專利名稱：利用抵抗素表達(dá)水平檢測豬脂肪沉積的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測豬脂肪沉積的方法。具體涉及利用一種脂肪細(xì)胞因子抵抗素 (resistin)動態(tài)監(jiān)控豬脂肪沉積的方法，該方法是利用抵抗素表達(dá)水平檢測豬脂肪沉積， 以便在養(yǎng)殖過程中隨時掌握豬的脂肪沉積情況。
背景技術(shù)：
脂肪組織最重要和最為廣泛知道的功能就是在能量過剩時以甘油三脂的形式儲存能量而在饑餓狀態(tài)下動員這些能量。脂肪組織曾一直被認(rèn)為是一個被動的無活性的組織。然而，近二十多年的發(fā)現(xiàn)證明脂肪組織不單是一個能量儲存器官，更是一個主要的內(nèi)分泌器官。它能分泌許多因子，包括瘦素(1印tin)，腫瘤壞死因子alpha (TNFa)，脂聯(lián)素 (adipnectin)和抵抗素(resistin)等，這些因子統(tǒng)稱為脂肪細(xì)胞因子，它們在脂代謝和能量平衡中發(fā)揮著重要的作用。Resistin是脂肪細(xì)胞分泌因子中的一個重要成員，在脂肪沉積的調(diào)控中具有重要作用。2001年多個研究小組幾乎同時發(fā)現(xiàn)一個包含114個氨基酸、具有分泌能力的新基因。 最初人們推測它與胰島素抵抗的形成相關(guān)，因而命名為抵抗素。體外實驗表明它促進前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，其表達(dá)量隨著脂肪細(xì)胞的分化和脂肪沉積的增加逐漸增大；同時， 轉(zhuǎn)基因研究顯示抵抗素的超表達(dá)導(dǎo)致脂肪的過度沉積。體內(nèi)實驗表明，與正常對照相比，肥胖動物體內(nèi)抵抗素水平較高，證明較高的抵抗素水平對應(yīng)較高的胰島素、葡萄糖和脂質(zhì)水平。近年來開展的抵抗素與肥胖相關(guān)性的研究顯示，與正常對照相比，肥胖人群的抵抗素水平較高；并且抵抗素水平與體重指數(shù)和內(nèi)臟脂肪含量正相關(guān)；此外還發(fā)現(xiàn)抵抗素水平在體重下降時顯著降低?；谝陨涎芯渴聦崳J(rèn)為抵抗素與脂肪沉積正相關(guān)。脂肪對維持畜禽生命、生長和生產(chǎn)是不可缺少的。但是，近幾十年來，由于過于注重體重和生長速度的選擇，導(dǎo)致畜禽生產(chǎn)周期日益縮短而脂肪沉積日趨增多。過度的脂肪沉積不僅誘發(fā)畜禽疾病，還降低畜產(chǎn)品價值。豬，作為人們重要的肉類來源，在生長過程中隨時、動態(tài)的監(jiān)測其脂肪沉積情況，從而防止脂肪的過度沉積，對于豬的生產(chǎn)和養(yǎng)殖具有現(xiàn)
眉、ο現(xiàn)有的檢測豬脂肪沉積的方法，主要是檢測豬背膘厚度，需要屠宰之后完成，無法做到連續(xù)、動態(tài)的監(jiān)控豬的脂肪沉積情況。為了在養(yǎng)殖過程中隨時掌握豬的脂肪沉積情況， 急需一種簡便、準(zhǔn)確的方法來檢測豬的脂肪沉積。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測豬脂肪沉積的方法。本發(fā)明建立的豬脂肪沉積檢測方法，具有快速、簡便、準(zhǔn)確及不影響豬正常生長等優(yōu)點，適合于在養(yǎng)殖過程中動態(tài)監(jiān)控豬的脂肪沉積情況。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的利用NCBI數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公開發(fā)表的豬(sus scrofa)的抵抗素基因resistin序
3列(序列登錄號GI =42539447 ；參見網(wǎng)址NCBI 數(shù)據(jù)庫 http://www. ncbi. nlm. nih. gov), 設(shè)計一對特異性引物，可從豬的基因組中擴增出單一的片段。豬(SUS scrofa)的抵抗素基因resistin特異片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，序列全長為167bp。豬的看家基因磷酸甘油醛脫氫酶基因G3PDH特異片段， 它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :4所示，序列全長為98;3bp用于擴增上述抵抗素基因resistin特異片段的引物，它們的核苷酸序列如序列表 SEQ IDNO 2 和 SEQ ID NO 3 所示。用于擴增豬的看家基因磷酸甘油醛脫氫酶G3PDH特異片段的引物，它們的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示。利用遺傳型脂肪豬和遺傳性瘦肉型豬兩類豬，分別接受正常喂食和限食處理，采集1月齡、3月齡、5月齡和7月齡檢測脂肪細(xì)胞因子resistin的表達(dá)水平，建立豬血清中 resistin水平與脂肪沉積的關(guān)系，以resistin的蛋白水平來反應(yīng)豬的脂肪沉積情況。為了明確resistin與脂肪沉積的關(guān)系，本發(fā)明通過喂食處理來改變成年脂肪型豬的肥胖狀態(tài)。喂食處理是如方法中描述的對豬進行食物限制。然后在不同的限食時間， 如15d，30d，45d和60d，對豬脂肪組織中resistin水平進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，resistin水平隨著喂食處理的延長而逐漸減少。34d的喂食限制后，與對照相比，減少的resistin mRNA 水平達(dá)到了統(tǒng)計差異( %的減少，P <0.05)。60d的喂食限之后，這種減少達(dá)到69% (P <0.001)。對resistin蛋白質(zhì)水平進行檢測，也得到了一致的結(jié)果。這表明減少的mRNA 水平導(dǎo)致了減少蛋白質(zhì)水平。說明resistin與脂肪沉積正相關(guān)。為了建立resistin與豬脂肪沉積的對應(yīng)關(guān)系，本發(fā)明通過半定量PCR和Western 雜交檢測了 resistinmRNA和蛋白質(zhì)在不同生長期遺傳性脂肪和瘦肉型豬脂肪組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，resistin mRNA和蛋白質(zhì)在1月齡、3月齡、5月齡和7月齡的脂肪性豬脂肪組織中的水平明顯高于它們的瘦肉型同伴(P <0.05)。在單個脂肪或瘦肉型豬中， resistin表達(dá)隨著脂肪沉積的量的增加而增大，脂肪型和瘦肉型豬中，7月齡與1月齡相比均達(dá)到極顯著(P <0.01)。


序列表SEQ ID N0:1是豬(sus scrofa)的抵抗素基因resistin特異片段，序列全長為167bp。序列表SEQ ID NO 2和3是本發(fā)明擴增豬抵抗素resistin基因的引物序列。序列表SEQ ID NO :4是擴增看家基因磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)基因的特異片段。序列表SEQ ID NO :5和6是擴增磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)基因的特異片段的引物。圖1，是Resistin mRNA在不同喂食狀態(tài)下豬脂肪組織中的表達(dá)。A是利用瓊脂糖凝膠電泳檢測的resistin mRNA表達(dá)情況；B是將A圖的條帶光密度值轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)的圖。圖2 是Resistin蛋白質(zhì)在不同喂食狀態(tài)下的豬脂肪組織中的表達(dá)。圖3，是Resistin mRNA在瘦肉型和脂肪型豬脂肪組織中的表達(dá)。A是利用瓊脂糖凝膠電泳檢測的resistin mRNA在瘦肉型和脂肪型豬脂肪組織中的表達(dá)情況；B是將A圖的條帶光密度值轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)的圖。圖4 是Resistin蛋白質(zhì)在瘦肉型和脂肪型豬脂肪組織中的表達(dá)。
具體實施例方式實施例1申請人:提供了一種檢測豬脂肪沉積的方法，其步驟如下(1)從被測的生物材料中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到它的cDNA樣品；(2)用序列表SEQ ID NO 2和3所示的引物對，對步驟(1)所述的cDNA樣品進行 PCR擴增，得到如序列表SEQ ID NO :1所示的基因片段;(3)用序列表SEQ ID NO 5和6所示的引物對，對看家基因G3PDH進行PCR擴增， 得到如序列表SEQ ID NO 4所示的基因片段；(4)對步驟( 和步驟( 得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中比較其光密度值；其中步驟⑵所述的PCR擴增步驟如下1)擴增反應(yīng)體系在50ul PCR反應(yīng)液中，含有2ul cDNA模板，5ullOXPCR緩沖液， 4ul2. 5mmol/L dNTPs，2ul 引物 Pl (10 μ Μ)，2ul 引物 P2 (10 μ Μ)，2ul Taq DNA 聚合酶，33ul 無菌去離子水；2) PCR 反應(yīng)條件94°C 3min ;94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，30 個循環(huán)；及終延伸 72 °C 7min ；其中步驟1)的緩沖液配方如下所示20mM Tri-HCl, pH 8. 4,200mM KCl, IOOmM(NH4) 2S04,20mM MgS04。2、樣品制備與處理(1)動物和樣品獲得本發(fā)明是以典型的遺傳型脂肪型豬和瘦肉型豬(均為1-7月齡)用來作為研究對象。試驗豬在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物房喂養(yǎng)，并按50%脂肪型豬-50%瘦肉型豬的比例搭配， 每頭豬放在單個棚子喂養(yǎng)。所有研究對象初始體重大致相同。前期所有豬都喂食標(biāo)準(zhǔn)日糧(該標(biāo)準(zhǔn)日糧為公開報道或銷售的的豬飼料，例如武漢天龍飼料有限公司產(chǎn)品，http:// www. 027tianlong. com/product/class/ ？ 3. html)，并自由進食。在相應(yīng)的時間點(1、3、5 和7月齡)，脂肪型豬和瘦肉型豬空腹1 后，手術(shù)采集豬背部皮下脂肪，將采集的豬背部皮下脂肪樣品立即用液氮冷凍，然后放置于-80°C超低溫冰箱凍存以待分析。(2)喂食處理將年齡性別相同，體重大體一致的脂肪型豬分成兩個喂食組。一組為對照組 (對照組C)，對照組的喂食日糧為標(biāo)準(zhǔn)的成年豬日糧；另一組為喂食限制組(Feeding restriction, FR組)，該組豬接受對照組同樣品質(zhì)的日糧喂食，但喂食量被限制到對照組的75%。接受這種喂食處理的對照和限食組豬，在相應(yīng)的時間點接受活體采取皮下脂肪組織樣。60天后，豬被屠宰后，采集其脂肪組織樣，立即在4°C下2000g離心10分鐘，然后儲存于-80°C超低溫冰箱以待分析。( 總RNA提取和半定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析從液氮罐中取出Ig豬皮下脂肪組織，加5-10ml Trizol試劑(上海生工生物工程
5有限公司產(chǎn)品)，用Glas-Col變速反轉(zhuǎn)電動勻漿器勻漿IOmin左右，然后轉(zhuǎn)移勻漿液于一 IOml Eppendorf管，在4°C下IlOOOg離心lOmin，吸取上清液于另一 Eppendorf管，冰上靜置20min后加入1. 5ml氯仿，劇烈振蕩IOs,再冰上靜置15min,再4°C下IOOOOg離心15min, 取上清，加入等體積的異丙醇，冰上靜置30min后，4°C下IlOOOg離心lOmin，倒去上清液，加入300ul 75%濃度的乙醇清洗沉淀，7500g離心5min，棄上清，再用75%濃度的乙醇清洗沉淀，7500g離心5min，棄上清，風(fēng)干沉淀，加30ul焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的無菌水溶解沉淀，分裝RNA溶液，-70°C保存?？俁NA用無RNA酶的DNA酶(購自Promega公司)處理。在試管(Tube)中配置下列反應(yīng)液，共50ul。PCR反應(yīng)試劑配方見表1所示。表IPCR反應(yīng)體系
總 RNA20-50ug
IOXDNasel buffer2.0ulDNasel(RNase- free, 5U/ul) 2.0ul
RNase Inhibitor(40U/ul) 0.5ul DEPC 處理水_Up to 5Qui再將試管放置恒溫水浴箱中，37°C反應(yīng)20-30min，再加入50ul DEPC處理過的無菌水，然后加入IOOul(等量)的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比25 24 1)，充分混勻，離心，取上層(水層)移至另一 1.5ml離心管中，加入IOOul的氯仿/異戊醇(體積比對1)， 充分混勻，離心，取上層移至另一 1. 5ml離心管中，加入IOul (1/10量)的3MNaAc (pH5. 2)， 加入250ul (2. 5倍量)的冷無水乙醇，-20°C放置30-60min，離心回收沉淀，用75%的冷乙醇清洗沉淀，然后真空干燥沉淀，再用適量DEPC處理過的水溶解沉淀，進行瓊脂糖電泳確認(rèn)。總RNA濃度通過紫外分光光度計測定。取lug RNA用Oligo (dT)作為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈。模板RNA 12. 5ul， Oligo (dT)2ul，10XRT Buffer 2ul, lOmmol/L dNTPs 2ul, RNasin 0. 5ul，M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 lul，總體積20ul。40°C l-2h后加入40ulDEPC處理過的水，劇烈振蕩混勻后儲存于_20°C 備用。吸取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的十分之一體積用來做PCR。用序列表SEQ ID NO :2和SEQ ID N0 3所示的引物對和SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示的引物對進行分別進行PCR擴增，擴增反應(yīng)體系在50ul PCR反應(yīng)液中，2ul cDNA模板，5ul 10XPCR緩沖液，4ul 2. 5mmol/L dNTPs, 2ul 引物 Pl(10yM)，2ul 引物 Ρ2 (10 μ Μ)，2ul Taq DNA 聚合酶，33ul 無菌去離子水； PCR 反應(yīng)條件:94°C 3min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，30 個循環(huán)；及終延伸 72°C 7min ；得到如序列表SEQ ID NO :1所示的序列。為了定量mRNA看家基因磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH) 作為內(nèi)參，用序列表SEQ ID NO :4和SEQ IDNO :5所示的引物對進行PCR擴增。配置1. 5% 的瓊脂糖凝膠，在IXTAE緩沖液中，電壓100V左右下電泳lh。當(dāng)指示劑電泳到適當(dāng)位置時，結(jié)束電泳，將凝膠放入含氯化乙淀的溶液中染色約5min，用清水漂洗后，在紫外燈下觀察。通過對目的基因和看家基因PCR產(chǎn)物的比率來決定目的基因mRNA的相對水平。mRNA 水平的定量分析用Gelscan V5.02(德國)圖像分析系統(tǒng)來完成。(4)總蛋白抽提和western雜交分析取適量樣品(豬皮下脂肪)組織于一碾缽，加入Iml 2X樣品抽提緩沖液(配方0. 5MTris-HCL(pH6.8)，20%十二烷基硫酸鈉(SDS，)0. 1 %溴酚藍(lán)，2_b_疏基乙醇，重蒸水)，在冰上將樣品組織搗碎，研磨約15min，放入1. 5ml離心管，以10000g，4°C離心12min, 將上層油棄去，輕輕撥開中層的脂肪墊，小心吸出第三層藍(lán)色溶液于另一 1.5ml離心管中， 再以SOOOg低溫高速離心6min，然后將樣液分裝到0. 5ml的小離心管中，放入_20°C保存。抽提出來的總蛋白通過12%的SDS-PAGE膠分離。所有的樣品都以相同的總蛋白濃度電泳。電泳完后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，再按Santa Cruz生物技術(shù)提供的方法雜交，即用BlottoA(IX TBS，5%脫脂奶粉，0. 05% Tween 20)封膜45-60min ；然后用 BlottoA稀釋的兔抗resistin多克隆抗體(購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司)終濃度為 0. lug/ml)孵育 Ih ；再用含有 0. 05% Tween20 的 TBS(Tris Buffered Salt)洗膜三次，每次15min ；然后用BlottoA稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG孵育45-60min ；然后再用含有0. 05% Tween20的TBS洗膜兩次，不含Tween20的TBS洗一次；最后以二氨基聯(lián)苯胺(簡稱DAB，購自西安永屹生物技術(shù)有限公司)作為底物來顯示抗原一抗體特異反應(yīng)。(5)統(tǒng)計分析結(jié)果用平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。通過SPSS 10. O軟件(德國)用One-WayANOVA 或t檢測進行統(tǒng)計分析。P < 0. 05確定為具有統(tǒng)計差異。
權(quán)利要求
1.一種擴增豬抵抗素基因片段的引物對，其核苷酸序列如下所示Pl CCCGTGGATGAAGCCATCAA ；P2 :CAGGCGGAGCCACACGTG。
2.一種檢測豬脂肪沉積的方法，其步驟包括(1)從被測的豬組織中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到它的cDNA樣品；(2)用序列表SEQID NO :2和3所示的引物對對步驟(1)所述的cDNA樣品進行PCR擴增，得到如序列表SEQ ID NO :1所示的基因片段;(3)用序列表SEQID NO 5和6所示的引物對對看家基因G3PDH進行PCR擴增，得到如序列表SEQ ID NO 4所示的基因片段；(4)對步驟( 和步驟C3)得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中比較其光密度值；其中步驟(2)所述的PCR擴增步驟如下1)擴增反應(yīng)體系在50ulPCR反應(yīng)液中，含有2ul cDNA模板，5ullOXPCR緩沖液， 4ul2. 5mmol/L dNTPs，2ul 引物 Pl (10 μ Μ)，2ul 引物 P2 (10 μ Μ)，2ul Taq DNA 聚合酶，33ul 無菌去離子水；2)PCR反應(yīng)條件94°C 3min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72 °C lmin，30 個循環(huán)；及終延伸 72 °C 7min ；步驟 1)的緩沖液配方如下20mM Tri-HCl, pH 8. 4,200mM KCl, IOOmM(NH4)2SO4, 20mM MgSO4。
3.權(quán)利要求2所述的方法在檢測豬脂肪沉積中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的引物對在檢測豬脂肪沉積中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬脂肪沉積檢測方法。步驟包括1)從被測的豬組織中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA樣品；2)用SEQ ID NO2和3所示的引物對對步驟1)的cDNA樣品進行PCR擴增，得到如SEQ ID NO1所示的基因片段；3)利用SEQ ID NO5和6所示的引物對看家基因進行PCR擴增，得到如SEQ ID NO4所示的基因片段；4)對步驟2)和步驟3)的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中比較其光密度值。本發(fā)明以1月齡、3月齡、5月齡和7月齡的脂肪豬和遺瘦肉型豬為檢測對象，檢測了脂肪細(xì)胞因子抵抗素(resistin)的表達(dá)水平，以resistin的蛋白水平來反應(yīng)豬的脂肪沉積情況。本發(fā)明具有快速、簡便、準(zhǔn)確及不影響豬正常生長等優(yōu)點，適于在養(yǎng)殖過程中動態(tài)監(jiān)控豬的脂肪沉積情況。
文檔編號C12Q1/68GK102485910SQ201010582320
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
發(fā)明者周磊, 楊在清, 陳小冬, 雷霆 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)