專利名稱：一種油菜抗逆基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體地說，更具體涉及一種油菜抗逆基因DUF1645，同時還涉及該基因在作物抗逆(包括抗旱和耐潰)育種中的應(yīng)用，油菜抗逆基因DUF1645在擬南芥中的過量表達(dá)表明，此基因可顯著增強(qiáng)植物的抗旱性和耐潰性，為干旱和水潰逆境下提高作物的產(chǎn)量提供保證。
背景技術(shù)：
在自然條件下，植物在生長發(fā)育過程中經(jīng)常會遭受到許多非生物逆境如干旱、水潰、鹽潰、低溫等的傷害，對植物的生長發(fā)育、作物的產(chǎn)量等產(chǎn)生影響。其中干旱和水潰是各種環(huán)境脅迫中最普遍的逆境因子。干旱和水潰對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的威脅是一個世界性的問題，受全球氣候變化的影響，干旱、強(qiáng)降水以及連續(xù)降水事件的頻次和強(qiáng)度顯著增加，由此引發(fā)的農(nóng)業(yè)干旱和潰水危害日趨嚴(yán)重。據(jù)·統(tǒng)計，在各類自然災(zāi)害造成的總損失中，氣象災(zāi)害引起的損失約占85%，其中干旱因素引起的災(zāi)害又占到了氣象災(zāi)害損失的50%以上。據(jù)不完全統(tǒng)計，近50多年來，我國平均每年干旱受旱面積達(dá)到2217萬公頃。進(jìn)入20世紀(jì)90年代，年均受旱面積上升至2711萬公頃，嚴(yán)重干旱的2000年和2001年分別高達(dá)4054和3847萬公頃，2000年全國受旱面積為建國以來之最，其中絕收800萬公頃，因旱災(zāi)損失糧食近600億公斤，經(jīng)濟(jì)作物損失510億元，其影響超過了 1959-1961年3年自然災(zāi)害。而潰水危害引起的農(nóng)業(yè)損失僅次于干旱，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計顯示，僅發(fā)展中國家近年來至少有1200萬公頃高產(chǎn)農(nóng)田因潰水問題而降低了其生產(chǎn)能力，每年因潰水危害引起的農(nóng)作物減產(chǎn)高達(dá)15% -80%，如玉米 25% -30%，大豆 50% -60%，小麥 39% -44%。在長期的進(jìn)化過程中，高等植物逐漸演變產(chǎn)生了一套感受和傳導(dǎo)水分脅迫信號的系統(tǒng)，并形成一系列生理或發(fā)育的機(jī)制來響應(yīng)環(huán)境中的這種脅迫，最大限度地減輕干旱或水潰造成的傷害。植物的這種生物適應(yīng)現(xiàn)象極為復(fù)雜，在形態(tài)上，涉及到許多不同的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)性狀；在生理上，涉及許多重要的生化代謝途徑；在分子生物學(xué)上，涉及包括從信號傳導(dǎo)到基因轉(zhuǎn)錄控制的系列基因表達(dá)。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)與生物技術(shù)的發(fā)展，植物如何通過細(xì)胞感受逆境信號，傳導(dǎo)逆境刺激，激活一系列分子途徑并調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)和生理反應(yīng)以適應(yīng)逆境，已成為科學(xué)家研究的熱點。植物中水分脅迫誘導(dǎo)的基因分為兩類:一類是在植物的抗性中起作用的蛋白質(zhì)基因，以維持細(xì)胞各種生理生化代謝活動正常進(jìn)行。包括滲透調(diào)節(jié)因子(如脯氨酸、甜菜堿等)的合成酶基因，直接保護(hù)細(xì)胞免受水分脅迫傷害的功能蛋白(如Lea蛋白、滲調(diào)蛋白、水通道蛋白、離子通道蛋白等)基因，以及毒性降解酶(如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、可溶性環(huán)氧化物水解酶、超氧化物酶、過氧化氫酶、和抗壞血酸過氧化物酶等)基因。另一類即是在信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)過程中起調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)基因，主要包括傳遞信號和調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因，感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號的蛋白激酶基因，以及在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用的蛋白酶基因。近十多年來，植物響應(yīng)水分脅迫的研究在基因表達(dá)調(diào)控、蛋白修飾和相互作用、信號傳遞網(wǎng)絡(luò)方面取得了許多新的發(fā)現(xiàn)和突破。尤其是DREB1/CBF、DREB2、AREB/ABF、NAC、ZFHD等幾大類轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)植物水分脅迫的基因表達(dá)調(diào)控中起到了重要作用。本發(fā)明中提到的植物抗逆相關(guān)蛋白DUF1645及其編碼基因，目前為止，包括在模式植物擬南芥中都還未有任何相關(guān)功能的報道，是一個未知功能的蛋白和基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)抗逆基因DUF1645，該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示，包括與SEQ ID NO:1所示的DNA序列至少有70%同源性的基因序列；也包括在添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而產(chǎn)生的突變體等位基因或衍生物。通過將油菜抗逆基因DUF1645在擬南芥中的過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)此基因可顯著增強(qiáng)植物的抗旱性和耐潰性，在干旱脅迫15天以內(nèi)或者水潰脅迫10天以內(nèi)植株生長正常，并且產(chǎn)量、品質(zhì)基本不受影響，為干旱和水潰逆境下提高作物的產(chǎn)量提供保證。本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種甘藍(lán)型油菜抗逆基因DUF1645在植物抗逆(抗旱和耐潰)育種中的應(yīng)用，提高了植物對逆境(干旱和水潰)的耐受能力，保證了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)免受或少受逆境脅迫的不利影響。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:一種甘藍(lán)型油菜抗逆基因DUF1645，其制備步驟是:一種油菜抗逆基因DUF1645及與油菜70%同源的擬南芥DUF1645的獲得:1)在一對抗逆性(主要是抗旱和耐潰性)存在差異的油菜品系zy036和51070(Hu Z Y, Wang XFj Zhan GMj Liu GHj Hua Wj Wang HZ.2009.Unusually large oilbodiesare highly correlated with lower oil content in Brassica napus.Plant CellReports, 28:541-549.)中差減得到該基因EST序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已發(fā)表的擬南芥DUF1645基因序列(At5G14730)，并以此編碼區(qū)序列BLAST NCBI EST數(shù)據(jù)庫，尋找與之同源的油菜DUF1645基因的EST序列，并設(shè)計基因編碼序列的兩側(cè)引物(正向引物:5’ -ATGCAAGATTTTTCATATTCTACGG-3’ ；反向引物:5 ’ -TTATCGACTGAGTCTACTCATTC-3’)。擬南芥DUF1645基因根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的序列設(shè)計引物:(正向引物:5’ -ATGAGTACAATGCAAGAITTATC-3’ ；反向引物:5’ -TTAATTACGGAATCTACCCATCC-3’)。2)以油菜、擬南芥cDNA第一鏈為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行測序，獲得油菜及擬南芥DUF1645基因序列，一種甘藍(lán)型油菜抗逆基因DUF1645，其序列為SEQID N0:1所示，擬南芥基因序列與數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的相同。通過上述方法獲得了甘藍(lán)型油菜及擬南芥抗逆基因DUF1645，采用一種提高DUF1645表達(dá)活性的轉(zhuǎn)基因擬南芥，其特征在于轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)為DUF1645含量增加，比受體對照(非轉(zhuǎn)基因植株)的抗逆性有所增強(qiáng)。一種甘藍(lán)型油菜抗逆基因DUF1645在擬南芥抗逆(抗旱和耐潰)育種中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是:1)將克隆得到的油菜、擬南芥抗逆基因DUF1645分別與PCR8/GW/T0P0(invitrogen 公司)質(zhì)粒連接，命名為 topo_BnDUF1645 和 topo_AhDUF1645,利用 PCR8/GW/T0P0質(zhì)粒與質(zhì)粒表達(dá)載體PearleygatelOO (invitrogen公司)可以體外重組的特性將抗逆蛋白基因DUF1645轉(zhuǎn)移至表達(dá)載體，命名為Pearleygatel00-BnDUF1645和Pearleygate100-AhDUF1645 ；2)將步驟 I)中制備的載體 Pearleygatel00-BnDUF1645 和Pearleygate 100-AhDUF1645轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101 (invitrogen公司)，再導(dǎo)入擬南芥植株中；3)篩選陽性植株。種植擬南芥TO代所收獲的種子,待10天左右噴灑除草劑(Liberty, Invitrogen公司)用于篩選陽性植株，葉片DNA提取后進(jìn)行PCR鑒定，最終確認(rèn)基因已入的陽性植株。本發(fā)明中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”是指含有導(dǎo)入的基因并能夠穩(wěn)定地增強(qiáng)或抑制所導(dǎo)入的基因表達(dá)并產(chǎn)生具有特定的生物學(xué)性狀的植物。本發(fā)明中所提到的植物包括水稻、小麥、玉米等受干旱和水潰逆境影響較大的糧食作物，也包括油菜、大豆、棉花等經(jīng)濟(jì)作物，還包括夏季生長的黃瓜、番茄等蔬菜作物?？寺”景l(fā)明中所述的抗逆蛋白基因DUF1645的方法是本領(lǐng)域中所常采用的方法。提取植物葉片DNA是常用的分子生物學(xué)技術(shù)，提取mRNA的方法也有多種成熟的技術(shù)，試劑盒(TRIzol Reagent)可從商業(yè)途徑獲得(Invitrogen公司),而構(gòu)建cDNA文庫也是常用的分子生物學(xué)技術(shù)。構(gòu)建本發(fā)明中所述的 載體構(gòu)建和將載體轉(zhuǎn)染入植株所用到的酶切、連接、花序侵染等方法也是本領(lǐng)域中常用技術(shù)。其中所涉及的質(zhì)粒(入門載體PCR8/GW/T0P0，質(zhì)粒表達(dá)載體PearleygatelOO),轉(zhuǎn)染用媒體(如根癌農(nóng)桿菌GV3101和所用試劑成分如鹿糖、6-BA等)可從商業(yè)途徑獲得。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:本發(fā)明是國內(nèi)外首次公開油菜抗逆基因DUF1645序列，它屬于細(xì)胞質(zhì)I類小分子抗逆蛋白，目前其過量表達(dá)可提高植物抗逆性的功能沒有相關(guān)報道。本發(fā)明實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥DUF1645的含量與受體對照(非轉(zhuǎn)基因植株)相比均有很大程度的提高，其抗逆性也因此得到增強(qiáng)。因此本發(fā)明提出可利用DUF1645的過量表達(dá)來增強(qiáng)植物抗逆性以便用于農(nóng)作物及蔬菜的抗逆品種選育，由此減緩干旱和水潰逆境對經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量和品質(zhì)造成的傷害。


圖1為一種植物表達(dá)載體示意圖。將DUF1645基因編碼區(qū)序列與PCR8/GW/T0P0質(zhì)粒連接后篩選正向載體，獲得PCR8/GW/T0P0-DUF1645,然后 PCR8/GW/T0P0-DUF1645 質(zhì)粒與表達(dá)載體 PearleygatelOO 進(jìn)行重組，并篩選陽性克隆獲得Pearleygatel00_DUF1645。圖2為一種除草劑篩選過后的轉(zhuǎn)基因植株示意圖。擬南芥花序侵染后的植株收獲種子TO代，播種2周后噴灑除草劑篩選陽性植株。圖3為一種轉(zhuǎn)DUF1645基因擬南芥Tl代的PCR鑒定結(jié)果示意圖。123為轉(zhuǎn)油菜抗逆基因，AB⑶為轉(zhuǎn)擬南芥抗逆基因，WT為對照野生植株。圖4轉(zhuǎn)基因植株與對照植株水潰、干旱處理后的比較示意圖。圖4中A:潰水脅迫對照，左邊野生型，右邊轉(zhuǎn)DUF1645植株；圖4中B:潰水脅迫10天，左邊野生型葉片變黃，右邊轉(zhuǎn)DUF1645植株葉片無明顯變化；圖4中C:干旱脅迫對照，上面野生型，下面轉(zhuǎn)DUF1645植株；圖4中D:不澆水干旱脅迫15天，上面野生型葉片變紫萎蔫，下面轉(zhuǎn)DUF1645植株葉片變化不明顯；圖4中E:噴6%PEG干旱脅迫15天，上面野生型葉片變紫，下面轉(zhuǎn)DUF1645植株葉片變化不明顯。
具體實施例方式通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆:實驗室手冊(New YorkiColdSprin g Harbor Laboratory Press, 1989),或Draper 等人(Blackwell 科學(xué)出版社，1988)所述的條件，或按照所用試劑制造廠商所建議的條件。實施例1:油菜和擬南芥抗逆基因DUF1645的獲得:在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已發(fā)表的擬南芥DUF1645 (At5G14730)基因序列，BLAST到油菜EST序列并拼接出油菜DUF1645編碼區(qū)全長。設(shè)計基因編碼序列的兩側(cè)引物(正向引物:5’ -ATGCAAGATTTTTCATATTCTACGG-3，；反向引物:5’ -TTATCGACTGAGTCTACTCATTC-3，)。擬南芥DUF1645基因根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的序列設(shè)計引物:(正向引物:5 ’ -ATGAGTACAATGCAAGATTTATC-3，;反向引物:5 ’ -TTAATTACGGAATCTACCCATCC-3 ’ )1、提取油菜、擬南芥mRNA。RNA 的提取(TRIZOL TM Kit 提取 RNA)液氮研磨IOOmg材料A.加 Iml TRIZOL,室溫(20_25°C，下同)放置 5min。B.加入200ul氯仿，劇烈振蕩30s，室溫放置2min。C.12000g,15min,4°C ,取上清至新管中，加入500ul異丙醇，混勻后室溫放置15min。 D.12000g, 15min，4°C，去上清，加入Iml70% (無水酒精與H20的體積比)乙醇。E.7500g，7min，4°C，去上清，空氣干燥。F.DEPC — H2O 溶解。2、cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄米用 RevertAid H Minus First Strand cDNA SynthesisKit (Ferme ntas),操作參照所用試劑盒說明進(jìn)行。3、以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了一種油菜抗逆基因DUF1645，其核苷酸序列為SEQ ID N0:1所示。一種油菜抗逆基因DUF1645編碼的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。此基因過量表達(dá)可顯著增強(qiáng)植物的抗旱性和耐潰性，在干旱脅迫15天以內(nèi)或者水潰脅迫10天以內(nèi)保證植株生長正常，并且產(chǎn)量、品質(zhì)基本不受影響，為干旱和水潰逆境下提高作物的產(chǎn)量提供保證。油菜和擬南芥PCR的20 μ I反應(yīng)體系如下:
權(quán)利要求
1.一種甘藍(lán)型油菜抗逆基因，其序列為SEQ ID N0:1所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)型油菜抗逆基因翻譯的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO:2所示。
3.權(quán)利要求1 所述的一種甘藍(lán)型油菜抗逆基因在擬南芥抗逆育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種油菜抗逆基因及其應(yīng)用。一種甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)抗逆基因DUF1645，該基因的核苷酸序列為SEQIDNO1所示，通過將油菜抗逆基因DUF1645在擬南芥中的過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)此基因可顯著增強(qiáng)植物的抗旱性和耐漬性，在干旱脅迫15天以內(nèi)或者水漬脅迫10天以內(nèi)植株生長正常，并且產(chǎn)量、品質(zhì)基本不受影響，為干旱和水漬逆境下提高作物的產(chǎn)量提供保證，因此本發(fā)明在作物抗逆育種中有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號A01H5/00GK103160516SQ20131007487
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月8日
發(fā)明者王漢中, 華瑋, 胡志勇, 劉靜, 劉貴華, 王新發(fā), 詹高淼, 楊紅麗, 鄧林彬 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所