專利名稱：PPAR α基因及用作為鵝脂肪沉積相關(guān)遺傳標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鵝的分子生物學(xué)技術(shù)及育種領(lǐng)域，具體是涉及測定與腹脂重、腹脂率相關(guān)特征的遺傳標(biāo)記的存在，更具體地說，是測定PPARa基因中的多態(tài)性，即與腹脂重和腹脂率相關(guān)的鵝過氧化物酶體增值物激活受體(PPAR)基因的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,縮寫為 SNP)的存在。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代家禽遺傳育種理論和應(yīng)用的發(fā)展，使肉用家禽特別是肉雞、肉鴨的生長速度和飼料效率大幅度提高，生產(chǎn)效率與工廠化生產(chǎn)逐相適應(yīng)。但同時也容易帶來胴體腹部脂肪和皮下脂肪的大量沉積，導(dǎo)致飼料能量的浪費(fèi)和胴體品質(zhì)不佳。
PPAR(Peroxisome Proliferators activated receptors)屬于核激素受體超家族，它能夠調(diào)控許多參與細(xì)胞內(nèi)外脂類代謝的目的基因，還參與脂肪細(xì)胞分化。PPAR有三種亞型α、β、Y。PPARa的目標(biāo)基因是一組參與脂類分解的基因，能調(diào)控肝臟過氧化物酶體氧化；PPARY參與脂肪細(xì)胞的分化及細(xì)胞內(nèi)外脂類代謝相關(guān)目標(biāo)基因的調(diào)控，影響脂肪酸在脂肪組織中貯存，對脂肪生成起作用，大部分PPARy的目標(biāo)基因直接參與脂肪合成途徑，包括脂蛋白脂酶(LPL)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)、乙酰酰輔酶A合成酶和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)。雞PPAR α基因的cDNA長593bp、CDS (mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR的產(chǎn)物)為1407bp。 孟和等對PPAR基因作為雞脂肪性狀候選基因的可能性做了研究，結(jié)果表明用7對引物對 AA肉雞PPARa基因全編碼區(qū)用PCR-SSCP方法進(jìn)行掃描后發(fā)現(xiàn)引物4擴(kuò)增片段上有一個 C-T的單堿基突變，從而雞群出現(xiàn)AA、AB、BB三個基因型。BB基因型的腹脂重和腹脂率顯著較高，從而推測PPARa基因可能是影響雞脂肪代謝的主效基因或與主效基因連鎖，可用于雞脂肪性狀的分子標(biāo)記輔助選擇。孟和等的研究結(jié)果表明PPAR α和PPAR Y的不同基因型在地方雞、蛋雞、肉雞中的頻率存在差異；PPARa三種基因型與腹脂、腹脂率間極顯著相關(guān)，其中BB型腹脂和腹脂率最聞，AA型最低。PPARy的二種基因型間不存在此類相關(guān)。 用Northern雜交法可知PPARy基因在雞的脂肪組織和腎臟中高量表達(dá)。推測PPARa與脂肪代謝、沉積密切相關(guān)。解相林等報道，PPAR基因單核苷酸多態(tài)與脂肪性狀存在顯著相關(guān)，李春雨等研究表明，雞的PPARy基因SNPs在沉默突變的情況下仍然與腹脂重、腹脂率等存在顯著關(guān)系，推測PPARy基因可作為雞體脂肪性狀的主效基因。
但是，目前有關(guān)鵝的DNA遺傳標(biāo)記、遺傳多樣性和相關(guān)功能基因的研究相對雞來說還很少，且沒有關(guān)于鵝PPAR α基因的研究報道。 發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種PPARa基因及其作為鵝脂肪性狀遺傳標(biāo)記的用途；同時篩選與鵝脂肪性狀相關(guān)的SNP，以期應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇或標(biāo)記輔助滲入，并提供上述遺傳標(biāo)記在鵝標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種PPARa基因，所述基因?yàn)榕c表示鵝脂肪性狀指標(biāo)的腹脂重、腹脂率相關(guān)的基因。
進(jìn)一步，所述基因PPARa序列的第175堿基處有一個堿基突變C175-G175。
進(jìn)一步，克隆PPARa基因所用引物的序列如下
正向引物5'-CATTGGTGTTCGCAGCTGTT-3'，
反向引物5'-CAGAGCTCTCCTCACCGATG-3'。
進(jìn)一步，突變導(dǎo)致所編碼的氨基酸發(fā)生改變，而且氨基酸高腹脂的為谷氨酸(E)， 低腹脂的為谷氨酰胺(Q)。
本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種用PPARa基因作為鵝脂肪沉積相關(guān)遺傳標(biāo)記的方法，該包括如下步驟
(I)根據(jù)GenBank中雞PPAR α基因的mRNA序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，覆蓋該基因部分編碼序列，再獲得鵝基因組DNA ；
(2)以上述鵝基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，克隆，獲得如序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(3)鑒定該基因序列的第175堿基處是否存在多態(tài)性。
進(jìn)一步，所述方法選擇鵝作為研究對象，采用分子生物學(xué)的方法篩選鵝脂肪性狀相關(guān)基因，其步驟如下
(I)選擇相同日齡的健康雛苗溆浦鵝200只進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)；
(2)根據(jù)PPARa基因的序列設(shè)計(jì)引物，對樣品進(jìn)行擴(kuò)增、測序；
(3)篩選與腹脂率高低相關(guān)的SNP。
本發(fā)明采用PCR與DNA測序結(jié)合的方法首先篩選出PPARa基因?yàn)轾Z脂肪沉積的相關(guān)基因，繼而從鵝PPARa基因上篩選到與性狀相關(guān)的SNP，并且通過生產(chǎn)實(shí)踐驗(yàn)證確定 PPARa基因?yàn)橹境练e相關(guān)基因，篩選的SNP為與之相關(guān)的SNP。本發(fā)明篩選的鵝PPAR a 基因的SNP可作為鵝輔助選擇的遺傳標(biāo)記，從而培育出腹脂更少的鵝，具有極其重大的應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實(shí)施例1鵝相關(guān)基因SNP篩選
選擇相同日齡的健康雛苗溆浦鵝配套系商品鵝200只進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)。對該些鵝進(jìn)行高腹脂型和低腹脂型鑒定，并從高腹脂型和低腹脂型樣本中分別提取其基因組DNA。
根據(jù)GenBank中雞PPARa基因的mRNA序列，用Primer 5. O設(shè)計(jì)引物，覆蓋該基因部分編碼序列，引物序列為5 ' -CATTGGTGTTCGCAGCTGTT-3 '(正向)， 5' -CAGAGCTCTCCTCACCGATG-3'(反向)，由上海英韋創(chuàng)津公司合成。用上述引物分別對提取的鵝基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。
PCR 10μ I 反應(yīng)體系10 Xbuffer (含 Mg2+)ly 1，上、下引物(20ymol/L)各 O. 15 μ I, dNTPs(10ymol/L)0. 2μ I，Taq 酶 1U，DNA(IOOng) O. 7 μ I，超純水補(bǔ)至所需體積。
PCR擴(kuò)增程序94°C 5分鐘預(yù)變性后30個PCR循環(huán)參數(shù)為95°C 30秒，57°C 30秒，72 0C 30秒，最后72 0C 7分鐘。
取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ 1，加入變性劑(95%甲硝銨)10μ 1，95°C變性10分鐘，再冰浴5 分鐘后，點(diǎn)樣于15%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳(丙烯酰胺/N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺為 29 I)，電壓保持在80 100V，常溫下電泳約16 18小時，直至蘭色溴酚藍(lán)染料至凝膠最底端為止。凝膠用硝酸銀染色，SSCP分析結(jié)果表現(xiàn)為鵝PPARa基因部分DNA片段有三種不同條帶類型，說明該DNA片段存在SNP。三種不同條帶類型分別定義為GG型和CC型， 雜合型定義為GC型。
取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物50 μ 1，產(chǎn)物純化后送上海英韋創(chuàng)津公司測序，測序結(jié)果確證了 PCR產(chǎn)物是PPARa基因，PCR產(chǎn)物的長度為464bp，序列如序列表中的SEQ ID N0:1所示。 將鵝PPARa基因片段序列與其它16個物種的GenBank中已登錄的PPARα基因序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明鵝PPARa基因片段序列與番鴨、家鴨、鼠等動物有95%以上同源性， 而與雞、人、牛、羊等動物的有80%以上，進(jìn)一步說明PPARa基因在進(jìn)化過程中有較高的保守性。
將上述產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸序列分析，結(jié)果如下(見SEQ ID NO 2)
權(quán)利要求
1.一種PPARa基因，其特征在于，所述基因?yàn)榕c表示鵝脂肪性狀指標(biāo)的腹脂重、腹脂率相關(guān)的基因。
2.如權(quán)利要求1所述的PPARa基因，其特征在于所述基因PPARa序列的第175堿基處有一個堿基突變C175-G175。
3.如權(quán)利要求1所述的PPARa基因，其特征在于，克隆PPAR a基因所用引物的序列如下 正向引物5' -CATTGGTGTTCGCAGCTGTT-3'， 反向引物5' -CAGAGCTCTCCTCACCGATG-3'。
4.如權(quán)利要求2所述的PPARa基因，其特征在于，突變導(dǎo)致所編碼的氨基酸發(fā)生改變，而且氨基酸高腹脂的為谷氨酸(E)，低腹脂的為谷氨酰胺(Q)。
5.一種用PPARa基因作為鵝脂肪沉積相關(guān)遺傳標(biāo)記的方法，其特征在于，該包括如下步驟 (1)根據(jù)GenBank中雞PPARa基因的mRNA序列，用Primer 5. O設(shè)計(jì)引物，覆蓋該基因部分編碼序列，再獲得鵝基因組DNA ； (2)以上述鵝基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，克隆，獲得如序列表SEQID NO.1所示的核苷酸序列； (3)鑒定該基因序列的第175堿基處是否存在多態(tài)性。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法選擇鵝作為研究對象，采用分子生物學(xué)的方法篩選鵝脂肪性狀相關(guān)基因，其步驟如下 (1)選擇相同日齡的健康雛苗溆浦鵝200只進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)； (2)根據(jù)PPARa基因的序列設(shè)計(jì)引物，對樣品進(jìn)行擴(kuò)增、測序； (3)篩選與腹脂率高低相關(guān)的SNP。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種過氧化物酶體增值物激活受體PPARα基因及其作為鵝脂肪性狀遺傳標(biāo)記的用途，測定出PPARα基因中與鵝腹脂重、腹脂率相關(guān)的遺傳標(biāo)記，并測定從鵝獲得的核酸樣品中PPARα基因中多態(tài)性的存在，該多態(tài)性導(dǎo)致所編碼的氨基酸發(fā)生改變，并且與腹脂重、腹脂率存在相關(guān)。根據(jù)該基因的單核苷酸多態(tài)性可對基因組DNA中含有PPARα基因的動物進(jìn)行脂肪性狀選育，篩選出降低鵝腹脂重、腹脂率的優(yōu)勢基因型，具有極其重大的應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12Q1/68GK103031307SQ20121030665
公開日2013年4月10日 申請日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者曲湘勇, 何俊, 蔣雋, 賀長青 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 曲湘勇