專利名稱：：利用棉花基因GbF3H改變花瓣顏色的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于棉花基因工程
技術領域：
。具體涉及一種分離、克隆的(ibF;3H基因，該基因被證實能夠改變棉花花瓣顏色的。所述的基因(^bFIBH與植物類黃酮代謝及花青素的合成相關。通過RNAi抑制該基因的表達可以顯著減少棉花花瓣的花青素含量，使花色變淡；而超量表達該基因可以提高棉花花瓣的花青素含量。利用本發(fā)明的基因渴望改變植物花瓣的顏色，改良花卉的顏色，同時可以開發(fā)出與花色相關的分子標記。
背景技術：
：植物的花色是植物的重要特征之一，在蟲媒異花授粉植物中起到誘導傳粉昆蟲的作用，同時多彩的花色也增加了植物的觀賞性，花色還是許多植物研究中的重要的選擇標記和目標性狀。豐富多彩的花色是自然進化和人為選擇的結果。人們對花色的研究已有很久的歷史了，花青素是大多數(shù)植物花瓣顏色的的主要決定因子(Grotewold等，TheGeneticsandBiochemistryofFloralPigments，Annu.Rev.PlantBiol.2006.57761-80)，而花青素是一種類黃酮類物質，類黃酮是植物體內主要的次生物質之一(D‘Auria等，ThesecondarymetabolismofArabidopsisthalianagrowinglikeaweed,Curr.Opin.PlantBiol.2005.8，308-316.)。隨著生物學和化學的發(fā)展，對類黃酮的種類、化學性質以及其生物代謝路徑都有了很大的研究進展。在一些模式植物中花青素的生物合成已經研究得非常清楚(L印iniec等，GeneticsandBiochemistryofSeedFlavonoids,Annu.Rev.PlantBiol.2006.57:405-30)，許多相關的基因也已經被克隆和驗證。F3H(flavanone3-hydroXylase，黃烷酮3-羥化酶)基因是花青素生物合成上游的關鍵基因(Britsch等，Molecularcloning,sequenceanalysis,andinvitroexpressionofflavanone3beta-hydroxylasefromPetuniahybrida.JBiolChem.1992.2675380-5387)，它催化由黃烷酮到二氫黃酮醇的過程。在其他植物中的研究表明F!3H基因的缺失或抑制會直接影響到植物花色的表型(Martin等，ControlofanthocyaninbiosynthesisinflowersofAntirrhinummajus.1991.PlantJ.1,37-49·)。棉花是一種重要的經濟作物，同時也是生物技術應用范圍比較廣的農作物。通過對棉花基因改造而得到的抗蟲棉給傳統(tǒng)的農業(yè)帶來了很多希望和生機。棉花的生物成分和基因組都很復雜，對棉花的基因克隆和功能驗證也是比較困難的。目前已有的幾個功能基因的研究都是和纖維發(fā)育相關(Luo等，GhDET2，asteroid5α-reductase,playsanimportantroleincottonfibercellinitiationandelongation.2007.PlantJ.51:419-430)。而直接與棉花外部形態(tài)，特別是花色相關基因的克隆還未見報道。類黃酮類相關基因在棉花纖維發(fā)育時期都有表達，申請人本發(fā)明提出之前的研究就表明海島棉GbF3H基因在棉花纖維發(fā)育時期高效表達(Tu等，Genesexpressionanalysesofsea-islandcotton(GossypiumbarbadenseL.)duringfiberdevelopment,2007.PlantCellRep.26:1309-1320)，而在陸地棉纖維發(fā)育的基因文庫中，F(xiàn)3H基因的表達豐度也很高(Yang等Accumulationofgenome-specifictranscripts,transcriptionfactorsandphytohormonalregulatorsduringearlystagesoffibercelldevelopmentinallotetraploidcotton.PlantJ.2006.47:761-75.)，F(xiàn)3H也是彩棉色素合成的關鍵基因(Xiao等Cottonflavonoidstructuralgenesrelatedtothepigmentationinbrownfibers.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications.2007.35873-78)。在本發(fā)明提出之前申請人從纖維發(fā)育的文庫中得到一條F!3H基因序列，通過轉基因驗證表明F!3H基因與棉花的花色合成有關，對棉花的花色合成的研究以及轉基因棉花的分子標記開發(fā)都有很重要的意義。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是從海島棉中分離克隆一個包含該功能蛋白同源基因完整編碼區(qū)段的DNA片段(在本發(fā)明中所述“DNA片段”與“核苷酸序列”以及“DNA分子”同義，下同)，利用這個基因可以改變花色，該基因還可以作為轉基因的形態(tài)標記應用。對這個基因編碼的蛋白序列進行分析表明它與擬南芥及其他植物的F!3H基因相似性很高，因此被命名為(MH基因。本發(fā)明涉及分離和應用一種包含(ibF3H基因的DNA片段，該片段賦予植物花青素合成的能力。其中，所述的(^bFIBH基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQNO1中第82-1188位所示的DNA序列；或2)編碼與1)編碼的蛋白質相同的蛋白質的DNA序列?？梢圆捎靡呀浛寺〉?ibF3H基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，也可以采用PCR(polymerasechainreaction)技術，從基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發(fā)明的(ibF3H基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術，可以分離得到包含(ibF3H基因的序列，將這一序列與任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體連接后轉化植物，可獲得花瓣花青素含量較高的轉基因植株；而將這一序列的一部分序列作為靶標構建的可在植物體內產生RNA干涉載體轉化植物，可獲得花青素含量降低的植物。本發(fā)明的基因在構建到植物表達載體中時，可以在其轉錄起始核苷酸前加上任何一種強啟動子、特異啟動子或誘導型啟動子。本發(fā)明的基因在構建到植物表達載體中時，也可使用增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的翻譯。本發(fā)明的基因中的任意一段都可以作為靶標設計基于發(fā)卡環(huán)結構的植物RNAi載體或基于miRNA的植物干涉載體來轉化植物抑制該基因的表達從而改變花青素的含量而改變花色。本發(fā)明可以通過以上兩種方式構建到植物的表達載體中，可以在其轉錄起始核苷酸前加上花瓣特異啟動子來作為轉基因的形態(tài)標記。攜帶有本發(fā)明(ibF3H基因的表達載體或含有其片段的RNAi載體可通過使用Ti質粒，植物病毒載體，直接DNA轉化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術方法導入植物細胞(Weissbach,1998,MethodforPlantMolecularBiologyVIILAcademyPressiNewYork，pp.411-463；GeisersonandCorey，1998，PlantMolecularBiology(2ndEdition)?？墒褂冒ū景l(fā)明的(ibF3H基因的表達載體轉化的宿主是包括棉花在內多種植物，培育類黃酮和花青素含量高的植物品種；可使用包括本發(fā)明的(ibF3H基因片段為靶標的RNAi載體轉化宿主棉花，可用于培育不同花色的棉花品種，或作為轉基因的形態(tài)標記?；蜃鳛榛ɑ茴伾牧蓟虻膽玫鹊?。本發(fā)明基因與類黃酮的合成相關，因此可將本發(fā)明的基因應用于改變棉花的類黃酮代謝來開發(fā)新品種和開發(fā)新標記。下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。序列表SEQIDNO:1顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有(ibF3H基因的核苷酸序列。序列表SEQIDNO2是(ibF3H基因編碼的氨基酸序列，它編碼368個氨基酸。圖1采用ClustalW軟件(公開使用軟件)對(AF3H基因序列分析結果。表明GbF3H與陸地棉中3條序列同源性很高。Ghl:GI74273629SequencesourceGossypiumhirsutum陸地棉(白色棉)；Gh2:GI121755803SequencesourceGossypiumhirsutum陸地棉(棕色棉T586)；Gh3=GI289470637SequencesourceGossypiumhirsutum陸地棉(綠色棉)；Gb:GI119657097SequencesourceGossypiumbarbadense海島棉；Ipb:GI4512593SequencesourceIpomoeabatatas(sweetpotato)甘暮；Eg:GI50788697SequencesourceEustomagrandiflorum洋桔梗；Nt:GI164454783SequencesourceNicotianatabacum(commontobacco)煙草；Ac:GI219944305SequencesourceActinidiachinensis稱猴桃；Cit:GI4126401SequencesourceCitrussinensis舌甘g；Ph:GI2465434SequencesourcePetuniaχhybridaM^Ψ;>1:GI134039064SequencesourceDimocarpuslongan龍目艮圖2用Real-timePCR檢測(ibF3H基因在棉花不同組織中的表達水平?；蛟谒x取的組織中均有一定量的表達，在花瓣的表達量相對較高，在開花后5天的胚珠和纖維中也有較高的表達，隨著纖維的發(fā)育表達量下降。組織依次是1.根；2.子葉；3.真葉；4.莖；5.花瓣；6.-3DPA胚珠；7.ODPA胚珠；8.5DPA胚珠；9.5DPA纖維；10.IODPA纖維；11.15DPA纖維。各組織(ibF3H基因相對表達量以根組織為參照(即設定為1)，(ihUB7為內參基因。圖3本發(fā)明的超量表達載體p3k_GbF3H的構建示意圖。將(ibF3H全長基因經酶切鏈接反應插入CaMV35S啟動子后的情況。圖4本發(fā)明的RNAi載體pHellSgate4-F3Hi的構建示意圖。將(ibF3H部分基因片段Q61-707bp)經重組反應插入pHellsgate4載體。圖5轉基因T2代棉花分析，RNAi的植株花瓣顏色明顯變淡，而超表達株系與對照相比沒有顯著的變化，花青素定量分析表明對照的花青素含量是RNAi株系的3-4倍，而超表達株系的花青素含量比對照要高，但是差異不顯著。圖中a)轉基因拷貝數(shù)分析；b)對應的表型和花青素含量分析。GN，為轉基因陰性對照；Ril、Ri2、Ri3，分別為RNAi的3個T2株系；0x1、0x2、0x3，分別為3個超表達的株系。圖6:GN，Ri2、Ri3和0xl、0x2中GbF3H的基因表達分析。圖中GN為轉基因陰性對照；Ri2、Ri3為RNAi的T2株系；0x1、0x2為超表達的株系。圖7=RNAi植株與彩棉T586雜交后代分析，轉基因陽性植株花青素含量明顯降低，花色變淺。圖中T，為彩棉Τ586；Ri為RNAi株系；TF1、TF2、TF3為Τ586與Ri雜交后代。圖8:是本發(fā)明克隆的(ibF3H基因的核苷酸序列，下劃線部分為該基因的編碼區(qū)(82-1188bp).具體實施例方式以下實施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離克隆包含有(ibF3H基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，以及驗證(ibF3H基因功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。實施例1:(ibF3H基因分離克隆及其在棉花不同組織的表達特性本申請人的作物遺傳改良國家重點實驗室的前期工作中從建立的海島棉纖維發(fā)育文庫中分離出一條與其他植物F3H高度同源的表達序列標簽EST(詳細見Tu等Genesexpressionanalysesofsea-islandcotton(GossypiumbarbadenseL.)duringfiberdevelopment.PlantCellRep.2007,26:1309-1320)與其他物種F3H基因的進化分析(見圖la)，生物信息學分析表明，該EST包含一個完整的0RF，將其命名為(ibF3H，其在NCBI基因庫中的登錄號為DQ912945，該基因在纖維發(fā)育時期高效表達，進一步分析表明(AF3H與陸地棉中3條序列同源性很高(見圖lb)。從海島棉3-79(其為國際通用的棉花海島棉標準系，可以從中國農科院棉花研究所的種質資源庫索取)中提取ODPA胚珠總RNA(提取方法t艮據(jù)Zhu等AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005，31.1657-1659.)，利用反轉錄酶SuperscriptIII(購自Invitrogen公司，美國)將其反轉錄合成cDNA，反應條件為65°C5min,50°C60min,70°ClOmin。用引物F3HF(5'AGGTTTAAGTTCAGAGTCATAAG3‘)和F3HR(5，TAAGGATTGAAGAATAGTTACAG3，)擴增出GbF3H基因的全長cDNA(1433bp)。PCR反應條件為94°C預變性3min;94°C30sec，56°C30sec,72°C2min，32個循環(huán)；72°C延伸lOmin。將擴增獲得的PCR產物連入pGEM_T載體(購自Promega公司，美國)，篩選陽性克隆并測序，獲得所需的基因全長cDNA。以海島棉3-79為材料，提取以下11個不同組織的RNA，用Rea-timePCR檢測(ibF3H基因的表達水平。選取的11個組織分別是1.根；2.子葉；3.真葉；4.莖；5.花瓣；6.-3DPA胚珠；7.ODPA胚珠；8.OTPA胚珠；9.5DPA纖維；10.IODPA纖維；11.15DPA纖維。棉花總RNA提取方法根據(jù)上述Zhu等(AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005,31.1657-1659.)發(fā)表的文獻，RNA提取完成后后用DNaseI(購自!Iomega公司)處理，RNA完整性通過1.2%(w/v)瓊脂糖膠(EtBr)電泳檢測(5V/cm)。核酸濃度的測定在BeckmanDU800spectrophotometer上進行。RNA260/280比值在1.9到2.1之間，260/230比值大于2.O的RNA用于下一步的分析。cDNA的合成是以3μg總RNA為模版，與1μ1500μg/mloligo-dT(15)引物(購自Promega公司，美國)，1μIlOmMdNTP,DEPC_water混合，總體積為12μ1；然后65°C變性5min冰上驟冷；再加入8μ1含有4μ1RTbuffer,2μ10.IMdithiothreitol,40unitsofRNasinRibonucleaseInhibitor(Promega),禾口200unitsofSuperscriptIIIRT(購自Invitrogen公司，美國)的混合液；50°C溫浴Ih合成第一鏈；反應結束后75°C處理15min使SuperscriptIIIRT失活。每份cDNA稀釋到300μ1后-20°C保存待用。以上述反轉錄合成的cDNA為模板，用引物F3Hin-f(5‘TGGTTTCATCGTCTCCAGCC3‘)和F3Hin_r(5‘CATGGCCTCTGACAACACCTC3')對(ibF3H基因進行特異的PCR擴增(擴增產物長204bp)。同時用引物UB7_f(5‘GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3‘)和UB7_R(5‘CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3‘)對棉花(iMbiquitin(GenBank登陸號DQ116441)基因做特異擴增(擴增產物長I^bp)，以作為內對照進行相對定量分析。定量PCR儀為ABI7500，定量PCR試劑購自Bio-Rad公司。PCR反應體系OOμ1)包括1μ1稀釋后的cDNA(等于IOng起始總RNA)，10y12XPCRMasterMix，200nM的引物。反應條件為95°C30sec；95°C5sec，60°C!35sec，40個循環(huán)。反應過程中進行熒光檢測實時定量分析。結果表明本發(fā)明克隆的基因(^bFIBH在所選取的組織中均有一定量的表達，但在花瓣的表達量相對較高，而且在開花后5天的胚珠和纖維中也有較高的表達，隨著纖維的發(fā)育表達量下降(見圖2)。實施例2超量表達載體及RNAi的構建和轉化為了驗證(ibF3H基因在棉花中的功能，申請人構建了超量表達和RNAi載體轉化棉花。根據(jù)實施例1中得到(ibF3HcDNA設計超表達引物，在引物兩端分別加上BamHI和^ilI的酶切位點及保護堿基，分別將該引物命名為引物F3Hoef和F3Hoer，再以(ibF3H基因的cDNA為模板進行PCR擴增，得到的PCR產物通過酶切鏈接的方法連入超表達載體p3k-GbF3H(中間載體是pCAMBIA2300，澳大利亞CAMBIA實驗室贈送，將該載體上的CaMV35S啟動子通過酶切連接反向整合到pCAMBIA2300的多克隆位點上，即得到本發(fā)明的超表達載體p3k-GbF3H)。構建的超量表達載體p3k-GbF3H見(圖2)。根據(jù)(ibF3H基因與陸地棉F3H的比對結果在同源區(qū)設計RNAi引物，在引物的兩端分別加上用于重組的attB位點序列及保護堿基，分別將該引物命名為引物F3Hrif和引物F3Hrir，再以實施例1中得到(ibF3H基因cDNA為模板進行PCR擴增，得到的產物通過BP重組反應導入RNAi載體pHellsgate4(重組酶購自hvitrogen公司，美國；RNAi載體見Wesley等Constructdesignforefficient,effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants.PlantJ.2001.27,581-590.)，構建的RNAi載體pHellsgate4_F3Hi見(圖4)。引物序列如下F3Hoef5'CTCGGATCCAGGTTTAAGTTCAGAGTCATAAG3‘；F3Hoer5'CTGGTCGACTAAGGATTGAAGAATAGTTACAG3‘；F3Hrif5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCTGTTGAGGCTTGTGAGGAT3‘；F3Hrir5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGGTTGAGGGCATTTAG3‘。將構建的載體轉化農桿菌菌株LBA4404(OctopineTi-plasmiddeletionmutantsofAgrobacteriumtumefacienswithemphasisontherightsideoftheT-region,Plasmid,1982，7:15-)，再通過農桿菌介導的轉化方法轉化棉花，所采用的轉化受體材料為YZ-1，此材料是本實驗室經過大量的篩選發(fā)現(xiàn)的一個具有很高胚胎發(fā)生能力的材料，農桿菌介導的轉化棉花的轉化方法和程序參照Jin等建立的高效轉化體系(Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum，2006，50:519-524；Anefficientgraftingsystemfortransgenicplantrecoveryincotton(GossypiumhirsutumL.).PlantCelliTissueandOrganCulture,85:181-185,2006；FactorsaffectingstabletransformationandpIantregenerationduringtransformingembryogeniccallusofUplandcotton(GossypiumhirsutumL.)viaAgrobacteriumtumefaciens,PlantCell,TissueandOrganCulture,81:229-237,2005)，并作了相應的調整和修改，具體方法和流程如下1、無菌苗的培養(yǎng)將將棉花品系H-I(參見Jin等的文獻(Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum,2006，50:519-524)棉籽殼去掉，用0.1/100的升汞滅菌IOmin,無菌水沖洗三遍，接種于無菌苗培養(yǎng)基上(配方如下1/2MS大量元素+葡萄糖15g/L+植物膠phytagel(購自sigma公司，美國)2.5g/L)，在暗培養(yǎng)3-6天。2.農桿菌的活化和保存2.1準備農桿菌LBA4404，制備含卡那霉素50mg/L的MGL液體培養(yǎng)基(配方胰化蛋白胨5g/L，氯化鈉5g/L，MgSO4.7H200.lg/L，KH2PO4O.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L，調pH至7.0)，無菌三角瓶，LB(固、液)培養(yǎng)基(含卡那霉素50mg/L)，滅菌甘油，無菌槍頭，無菌1.&nL離心管。2.2操作2.2.1活化，懸浮從超低溫冰箱內取出保存菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上劃線，26.5°C暗培養(yǎng)36-4，待皿內長出清晰的單菌落，挑取單菌落在另外的LB平皿劃線，26.5°C暗培養(yǎng)36-4,待皿內長出足夠的菌落結束培養(yǎng)，把培養(yǎng)基表面菌落刮入三角瓶內的MGL培養(yǎng)基中，27°C、200rpm搖2h，OD值在0.5-1.5之間即可用于侵染。2.2.2菌株的保存從培養(yǎng)皿內挑取單菌落接于LB液體培養(yǎng)基中48h，按菌液和甘油體積比為11加入1.5mL離心管混勻，-70°c保存。3.浸染，共培養(yǎng)3.1準備暗培養(yǎng)5天左右幼嫩健壯的TL-Y幼苗，經活化的農桿菌，無菌培養(yǎng)皿和無菌濾紙寸。3.2操作無菌條件下將YL-Y幼苗下胚軸用鋒利的刀片切成0.5-lcm長的切段，轉入到經活化的農桿菌菌液中，攪勻，靜置5-lOmin，倒掉菌液，濾紙吸干殘余菌液，吹5min使表面稍為干燥，分散布于墊有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中(配方MS無機鹽+有機物+2，4-D0.Img/L+KT0.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,pH7.0)，20°C暗培養(yǎng)38_42h。4.愈傷組織的誘導將侵染共培養(yǎng)后的下胚軸切段接種于誘導培養(yǎng)基上(配方如下MS無機鹽+B5有機物+2,4-D0.lmg/L+KT0.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，pH5.8)。5、非胚性愈傷組織的增殖非胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)基如下所示MS無機鹽(硝酸鉀加倍，硝酸銨減8半)+B5有機物+2,4-DO.05mg/L+KT0.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g//L,pH5.8。6、愈傷組織的分化愈傷組織經繼代(一個月繼代一次)幾次后，有的愈傷組織轉成米粒狀顆粒，將其轉入分化培養(yǎng)基上(配方MS基本培養(yǎng)基+B5有機物+激動素(KT)0.15mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，調pH至5.8)，進一步分化成胚狀體。7、胚性愈傷組織的繼代胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)基如下所示MS無機鹽(其中硝酸鉀加倍，硝酸銨減半)+B5有機物+ΚΤ0.15mg/L+IBA0.5mg/L+Gln(谷胺酰胺)1.Omg/L+天冬酰胺(Asn)O.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytage12.5g/L，pH5.8。8、成苗生根培養(yǎng)將分化出的小苗繼代到1/2MS培養(yǎng)基中成苗生長培養(yǎng)基上(配方1/2MS無機鹽+B5有機物+葡萄糖15g/L+phytagel2.5g/L，pH5.8)。9、煉苗移栽將生根良好的小苗揭開三角瓶封口膜，煉苗2-3天，然后移栽到小土缽中，遮蔭緩苗一周左右移栽大田。附MS培養(yǎng)基母液配制1.配制大量元素時各種藥品分別稱量，分別充分溶解再逐一加到容量瓶中(最后加入CaCl2否則容易產生沉淀)，定容到一升。2.配制微量元素時幾種極微量藥品先可以配成一級母液(濃縮10000倍)，再稀釋成二級母液(濃縮100倍)，母液配制完畢后放置于室溫下IOh以上，看是否有沉淀產生，然后才能使用。3.配制鐵鹽時，兩種鹽用熱水分別溶解，然后混合，放置于室溫下IOh以上看是否有沉淀產生，然后才能使用。4.各種生長激素一般可以用lmol/L的NaOH或HCl溶解后，再定容。5.配制&有機物時要用無菌水來配制，一次不要配太大體積，及時用完以防污染6.各種母液配制好后應存放在4°C冰箱中，發(fā)現(xiàn)有沉淀后，不得使用。大量元素(20倍)母液(g/L)KN0338；NH3N0333；MgS04·7H20(無水MgS04)74(3.8)；KH2P043.4；CaCl2·2H20(無水CaCl2).8(6.6)。微量元素(100倍)母液(g/L)CoC12·6H200.0025；CuS04·5H200.0025；H3B030.62；KI0.083；MnS04·4H202.23；NaM04·2H20ZnS04·7H20鐵鹽(100倍)母液(g/L)FeSO4·7H20Na2EDTAB5有機物VBl(硫胺素)VB5(鹽酸吡哆醇)VB6(煙酸)肌醇甘氨酸10mg/L；lmg/L；lmg/L；100mg/L；2mg/L。2.78；3.73。0.025；0.86。實施例4:GbF3H基因基因超量表達及RNAi轉基因T2代家系的表型變化GbF3H基因超量表達及RNAi轉基因各得3個T2代家系，Southern結果顯示有兩個RNAi和一個超表達家系為單拷貝(見圖5a)。表型觀察可見RNAi的植株花瓣顏色明顯變淡，而超表達株系與對照相比沒有顯著的變化，花青素提取分析也顯示了對應的結果，對花青素進行定量分析表明對照的花青素含量是RNAi株系的3-4倍，而超表達株系的花青素含量比對照要高，但是差異不顯著(見圖恥)。對T2家系都是取的家系混合樣，結果顯示花青素的含量與花瓣的表型是相關聯(lián)的。選取轉基因株系提取RNA，RT-PCR表明，本發(fā)明克隆的(ibF3H基因表達水平與花青素的含量也是相關的(操作與實施例3相關試驗相同)(見圖6)。實驗表明(ibF3H基因是一個與花青素合成相關的基因，通過遺傳操作(ibF3H基因基因可以改變花瓣的花青素含量和花色。對其進行RNAi抑制的效果更顯著，而(ibFIBH基因本身在花瓣中高效表達的，所以對其超表達的結果不是很顯著。DNA提取和Southern實驗參照J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002版。花青素的提取和測量參照Mancinelli等(Mancinelli等Thephotoregulationofanthocyaninsynthesis.IX.Thephotosensitivityoftheresponseindarkandlightgrowntomatoseedlings.PlantCellPhysiol.1984,25:93-105)報道的方法。對T2家系都是取的家系混合樣，每個株系至少取3-5個單株。稱取開花當天或開花后一天的花瓣0.5g于液氮中，用研缽研磨成粉，加5ml冷的酸化甲醇(1%HC1，V/V)，于4°C振蕩抽提48h。低溫離心，取Iml上清用分光光度計(BaCkmanDU800)檢測530nm的OD值即為花青素的相對含量值。實施例5:GbF3H基因構建的RNAi載體可以用于花色的改良抑制(ibF3H基因基因的表達可以明顯改變花瓣的顏色，用(ibF3H基因基因干涉的植株與彩棉T586(陸地棉標準系TM-I的近等基因系，具有多個標志性狀，從中國農科院棉花研究所棉花種質資源庫索取)雜交，雜交后代的分離群體中，用PCR檢測轉基因標記NPTII基因，DNA提取同實施例4和PCR用的引物為NPTII-f(5'CGTAAAGCACGAGGAAGCG3')andNPTII-r(5'GGCACAACAGACAATCGGC3')。結果顯示轉基因棉花陽性植株與花瓣的表型及花青素的含量變化是共分離的(圖7)，轉基因棉花陽性植株花青素含量明顯降低，花色變淺。由此可見本發(fā)明克隆的(^bFIBH基因及其構建的RNAi載體可以用于花色的改良ο10權利要求1.賦予植物花青素合成能力的(^bFIBH基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDN0:1中第82-1188位所示的DNA序列；或編碼與1)編碼的蛋白質相同的蛋白質的DNA序列。2.賦予植物花青素合成能力的(AF3H基因，其編碼的氨基酸序列如序列表SEQIDNO2所示，它編碼368個氨基酸。3.一種RNAi表達載體pHellsgate4-F3Hi，其特征在于，將權利要求1或2所述的(ibF3H基因的第沈1_707位DNA片段經重組反應插入到載體pHellsgatM中而成，其包含有序列表SEQIDNO:1中第沈1-707位堿基對所示的核苷酸序列。4.權利要求1所述的基因在調控植物花色中的應用。5.權利要求4的應用，其中包括在調控棉花花色中的應用。全文摘要本發(fā)明屬于植物基因工程
技術領域：
。具體涉及一種分離、克隆的GbF3H基因，功能驗證表明該基因是一種能夠改變棉花花瓣顏色的功能基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，它編碼的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，編碼368個氨基酸。所述的基因GbF3H與植物類黃酮代謝及花青素的合成相關。通過RNAi抑制該基因的表達可以顯著減少棉花花瓣的花青素含量，使花色變淡；而超量表達該基因可以提高棉花花瓣的花青素含量。利用本發(fā)明克隆的通過轉化可能改變植物花瓣的顏色，也可以應用于花卉顏色的改良，同時有望開發(fā)出花色相關的分子標記。文檔編號C12N15/82GK102485897SQ201010582448公開日2012年6月6日申請日期2010年12月6日優(yōu)先權日2010年12月6日發(fā)明者張獻龍,朱龍付,涂禮莉,譚家福,鄧鋒林申請人:華中農業(yè)大學