù)甘藍(lán)型油菜BnPAB5基因序列(SEQ ID NO:1)設(shè)計(jì)引物，BnPAB5A :5' -GACGAGCTCTCACTCCGTTGAGGAGGG-3'和 BnPABSSj' -GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC-3'。引物序列的5'末端分別引入了 XbalI和SacI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為25 y L內(nèi)含:1 XPCR buffer, MgCIl. Smmol /T,, dNTPO. 2mmol/L (毫摩爾每升)、引物濃度為 0. 5mol/L，Pfu 酶1. 5 單位，模板約 lOOng。PCR 反應(yīng)程序如下94°C 5min ；94°C 30sec，55°C 45sec,72°C lmin, 35個循環(huán)；72° C延伸8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測(前面已述)。完成后用凝膠回收試劑盒回收純化目的片段(前面已述)，獲得BnPAB5基因⑶NA全長序列。田間收集油菜中雙九號的葉片，利用SDS裂解法(前面已述)提取油菜DNA，以DNA為模板，參照專利ZL2011110122101. 2 (甘藍(lán)型油菜BnPABP3啟動子的制備方法及其應(yīng)用)所述步驟進(jìn)行PBnPABP3 啟動子的擴(kuò)增，引物為PBnPABP3A 5' -GACATCTAGACGCTGTCGTTGGGGCAATTC-3'和 PBnFABP3S :5' -CAGAAGCTTAAAAGACTTACCGAGTTGAACC-3'。引物序列的 5'末端分別引入了 HindIII和NotI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。用獲得的PBnPABP3啟動子序列和BnPAB5基因序列分別替換pBI121植物表達(dá)載體中的CaMV35S序列和⑶S序列，構(gòu)建PBnPA·BP3驅(qū)動的PAB5基因的植物過表達(dá)載體。為完成此目的，首先用Xba I/SacI雙酶切(2種酶購自TaKaRa公司)BnPAB5基因CDNA 片段，同時用 Xba I/Sac I 酶切 pBI121(Chen, P. Y.，Wang, C. K.，Soong, S. C. To, K. Y. Complete sequence of the binary vector pBI121and its application in cloning T-DNAinsertion from transgenic plants. Mol. Breed. 11，287-293)質(zhì)粒的 GUS 片段。酶切體系為IOyl (前面已述)，酶切反應(yīng)在37度培養(yǎng)箱中進(jìn)行，約4-6個小時之后，用1% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖膠電泳檢測。將BnPAB5基因CDNA片段的酶切產(chǎn)物和克隆載體pBI121上切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按BnPAB5基因CDNA片段的酶切產(chǎn)物比PBI121載體片段(150ng 81^八85基因0)嫩片段501^載體片段)=3:1的比例(摩爾濃度t匕)混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，10 X反應(yīng)緩沖液，無菌水補(bǔ)充體積至20 u L，16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化后，在含有卡那霉素(50 ii g/mL)固體LB平板上篩選，挑斑后以NP T II F 5 ' -GATGGATTGCACGCAGGT-3 '和 NPT II R :5 ' -TCAGAAGAACTCGTCAAG-3 '引物進(jìn)行菌落PCR檢測(前面已述)。1.0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確后。獲得中間載體pBI121-BnPAB5 (以下相同)。隨后用Hindlll/Notl雙酶切(2種酶購自TaKaRa公司)PBnPABP3啟動子片段，同時用Hindlll/Notl雙酶切中間載體pBI121-BnPAB5 (前面已述)質(zhì)粒的CaMV35S片段。酶切體系為IOiU (前面已述)，酶切反應(yīng)在37度培養(yǎng)箱中進(jìn)行，約4-6個小時之后，用1% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖膠電泳檢測。將Pbhpabp3啟動子片段的酶切產(chǎn)物和中間載體pBI121-BnPAB5上切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按Pbiipabp3啟動子片段的酶切產(chǎn)物比pBI121-BnPAB5載體片段(150ngPBnFABP3啟動子片段50ng載體片段)=3:1的比例(摩爾濃度比)混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，10X反應(yīng)緩沖液，無菌水補(bǔ)充體積至20 u L，16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化后，在含有卡那霉素(50 ii g/mL)固體LB平板上篩選，挑斑后以PBnFABP3啟動子特異引物PBnMBp#和PBnMBP3S (前面已述)進(jìn)行菌落PCR檢測(前面已述)。1. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小。選擇陽性菌株提質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒為Pbhpabp3啟動子驅(qū)動的BnPAB5基因過表達(dá)植物表達(dá)載體，命名為0X-BnPAB5 (以下相同)。然后利用凍融法(前面已述)將0X-BnPAB5轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105 (前面已述)，卡那霉素(50 u g/mL)和利福平(50 u g/mL)雙抗性平板篩選，挑斑，進(jìn)行菌落PCR檢測驗(yàn)證(前面已述)。4. 20X-BnPAB5在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選采用花序侵染法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化(前面已述)。在轉(zhuǎn)化擬南芥前一天，將制備含有載體0X-BnPAB5的根癌農(nóng)桿菌EHA105(前面已述)菌液轉(zhuǎn)入含有卡那霉素50 u g/ml、利福平50 u g/ml的LB液體培養(yǎng)基中，28°C過夜培養(yǎng)。第二天，用紫外分光光度計(jì)(SPEK0L1300)于276納米波長下檢測吸光值，當(dāng)菌液的吸光值在1. 6-2. 0之間時取出。室溫(20-25°C，以下相同)以4000g離心IOmin,棄上清,沉淀懸浮于等體積的5% (質(zhì)量體積比)鹿糖中。將渾池的蔗糖溶液倒入一大培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)化前加入終濃度為0. 02% (體積比)的Silwetl-77 (購自北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心，以下相同)?；靹蚝蟀汛D(zhuǎn)化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數(shù)15秒，取出植株。轉(zhuǎn)化后的植株用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養(yǎng)。第二天將塑料袋揭開，放在光強(qiáng)的地方培養(yǎng)。隔一周再做一次轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)一個月左右收獲種子，種子在培養(yǎng)箱或者日光下干燥3-5天。將轉(zhuǎn)化收獲的TO代種子用70%(體積比)酒精和0. 01%(體積比)的升汞表面消毒10分鐘后用蒸餾水洗滌數(shù)次(5 7次)，然后均勻地吹打到MS固體篩選培養(yǎng)基(MS大量元素母液100ml ；MS微量元素母液IOml ；MS有機(jī)母液IOml ；MS鐵鹽IOml ;肌醇IOml ;蔗糖30g ;用IM NaOH調(diào)PH至5. 8，12g瓊脂粉，定容至1L，高壓121度滅菌后備用。加入Sg瓊脂粉可配置成固體培養(yǎng)基。各種母液配方見表I)表面。4°C春化4-6天，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)表達(dá)載體上所特有的卡那霉素抗性篩選陽性苗。葉片長到足夠大小時(3-4葉期)，取少許綠苗葉片進(jìn)行PCR陽性檢測，引物為NPT II F :和NPT II R (前面已述)，反應(yīng)體系為 lOiil。內(nèi)含模板 DNAlii L(約 lOOng)，10XTaq buffer (含 MgCl2)lul,l. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I y 1，5’ 引物(10 y mol/L) 0. 5 y 1，3，引物(10 y mol/L)0. 5u l,Taq(5U/u 1)0. 5 u l,ddH20 5. 5 u I0 反應(yīng)條件為 94°C 5 分鐘，94°C 30 秒，55。。30秒，72°C I分鐘，32個循環(huán)，72°C 10分鐘，擴(kuò)增大小為800bp。結(jié)果表明(圖7)獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株(含有檢測目的片段的植株稱陽性植株，以下相同)。將陽性植株自交3代以上，獲得10個純合T3代株系。分別命名為0X-1，0X-2等(以下相同)。表IMS培養(yǎng)基母 液配方
權(quán)利要求
1.一種分離的基因，其序列為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的一種分離的基因在控制擬南芥花粉育性中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的一種分離的多肽在控制擬南芥花粉育性中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的一種分離的基因在控制油菜花粉育性中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的一種分離的多肽在控制油菜花粉育性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種油菜BnPAB5基因及其應(yīng)用，一種分離的基因，其序列為SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示。PAB5通過與poly(A)尾巴的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄本的多腺嘌呤化、運(yùn)輸、翻譯的起始等過程起著特殊的作用，從而調(diào)控其他基因的表達(dá)過程。BnPAB5在油菜花藥和小孢子中呈顯著的優(yōu)勢表達(dá)。干擾擬南芥AtPAB5的表達(dá)能夠使其小孢子敗育。利用過表達(dá)BnPAB5的轉(zhuǎn)基因擬南芥作為父本，和干擾AtPAB5的轉(zhuǎn)基因擬南芥授粉，雜交后代植株花藥和花粉育性得到恢復(fù)。這一互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)油菜BnPAB5和擬南芥AtPAB5具有相同的功能控制油菜、擬南芥花藥發(fā)育以及花粉育性。通過基因工程技術(shù)調(diào)控PAB5的表達(dá)水平可以控制花粉的育性，創(chuàng)造雄性不育系材料和恢復(fù)系材料，可用于雄配子發(fā)育研究及農(nóng)作物品質(zhì)改良。
文檔編號C07K14/415GK103045610SQ20121050848
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月1日
發(fā)明者劉勝毅, 董彩華, 黃軍艷, 石磊, 童超波, 劉越英, 程曉輝 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所