專利名稱：油菜光合作用相關基因BnGLK1及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種油菜光合作用相關基因&1GLK1。本發(fā)明提供了該基因的核苷酸序列、蛋白序列及其同源序列，同時還涉及該基因在作物含油量育種中的用途。
背景技術：
油料作物生產(chǎn)不僅在國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中占有重要地位，也是促進中國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素之一。目前中國的植物油生產(chǎn)量僅能滿足國內(nèi)1/2-2/3的消費需求， 大量依賴進口，是世界上最大的油料進口國。油菜是中國最主要的油料作物之一，菜籽油在中國的食用油約占40 %。中國油菜年種植面積700萬公頃，菜籽產(chǎn)量超過1，000萬噸，面積和總產(chǎn)均為世界第一位，分別占全世界的1/3。目前經(jīng)過幾代育種學家的努力，通過傳統(tǒng)育種途徑已經(jīng)使油菜單產(chǎn)提高了許多，進一步通過傳統(tǒng)育種途徑大幅度提高產(chǎn)量的難度很大。但中國的菜籽比其它國家生產(chǎn)的含油量低，長江流域油菜質(zhì)量普查結(jié)果顯示，2004年油菜商品籽含油量為39. 1%，比同年加拿大商品籽02.6%)的低3.5個百分點。因此，大幅提高中國油菜含油量成為油菜育種的主要目標，也是解決中國對菜籽油需求量增加最有效的途徑之一。油菜種子含油量屬數(shù)量性狀，其遺傳受微效多基因控制，并且環(huán)境影響很大， 在傳統(tǒng)育種方法上有一定難度。現(xiàn)在人們越來越多地把重點放在含油量相關功能基因的分離上，并利用這些基因進行相關的基因工程品種改良爭取從根本上改善種子的品質(zhì)，提高油含量。脂肪酸和油脂的生物合成途徑在植物體內(nèi)研究的已較為透徹，從不同物種中已經(jīng)有相當多的相關基因得到分離和鑒定，研究也表明不同物種脂肪酸和油脂合成的化學途徑基本上是相同的(Lung and Weselake 2006，Snyder 2009)。種子油脂合成的主要前體包括乙酰輔酶A，NAD(P)H和ATP。這些合成前體的來源和調(diào)控直接影響油脂積累的速率和數(shù)量(Voelker 2001)。它們的來源也一直被重點研究，但由于代謝途徑的復雜性和冗余性，它們的具體來源仍還存在許多爭議(Rawsthorne 2002)。乙酰輔酶A是所有脂肪酸碳骨架合成的最初底物，同樣也是許多細胞代謝的重要中間產(chǎn)物，在細胞中大量合成也大量消耗。葉綠體內(nèi)的丙酮酸脫氫酶，乙酰輔酶A合成酶，肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶以及細胞質(zhì)的ATP檸檬酸裂合酶都有可能參與了乙酰輔酶A的合成(Neuhaus and Emes 2000)。khwender等Q004)的研究證明油菜油脂合成所需的丙酮酸并不像以前所認為的全部是通過糖酵解途徑產(chǎn)生，而是核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)在菜籽中獨立于Calvin循環(huán)(光合作用的暗反應)發(fā)揮作用，使從胚珠光合作用產(chǎn)物中制造的脂肪酸更多，暗示C02在油脂合成過程可能也起著很重要的前體作用。脂肪酸合成所需的ATP和NAD (P) H，在光照條件下一般認為是由光反應提供(Ruuska等2004)，但也存在一定爭議，如festmond (1998)證明在脂肪酸合成中所需ATP和NAD(P)H僅靠光的貢獻是不夠的，還需要從細胞質(zhì)中獲得。在黑暗中及缺乏葉綠體的組織中，磷酸戊糖氧化途徑是還原態(tài)NAD (P)H最有可能的來源，但也有研究表明同時還需要其他幾個途徑如糖酵解等才能提供足夠的還原力(khwender等2003)。最近在油菜
3和擬南芥中的研究結(jié)果顯示，種子內(nèi)的光合作用對含油量的貢獻率在40%左右(i^rnando 2005，Setsuko 2008)。而對磷酸戊糖途徑的抑制反而增加了種子的含油量，表明相對于其提供用于脂肪酸合成的還原力NADPH，抑制磷酸戊糖途徑來增加碳源可以更有效的增加油脂含量(Setsuko 2008)。雖然單一的改變脂肪酸和油脂合成途徑中的一系列酶如ACCase，GPAT, DGAT等可以調(diào)控含油量的變化(Roesler 1997，Jain 2000, Weselake 2008，Zheng2008)，但也有一些基因能夠在代謝途徑的上游位置以一種更有效的方式來對脂肪酸和油脂的合成進行整體的調(diào)控。最近研究表明，植物胚胎發(fā)育相關的轉(zhuǎn)錄因子通過影響一系列的生化途徑包括糖酵解、脂肪酸代謝、蛋白質(zhì)合成等中的眾多酶類，來調(diào)控種子成熟過程中儲藏產(chǎn)物的增加 (Gutierrez 2007，Verdier andThompson 2008，Santos 2008)。通過對模式植物擬南芥突變體的篩選，鑒定了一系列調(diào)控種子油脂積累的轉(zhuǎn)錄因子如LEC1、LEC2、WRI1、GLABRA2 等(Shen 2006, Baud 2007b, Mu 2008)。然而，由于多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子的功能豐余性增加了研究其調(diào)控油脂含量的復雜性，目前為止仍有一些轉(zhuǎn)錄因子的作用機制未知(To 2008，Gao 2009)。上述植物種子含油量的研究多是以種子作為研究對象，重點集中在種子內(nèi)脂肪酸合成代謝及早期胚胎發(fā)育兩個方面。通過本實驗室對油菜多年的研究結(jié)果表明，油菜種子含油量主要由母體基因型控制。針對高低油油菜品系的正反交種子的含油量測定表明，母體效應對含油量的影響占84%，而花粉直感效應僅為16%。由于正反交種子基因型相同， 而角果皮是油菜角果成熟期最重要的源器官，多項生理生化數(shù)據(jù)表明角果皮光合作用效率與種子含油量具有正相關關系。而根據(jù)高低油材料的基因差異表達分析及F2群體的含油量QTL定位，我們選擇了一個光合作用相關基因toGLKl作為影響含油量的候選基因作進一步分析。GLK(Golden2-like)基因編碼GARP核轉(zhuǎn)錄因子，目前在玉米、擬南芥及綠藻等植物中被發(fā)現(xiàn)。GLK基因調(diào)節(jié)葉綠體的發(fā)育，具有兩個同源基因GLKl和GLK2。在擬南芥和苔蘚中兩個GLK基因是功能冗余的，只有glkl、glk2的雙突變體才出現(xiàn)一定的表型。擬南芥雙突變體葉片為淡綠色，葉肉細胞的葉綠體較小，且類囊體膜分散難以形成葉綠體基粒。與發(fā)育異常的葉綠體一致，雙突變體的蛋白尤其是核編碼的光合作用相關的基因大量減少， 從而導致植株光合效率下降。目前已從擬南芥、玉米、綠藻等植物中分離到光合作用相關基因GLKl基因。但在本發(fā)明申請之前，國內(nèi)沒有人公開或發(fā)表過關于油菜&1GLK1基因和蛋白序列，同時也無該類基因用于調(diào)控油菜種子含油量的相關報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種油菜光合作用相關基因BnGLKl序列。本發(fā)明中所使用的光合作用相關基因BnGLKl是包括SEQ ID NO. 1的DNA序列或與序列表中SEQ ID NO. 1限定的DNA序列具有70%以上同源性序列，也包括在添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而產(chǎn)生的突變體等位基因或衍生物。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一類油菜光合作用相關基因BnGLKl在調(diào)控植物種子(如擬南芥和油菜)含油量中的應用。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術措施油菜BnGLKl的獲得1)在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已發(fā)表的擬南芥GLKl基因序列(At2g20570)，并以此編碼區(qū)序列BLAST NCBI EST數(shù)據(jù)庫，尋找與之同源的油菜GLKl基因的EST序列，并設計基因編碼序列的兩側(cè)引物(BnGLKl正向引物[5’ -ATGTTAGCTCTCTCTCCGG-3’ ]，反向引物 [5’ -TCAGGCACAAGRCGCGGTC-3，])。2)以油菜cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR擴增，將擴增得到的片段進行測序，獲得油菜GLKl基因序列，一種油菜基因BnGLKl ( 一種DNA分子)，其堿基序列為SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。該基因的氨基酸序列由核苷酸序列推導而來，一種編碼油菜&1GLK1 蛋白，其序列為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。通過上述方法獲得了油菜光合作用相關基因BnGLKl基因，采用一種提高某基因表達活性的轉(zhuǎn)基因擬南芥，其特征在于轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)為BnGLKl基因表達量增加。其具體技術措施是提供了一種PCR8/GW/T0P0質(zhì)粒(invitrogen公司，商業(yè)途徑獲得)，可以與表達載體質(zhì)粒重組構(gòu)建基因表達質(zhì)粒。提供了一種質(zhì)粒表達載體PearleygatelOO (invitrogen公司，從商業(yè)途徑獲得)， 它含有35S啟動子和翻譯控制件。提供了一種可在植物中表達的宿主菌，農(nóng)桿菌(根癌農(nóng)桿菌GV3101，invitrogen 公司，商業(yè)途徑獲得)。本發(fā)明提供了一種能夠過量表達&1GLK1轉(zhuǎn)基因擬南芥的方法，其特征在于擬南芥中BnGLKl含量增加。一種油菜基因BnGLKl，其應用過程包括下列步驟1)將克隆得到的油菜BnGLKl分別與PCR8/GW/T0P0質(zhì)粒連接，命名為 topo-BnGLKl，利用PCR8/GW/T0P0質(zhì)粒與質(zhì)粒表達載體PearleygatelOO可以體外重組的特性將BnGLKl轉(zhuǎn)移至表達載體，命名為PearleygatelOO-BnGLKl ；2)將步驟1)中制備的載體PearleygatelOO-BnGLKl轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，再導入擬南芥植株中；3)篩選陽性植株。種植擬南芥TO代所收獲的種子，待10天左右噴灑除草劑(Liberty，Invitrogen 公司)用于篩選陽性植株，葉片DNA提取后進行PCR鑒定，最終確認基因已導入的陽性植株。本發(fā)明中所用的術語“轉(zhuǎn)基因植物”是指含有導入的基因并能夠穩(wěn)定地增強或抑制所導入的基因表達并產(chǎn)生具有特定的生物學性狀的植物?？寺”景l(fā)明中所述的獲得油菜光合作用相關基因BnGLKl的方法是本領域中所常采用的方法。提取植物葉片DNA是常用的分子生物學技術，提取mRNA的方法也有多種成熟的技術，試劑盒(TRIzol Reagent)可從商業(yè)途徑獲得Qnvitrogen公司)，而構(gòu)建cDNA文庫也是常用的分子生物學技術。構(gòu)建本發(fā)明中所述的載體構(gòu)建和將載體轉(zhuǎn)染入植株所用到的酶切、連接、花序侵染等方法也是本領域中常用技術。其中所涉及的質(zhì)粒(入門載體 PCR8/GW/T0P0，質(zhì)粒表達載體PearleygatelOO)，轉(zhuǎn)染用媒體(如根癌農(nóng)桿菌GV3101和所用試劑成分如蔗糖、6-BA等)可從商業(yè)途徑獲得。
GLK(Golden2-like)基因編碼GARP核轉(zhuǎn)錄因子，目前在玉米、擬南芥及綠藻等植物中被發(fā)現(xiàn)。GLK基因調(diào)節(jié)葉綠體的發(fā)育，具有兩個同源基因GLKl和GLK2。在擬南芥和苔蘚中兩個GLK基因是功能冗余的，只有glkl、glk2的雙突變體才出現(xiàn)一定的表型。擬南芥雙突變體葉片為淡綠色，葉肉細胞的葉綠體較小，且類囊體膜分散難以形成葉綠體基粒。與發(fā)育異常的葉綠體一致，雙突變體的蛋白尤其是核編碼的光合作用相關的基因大量減少， 從而導致植株光合效率下降。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明是國內(nèi)外首次公開油菜光合作用相關基因BnGLKl序列，目前該類基因可調(diào)控植物種子含油量的功能沒有相關報道。利用擬南芥作為受體的轉(zhuǎn)基因結(jié)果證實， BnGLKl基因的過量表達提高了植物的光合效率，進而提高了擬南芥種子中的含油量。本發(fā)明實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)&1GLK1基因擬南芥的種子含油量與野生型受體對照相比均有較大幅度的提高(最高可達20% )。因此，本發(fā)明提出可利用BnGLKl的過量表達來增強植物光合效率以便用于油料作物的高油品種選育。


圖1油菜foiGLKl基因編碼區(qū)序列的克隆，長度為1. 4kb左右。圖2植物表達載體示意圖將foiGLKl基因編碼區(qū)序列與PCR8/GW/T0P0質(zhì)粒連接后篩選正向載體，獲得PCR8/ GW/T0P0-BnGLKl，然后 PCR8/GW/T0P0_&iGLKl 質(zhì)粒與表達載體 PearleygatelOO 進行重組， 并篩選陽性克隆獲得PearleygatelOO-BnGLKl。圖!BBnGLKl轉(zhuǎn)基因株系與野生型對照及glkl、glk2雙突變體葉片之間的對比圖中可以明顯看出與野生型對照及glkl、glk2雙突變體葉片相比，轉(zhuǎn)基因株系葉片顏色更深。
具體實施例方式通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或 Draper 等人(Blackwell 科學出版社，1988) 所述的條件，或按照所用試劑制造廠商所建議的條件。1.油菜光合作用相關基因&1GLK1的獲得在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已發(fā)表的擬南芥GLKl基因序列(At2g20570)，并以此編碼區(qū)序列BLAST NCBI EST數(shù)據(jù)庫，尋找與之同源的油菜GLKl基因的EST序列，并設計基因編碼序列的兩側(cè)引物(BnGLKl正向引物[5’ -ATGTTAGCTCTCTCTCCGG-3’ ]，反向引物 [5，-TCAGGCACAAGACGCGGTC-3，]，用于從油菜中擴增BnGLKl的對應序列。1、提取油菜 mRNA。RNA 的提取(TRIZ0L TM Kit 提取 RNA)液氮研磨IOOmg材料A.加 ImlTRIZOL,室溫(20- °C，下同)放置 5min。B.加入200ul氯仿，劇烈振蕩30s，室溫放置^iiin。 C. 12000g, 15min，4 °C，取上清至新管中，加入500ul異丙醇，混勻后室溫放置 15min。
6
D. 12000g, 15min，4°C，去上清，加入lml70% (無水酒精與H20的體積比)乙醇。E. 7500g, 7min, 4°C，去上清，空氣干燥。F. DEPC-H2O 溶解。2、cDNA 第一鏈的反轉(zhuǎn)錄采用 RevertAid H Minus First Strand cDNASynthesis Kit (Fermentas)，操作參照所用試劑盒說明進行。3、以cDNA為模板進行PCR擴增(見圖1)，得到了 foiGLKl的cDNA序列，其堿基序列為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。對應該核酸序列的蛋白質(zhì)，其序列為SEQID N0:2所示的氨基酸序列。2.油菜&1GLK1在調(diào)控擬南芥種子含油量中的應用一種油菜基因BnGLKl，其具體應用過程是2. IBnGLKl表達載體的構(gòu)建及擬南芥的轉(zhuǎn)化將PCR擴增得到的基因序列與TOPO入門載體(invitrogen公司)連接后， 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5 α (invitrogen公司)中，壯觀酶素篩選，載體引物(T7引物)與基因引物(基因上游引物)擴增鑒定正向插入克隆，質(zhì)粒經(jīng)小量制備后與 PearleygatelOO (invitrogen公司)進行重組，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5 α中，卡那霉素篩選，其插入片段經(jīng)載體引物(35S啟動字序列引物)與基因引物(基因下游引物)PCR鑒定， 示意圖見圖2。擬南芥的轉(zhuǎn)化過程試劑配制滲透培養(yǎng)基(IL) :l/2xMurashige-Skoog ；5% (質(zhì)量比)蔗糖；0. 5克 MES ；用 KOH 調(diào)至 ρΗ5· 7 ；再加10 微升 lmg/ml 的 6-BA 母液；200 微升 SilwetL-77轉(zhuǎn)化步驟(1)制備好已轉(zhuǎn)化了相應質(zhì)粒的農(nóng)桿菌(根癌農(nóng)桿菌GV3101)菌液10ml，在轉(zhuǎn)化前一天晚上，轉(zhuǎn)入大瓶培養(yǎng)過夜，第二天取出使用時農(nóng)桿菌液0. D600當在1. 2到1. 6之間。(2)室溫 5OOOrpm 離心分鐘。(3)棄上清，將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于相應體積的滲透培養(yǎng)基里，使0. D600在0. 8左
右ο(4)將整個植株直接浸泡至農(nóng)桿菌懸浮液30s。(5)避光培養(yǎng)過夜，然后正常培養(yǎng)至結(jié)子。2. 2轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選和驗證轉(zhuǎn)化子的篩選將春化過的擬南芥種子種于澆過飽和PNS營養(yǎng)液的人工土中，并用保鮮膜罩上。 兩天后人工模擬自然條件光照(光照16小時，暗8小時)，三天后揭膜。人工培養(yǎng)室條件相對濕度80%，恒溫20-240C，光照強度80-200umol/M2/S，光照周期為他黑暗、1 光照培養(yǎng)。一周左右，噴除草劑篩選陽性植株。PCR 鑒定(1)用于PCR的轉(zhuǎn)化植株總DNA的提取A. 70% (體積比，下同)乙醇擦洗葉片，稱取大約lOOmg。B.加入 600ul 抽提緩沖液(0. 2M Tris-Cl,0. 25NaCl,25mM EDTA,0. 5% SDS, pH
7. 5)，室溫快速研磨。
C. 1. 5ml Ependorff 管中潤旋混勻 S-lOs。D. 12000rpm，25min，室溫。取上清，加等體積異丙醇，-20攝氏度沉淀過夜。E. 12000rpm, 15min,室溫。加入 70% 乙醇 200ul 泡洗 DNA 沉淀。F. 12000rpm，15min，室溫。去乙醇。倒置于紙巾上，待乙醇揮發(fā)干凈。G.加無菌水lOOul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度計測定或電泳估測其濃度。 H.以總DNA為模板，進行PCR。(2) PCR 程序PCR反應混合液的配比同質(zhì)粒PCR鑒定，依據(jù)植物表達載體中目的基因及其上游 35S啟動子序列和基因下游引物[5’ -TCAGGCACAAGRCGCGGTC-3’ ]，反應的時間和溫度如下94 °C 3min94 °C 45s,59 V 45s72V Imin 30s,30cycles72 V 5min檢測結(jié)果顯示，大多數(shù)轉(zhuǎn)化植株均能夠擴增出預期大小的電泳條帶，而陰性對照 則沒有，表明轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組中已經(jīng)含有外源基因DNA片段。2. 3擬南芥轉(zhuǎn)基因株系表型分析葉片光合效率分析利用野生型擬南芥為受體進行轉(zhuǎn)基因，BnGLKl的過量表達葉 片顏色變成深綠色(見圖幻。通過對突變體、野生型對照及轉(zhuǎn)基因株系的光合效率測定分 析結(jié)果表明，過量表達&1GLK1的轉(zhuǎn)基因株系葉片光合效率提高(見表1)，與野生型對照相 比增加幅度在40% -130%。種子含油量測定通過對光合效率增加的轉(zhuǎn)基因株系種子含油量的測定分析，結(jié) 果表明與野生型對照相比，增加幅度最高達到20%左右。表1.轉(zhuǎn)BnGLKl轉(zhuǎn)基因株系葉片光合效率和種子含油量的測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種油菜基因&1GLK1，其堿基序列為SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
2.一種編碼油菜&1GLK1蛋白，其序列為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的一種油菜BnGLKl在調(diào)控擬南芥種子含油量中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了油菜光合作用相關基因BnGLK1及其應用。本發(fā)明中所使用的BnGLK1基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中BnGLK1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示或與序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有70％以上同源性DNA序列。2)BnGLK1蛋白序列是具有序列表中SEQ ID NO.2氨基酸殘基序列或是將SEQ ID NO.2中的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代缺失或添加且具有與SEQ ID NO.2的序列相同活性的衍生蛋白質(zhì)。利用擬南芥作為受體的轉(zhuǎn)基因結(jié)果證實，BnGLK1基因的過量表達提高了植物的光合效率，進而提高了擬南芥種子中的含油量。因此光合作用相關基因BnGLK1在油菜及其他油料作物的含油量育種中具有很好的應用前景。
文檔編號A01H5/10GK102311958SQ20101022150
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者劉貴華, 劉靜, 華瑋, 楊慶, 王新發(fā), 王漢中 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所