專利名稱：用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因棉花安全性的一種訪花昆蟲棉露尾甲的人工飼養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及一種訪花昆蟲棉露尾甲的飼養(yǎng)方法，屬昆蟲飼養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在美國(guó)和歐洲的許多地方，多種環(huán)境因素造成了包括蜜蜂和甲蟲類昆蟲等訪花生 物種群和物種數(shù)量的急劇減少(Constance H. Pollinators in peril. Science, 1998,279 1459. Erik S. ECOLOGY Pollinator diversity declining in Europe.Science,2006,313 286)，影響訪花昆蟲種群動(dòng)態(tài)的因素引起了人們的關(guān)注，比如近年來，轉(zhuǎn)基因棉花在全球大 面積種植，Bt毒素在花粉中表達(dá)是否影響訪花昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖。研究轉(zhuǎn)基因棉花 對(duì)訪花昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的影響首先需要獲得大批量的、發(fā)育一致的昆蟲供試，因此目 前轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)訪花昆蟲的影響研究?jī)H限于飼養(yǎng)技術(shù)成熟的蜜蜂等傳粉昆蟲。大部分研 究表明轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)蜜蜂沒有毒害作用，但轉(zhuǎn)基因植物對(duì)蜜蜂有否毒害，主要取決于轉(zhuǎn)基 因植物轉(zhuǎn)的基因類型，比如轉(zhuǎn)對(duì)鱗翅目特異的Bt毒素以及葡聚糖降解酶對(duì)蜜蜂無影響，但 蛋白酶抑制劑或幾丁質(zhì)酶抑制劑等有更廣泛靶標(biāo)的基因時(shí)，可能會(huì)有影響(Malone LA and Pham-Delegue ΜΗ. Effects of transgene products on honey bees (Apis me11 ifera)and bumblebees (Bombus sp.). Apidologie，2001，32 :287_304.)。轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)訪花昆蟲的影 響是值得關(guān)注的科學(xué)問題。但目前轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)訪花昆蟲的研究主要集中于蜜蜂等蜂類， 而對(duì)棉田生態(tài)系統(tǒng)中其他專門的訪花昆蟲未見對(duì)其影響的研究報(bào)道，但訪花昆蟲除蜜蜂等 膜翅目昆蟲以外，還有雙翅目和鞘翅目昆蟲等，其中鞘翅目甲蟲是最古老的一類傳粉昆蟲。 另外轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)中性昆蟲的安全性評(píng)價(jià)研究除對(duì)地下害蟲中的彈尾目和原尾目有少量 研究外，對(duì)其他中性昆蟲未見報(bào)道。棉露尾甲Haptoncus luteolus (Erichson)屬鞘翅目露尾甲科，成蟲取食棉花花 粉，同時(shí)又起傳粉作用，是棉田中的專門訪花昆蟲，由于其對(duì)棉花產(chǎn)量不造成影響，因此又 是一種中性昆蟲(羅峰，雷朝亮.棉露尾甲-種有利用前景的傳粉昆蟲.昆蟲知識(shí)，2002， 39(4) :305-306.羅峰，熊強(qiáng)，王健，雷朝亮.溫度對(duì)傳粉甲蟲-棉露尾甲生長(zhǎng)發(fā)育、存活及 繁殖的影響.生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，24 (12) =2789-2793.羅峰，雷朝亮.棉露尾甲發(fā)育起點(diǎn)溫度 和有效積溫的研究.昆蟲知識(shí)，2004，41 (3) =252-254.羅峰.設(shè)施農(nóng)業(yè)傳粉昆蟲-棉露尾 甲的基礎(chǔ)研究[碩士學(xué)位論文].湖北華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004)。棉露尾甲既是棉田中的訪花 昆蟲同時(shí)又是中性昆蟲，因此是轉(zhuǎn)基因棉對(duì)訪花昆蟲和中性昆蟲安全性評(píng)價(jià)的一種很好的 指示性昆蟲。曾有前人為研究棉露尾甲的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性，對(duì)棉露尾甲的人工飼養(yǎng)方法進(jìn) 行了初步研究，但其主要是以絲瓜花瓣作為棉露尾甲的食物和產(chǎn)卵墊，并且每天需從田間 捕捉大量的成蟲，讓其產(chǎn)卵，獲得一致的蟲齡用于研究(羅峰.設(shè)施農(nóng)業(yè)傳粉昆蟲-棉露尾 甲的基礎(chǔ)研究[碩士學(xué)位論文].湖北華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004)，這種方法為短期飼養(yǎng)，并且棉 露尾甲在整個(gè)生長(zhǎng)周期中依賴絲瓜花飼養(yǎng)，顯然這種方法不適合研究轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)棉露尾
3甲的影響。棉露尾甲首先需要取食棉花花粉，然后才能從生物學(xué)、生理學(xué)或分子生物學(xué)等方 面研究轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)其影響；若要研究轉(zhuǎn)基因棉花花粉對(duì)其的長(zhǎng)期累積影響，棉露尾甲需 要長(zhǎng)期取食棉花花粉，經(jīng)多代飼養(yǎng)才能研究對(duì)其的累積影響。前人飼養(yǎng)僅為用絲瓜花進(jìn)行 單代短暫的飼養(yǎng)，而本發(fā)明是建立一種在室內(nèi)可用棉花多代飼養(yǎng)并可用于安評(píng)的方法，本 發(fā)明絕非簡(jiǎn)單的棉花取代絲瓜花，從對(duì)花的處理、保存，以及飼養(yǎng)器具的選擇上均有很大的 改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因棉花安全性的 一種訪花昆蟲棉露尾甲的人工飼養(yǎng)方法。以適合評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)棉露尾甲的影響。一種適用于轉(zhuǎn)基因棉花安全性評(píng)價(jià)的訪花昆蟲棉露尾甲的人工飼養(yǎng)方法，其步驟 如下1)植物的培育采用棉花為棉露尾甲的寄主植物，用0.3%的多菌靈膠懸劑在 20-25°C下浸泡棉種過夜，然后將浸種處理的棉種于塑料大棚中培養(yǎng)使其開花，采集含苞待 放的棉花的花或剛剛開放的棉花的花，去除花瓣，取剩下的雄蕊、雌蕊、花藥和花粉作為棉 露尾甲成蟲飼養(yǎng)的食料，或?qū)⒉杉娜コò甑幕ㄓ?°C下或在-80°C下保存，供應(yīng)淡季之 用；2)成蟲飼養(yǎng)和卵的收集將棉露尾甲成蟲在室內(nèi)置于帶蓋的透明塑料瓶中，設(shè)置 下光源，并在蓋子上罩上黑布，避免成蟲聚集在蓋子上，用步驟1的食料飼養(yǎng)，隔天更換，收 集棉露尾甲成蟲產(chǎn)過卵的花；3)幼蟲飼養(yǎng)和蛹的收集在培養(yǎng)皿底部覆一層含水量為20%的棉田土(預(yù)先過 40目篩，去除石子、瓦片等雜質(zhì))，將棉露尾甲成蟲產(chǎn)過卵的花置于其上，直至其卵孵化和 幼蟲化蛹，每天觀察培養(yǎng)皿內(nèi)化蛹情況，用鑷子輕輕撥開泥土，取出棉露尾甲的蛹，將棉露 尾甲的蛹轉(zhuǎn)移到含水量為20%的棉田土的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，獲得棉露尾甲成蟲。成蟲的保種及單對(duì)飼養(yǎng)棉露尾甲的繁殖保種采用容積為500ml帶蓋的塑料瓶。 其單對(duì)飼養(yǎng)，采用容積為1. 5ml的離心管。產(chǎn)卵量和卵孵化率的觀察；用帶花瓣的花飼養(yǎng)成蟲導(dǎo)致成蟲將卵產(chǎn)于花瓣上，花 瓣蔫后將無法觀察到卵量和卵的孵化，本發(fā)明用去除花瓣的棉花來飼養(yǎng)成蟲，其產(chǎn)卵于雄 蕊或雌蕊等部分便于觀察卵的情況。去除花瓣時(shí)動(dòng)作要輕，以免抖落花粉。本發(fā)明的有益效果1)通過本發(fā)明所提出的用于人工飼養(yǎng)棉露尾甲的方法，成功實(shí)現(xiàn)了用棉花長(zhǎng)期飼 養(yǎng)棉露尾甲，有助于研究轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)其影響以及累積效應(yīng)，克服了以往利用絲瓜花飼養(yǎng)， 不能研究轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)其影響，更不可能實(shí)現(xiàn)對(duì)其累積效應(yīng)的研究；2)本發(fā)明中所提出的飼養(yǎng)棉露尾甲的飼料為成蟲為花粉，幼蟲為腐爛的花朵。 花粉可在4°C短期保存一周，在-80°C可保存半年左右，保存的花粉有效的補(bǔ)充了淡季的需 要。因此可實(shí)現(xiàn)全年度、全氣候的人工飼養(yǎng)，保證了試驗(yàn)的需要。本發(fā)明用棉花多代飼養(yǎng)后的孵化率、化蛹率均為90%以上，羽化率也接近80%， 可見本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)棉露尾甲的繼代飼養(yǎng)。


圖1 是轉(zhuǎn)基因棉花和非轉(zhuǎn)基因棉花飼養(yǎng)棉露尾甲生存曲線比較圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (棉露尾甲種群的建立)從田間寄主棉花、絲瓜、南瓜等花中采集棉露尾甲，在室內(nèi)置于小口帶蓋的透明塑 料瓶中，用去除花瓣的棉花花朵(或絲瓜花)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為恒溫30 士 0.5°C、光照周 期16L :8D、濕度80 士 5%。大約500ml的瓶中放置棉花約十朵(絲瓜花月4朵)，成蟲約 100只。成蟲取食棉花花粉，并產(chǎn)卵于雄蕊或雌蕊或花瓣等部位。隔天更換花朵，并收集產(chǎn) 過卵的花，直至產(chǎn)卵期結(jié)束。將產(chǎn)過卵的花置于培養(yǎng)皿中(玻璃或塑料材質(zhì))，培養(yǎng)皿底部 覆一層含水量為20%的土，幼蟲取食腐爛的花，一段時(shí)間后可見培養(yǎng)皿底部白色的蛹。將發(fā) 育一致的蛹挑出，置于另外底部覆土( 土壤含水量為20%)的培養(yǎng)皿中，2-3天后可獲得大 量的成蟲。發(fā)育一致的成蟲置于同一個(gè)塑料瓶中飼養(yǎng)。經(jīng)多代飼養(yǎng)可建立棉露尾甲的實(shí)驗(yàn) 種群。從表1可以看出，用棉花飼養(yǎng)的棉露尾甲的幼蟲和成蟲培養(yǎng)周期(昆蟲學(xué)稱歷期) 比用絲瓜花飼養(yǎng)的要長(zhǎng)，但孵化率和羽化率卻比用絲瓜花飼養(yǎng)的棉露尾甲要高，可見用棉 花飼養(yǎng)的棉露尾甲雖然延長(zhǎng)了發(fā)育歷期，卻有利于其繁殖。因此用棉花飼養(yǎng)棉露尾甲可達(dá) 到周年繼代飼養(yǎng)的目的。表1不同寄主植物的花對(duì)棉露尾甲的生物學(xué)特性的影響 實(shí)施例2:(應(yīng)用實(shí)施例)試驗(yàn)材料與方法試驗(yàn)種群構(gòu)建按實(shí)施例1中描述方法，分別用轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因棉花花粉飼養(yǎng) 棉露尾甲三代以上，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因棉花和非轉(zhuǎn)基因棉花棉露尾甲試驗(yàn)種群。生物學(xué)特性比較每天觀察每個(gè)試驗(yàn)種群卵、幼蟲和蛹，并記錄他們的發(fā)育時(shí)間、孵化率、化蛹率和羽化率。110只幼蟲和84只蛹用于非轉(zhuǎn)基因棉花棉露尾甲種群的觀察， 101只幼蟲和58只蛹用于轉(zhuǎn)基因棉花棉露尾甲種群的觀察，兩個(gè)種群均用了 84只卵用于卵 期參數(shù)觀察。為了觀察成蟲的歷期和平均單雌產(chǎn)卵量，采用單對(duì)交配法。一對(duì)剛羽化的處 女雌雌蟲置于一小塑料管中(Φ1Χ4( πι)進(jìn)行交配觀察。非轉(zhuǎn)基因棉花棉露尾甲種群共觀 察了 22對(duì)，轉(zhuǎn)基因棉花棉露尾甲種群共觀察了 28對(duì)，隔天更換飼料，并觀察成蟲的死亡率 和卵孵化率，記錄成蟲歷期，通過卵是否孵化來檢驗(yàn)成蟲交配的成功與否。生存曲線的觀察轉(zhuǎn)基因棉花和非轉(zhuǎn)基因棉花棉露尾甲試驗(yàn)種群，各選取100只 初產(chǎn)的卵，置于帶土的培養(yǎng)皿中(土壤含水量為20% )，卵孵化后幼蟲取食腐爛的花并化 蛹，羽化后的成蟲轉(zhuǎn)移至塑料管中并飼喂新鮮花粉，兩天更換一次。每天觀察并記錄棉露尾 甲的死亡數(shù)。數(shù)據(jù)分析在進(jìn)行分析之前對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)需進(jìn)行檢驗(yàn)，并用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方 差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)。t測(cè)驗(yàn)分析成蟲歷期和平均單雌產(chǎn)卵量；U測(cè)驗(yàn)分析卵、幼蟲和蛹 歷期；卡方分析卵孵化率、化蛹率和羽化率；采用Kaplan-Meier程序制作生存曲線，并用 Breslow測(cè)驗(yàn)分析兩種曲線的差異性。試驗(yàn)結(jié)果生物學(xué)參數(shù)具體試驗(yàn)結(jié)果見表2。轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因棉花花粉飼養(yǎng) 的棉露尾甲卵孵化率和交配率均達(dá)100%，化蛹率和羽化率分別為95. 65%和67. 24%, 93. 75%和77. 38%，但兩種群間不存在顯著差異。平均單雌產(chǎn)卵量分別為16. 11和17. 91 粒，兩種群間不存在顯著差異。兩種群各蟲態(tài)的歷期也不存在顯著差異。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因 棉花在短期內(nèi)沒有對(duì)棉露尾甲的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖造成不良影響。生存曲線結(jié)果見圖1。兩個(gè)種群的生存曲線顯示，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因棉花飼養(yǎng)棉露 尾甲生存周期分別為45和44天。轉(zhuǎn)基因棉花飼養(yǎng)棉露尾甲在10-30天的死亡率略高于非 轉(zhuǎn)基因棉花。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示兩個(gè)曲線不存在顯著性差異。表2轉(zhuǎn)基因棉花和非轉(zhuǎn)基因棉花飼養(yǎng)棉露尾甲生物學(xué)參數(shù)比較
權(quán)利要求
一種適用于轉(zhuǎn)基因棉花安全性評(píng)價(jià)的訪花昆蟲棉露尾甲的人工飼養(yǎng)方法，其步驟如下1)寄主植物的培育用0.3％的多菌靈膠懸劑在20 25℃下浸泡棉種過夜，然后將浸種處理的棉種于塑料大棚中培養(yǎng)使其開花，采集花朵，去除花瓣，取剩下的雄蕊、雌蕊、花藥和花粉作為棉露尾甲成蟲飼養(yǎng)的食料，或?qū)⒉杉娜コò甑幕ㄓ?℃下或在 80℃下保存，供應(yīng)淡季之用；2)成蟲飼養(yǎng)和卵的收集將棉露尾甲成蟲在室內(nèi)置于帶蓋的透明塑料瓶中，用步驟1的食料飼養(yǎng)，隔天更換，飼養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為30士0.5℃，光/暗周期為16∶8，光照強(qiáng)度為3000Lux，相對(duì)濕度為80士5％，收集棉露尾甲成蟲產(chǎn)過卵的花；3)幼蟲飼養(yǎng)和蛹的收集在培養(yǎng)皿底部覆一層含水量為20％的棉田土，將棉露尾甲成蟲產(chǎn)過卵的花置于其上，直至其卵的孵化和化蛹，每天觀察培養(yǎng)皿內(nèi)化蛹情況，用鑷子輕輕撥開泥土，取出棉露尾甲的蛹，將棉露尾甲的蛹轉(zhuǎn)移到含水量為20％的棉田土的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，獲得棉露尾甲成蟲。
2.按權(quán)利要求1所述的飼養(yǎng)方法，其特征在于，采花后立即用含水的脫脂棉包住花托， 保持其新鮮度。
3.按權(quán)利要求1所述的飼養(yǎng)方法，其特征在于，棉露尾甲的繁殖保種采用容積為500ml 帶蓋的塑料瓶。
4.按權(quán)利要求1所述的飼養(yǎng)方法，其特征在于，棉露尾甲的單對(duì)飼養(yǎng)，采用容積為 1. 5ml的離心管。
5.按權(quán)利要求1所述的飼養(yǎng)方法，其特征在于，采用含苞待放的棉花的花或剛剛開放 的棉花的花。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)昆蟲學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種訪花昆蟲棉露尾甲的飼養(yǎng)方法，屬昆蟲飼養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。該發(fā)明提出了用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因棉花安全性的棉露尾甲的人工飼養(yǎng)方法，包括寄主植物的培育，成蟲的飼養(yǎng)和卵的收集，幼蟲的飼養(yǎng)和蛹的收集等步驟。成功實(shí)現(xiàn)了周年度和全天候的用棉花長(zhǎng)期飼養(yǎng)棉露尾甲，保證了轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)的需要?？朔艘酝媒z瓜花飼養(yǎng)，花源少，不能周年供應(yīng)，影響棉露尾甲的大量繁殖，亦影響到轉(zhuǎn)基因棉花的安全評(píng)價(jià)受試?yán)ハx的提供。本發(fā)明主要用于轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)中性訪花昆蟲棉露尾甲生物學(xué)及生理生化特性影響的試驗(yàn)研究，同時(shí)還可用于轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)其長(zhǎng)期累積效應(yīng)的研究。
文檔編號(hào)A01K67/033GK101911925SQ20101022139
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者牛長(zhǎng)纓, 羅峰, 陳利珍, 雷朝亮, 馬偉華 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)