棉花纖維長度相關(guān)的主效基因位點連鎖ssr分子標記與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種棉花纖維長度相關(guān)的主效基因位點連鎖SSR分子標記與應(yīng)用。與棉花優(yōu)質(zhì)纖維品系魯原343的19號染色體上與纖維長度有關(guān)的主效基因位點qFL-19-1、qFL-19-2連鎖的SSR分子標記，qFL-19-1、qFL-19-2均位于Chr.19號染色體上，與qFL-19-1連鎖的標記為SSR分子標記HAU1185，SSR分子標記DPL0595，SSR分子標記GH109，與qFL-19-2連鎖的標記為SSR分子標記DPL0556，SSR分子標記CGR5582。本發(fā)明對分子標記輔助聚合棉花纖維品質(zhì)改良乃至漸滲優(yōu)異纖維主效QTL候選基因圖位克隆具有重要的應(yīng)用價值。
【專利說明】棉花纖維長度相關(guān)的主效基因位點連鎖SSR分子標記與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種棉花纖維長度相關(guān)的主效基因位點連鎖SSR分子標記與應(yīng)用，特別涉及與棉花優(yōu)質(zhì)纖維材料魯原343的Chr.19上與纖維長度連鎖的SSR(Simple SequenceRepeats)標記,屬于生物技術(shù)應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]棉花是重要的經(jīng)濟作物，在國民經(jīng)濟中占據(jù)十分重要的地位。高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病一直是棉花育種的重要目標。隨著紡織技術(shù)的發(fā)展，對纖維品質(zhì)的要求也在不斷提高。近十年來，隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展、完善，以及一系列作圖軟件的開發(fā)與利用，棉花遺傳圖譜構(gòu)建和重要性狀QTL定位取得了突破性進展。為重要農(nóng)藝性狀和纖維品質(zhì)性狀的基因克隆以及分子標記輔助育種打下了堅實的基礎(chǔ)。
[0003]已有研究表明，陸地棉基因庫中缺乏優(yōu)異纖維基因資源，品種內(nèi)雜交很難實現(xiàn)有效的纖維品質(zhì)改良。國內(nèi)外大量遠緣雜交的研究證實，棉屬內(nèi)陸地棉的近緣栽培種如海島棉(Gossypium barbadense)、近緣野生種如瑟伯氏棉(G.thurber1.)、異常棉(G.armourianum)等能夠作為改良陸地棉纖維品質(zhì)的基因源，并創(chuàng)造了一批纖維品質(zhì)有了大幅度提高的遠緣雜交中間材料，由于含有外源優(yōu)異纖維遺傳組分，我們將這些材料稱之為優(yōu)異纖維導入系或漸滲系)。這些材料的遺傳背景為陸地棉，可以用于纖維品質(zhì)的改良，但是在實際育種利用中，往往在優(yōu)異纖維基因轉(zhuǎn)育成功的同時，大量對產(chǎn)量等性狀有負面影響的遺傳位點也被攜帶進來(連鎖累贅)，這也是導致棉花纖維品質(zhì)改良進展緩慢的重要原因，僅依靠常規(guī)育種方法很難實現(xiàn)纖維品質(zhì)和產(chǎn)量的同步改良。
[0004]近年來，分子標記技術(shù)發(fā)展迅速，利用分子標記輔助聚合育種為棉花纖維品質(zhì)改良提供了新的育種方法，棉花纖維品質(zhì)的QTL定位研究已經(jīng)取得較大進展。Yu等(1998)在陸地棉和海島棉雜種F2群體中，利用RFLP、RAPD和SSR三種分子標記技術(shù)檢測到3個纖維長度的QTLs ；ShappIey等(1998)在陸陸雜交群體中檢測到7個纖維長度的QTLs ；Ulloa等(2000)利用陸陸雜交群體，用RFLP標記鑒定了 2個纖維長度有關(guān)的QTLs ；Kohel等(2001)利用陸海F2群體檢測到了 3個纖維長度QTLs ;任立華等(2002)在置換了海島棉一對染色體的陸地棉置換系F2:3家系中發(fā)現(xiàn)，16號染色體上有纖維長度的QTLs2個；吳茂清等(2003)以陸地棉與海島棉雜種F2群體為作圖群體，檢測到2個纖維長度QTLs ;PaterSon等(2003)利用陸海F2和F2:3群體鑒定了 6個纖維長度的QTLs ；Lin等(2005)利用陸海F2群體采用SRAP、SSR、RAPD三種分子標記構(gòu)建遺傳連鎖譜，檢測到4個纖維長度的QTLs，解釋17.14%~27.52%的表型變異；Shen等(2005)利用三個陸地棉組合F2和F2:3群體，檢測到11個纖維長度的QT Ls ;James等(2006)利用重組自交系群體(Recombined Inbred Lines,RIL)檢測到10個纖維長度的QTLs，可以解釋5.7%~9.4%的表型變異；Wang等(2006)利用SSR分子標記技術(shù)，在RIL群體中檢測到48個QTLs，其中，控制纖維長度的4個；王娟等(2007)利用陸陸F2和F2:3群體檢測到I個纖維長度的QTL，可以解釋6.1 %的表型變異。以往棉花纖維品質(zhì)QTL定位所用群體為初級定位群體，而且有關(guān)棉花19號染色體上與纖維長度有關(guān)的分子標記研究還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種棉花纖維長度相關(guān)的主效基因位點連鎖SSR分子標記與應(yīng)用。本發(fā)明通過篩選來源于魯原343的Chr.19上與棉花纖維長度連鎖的分子標記，應(yīng)用于棉花纖維品質(zhì)聚合育種中的輔助選擇，提高聚合效率。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]一種與棉花纖維長度相關(guān)的主效基因位點連鎖的SSR分子標記DPL0556的檢測引物，檢測引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0008]一種與棉花纖維長度相關(guān)的主效基因位點連鎖的SSR分子標記CGR5582的檢測引物，檢測引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQID N0.4 所示。
[0009]一種與棉花纖維長度相關(guān)的主效基因位點連鎖的SSR分子標記HAU1185的檢測引物，檢測引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQID N0.6 所示。
[0010]一種與棉花纖維長度相關(guān)的主效基因位點連鎖的SSR分子標記DPL0595的檢測引物，檢測引物為一對， 上游引物核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQID N0.8 所示。
[0011]一種與棉花纖維長度相關(guān)的主效基因位點連鎖的SSR分子標記GH109的檢測引物，檢測引物為一對，上游引物核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQID N0.10 所示。
[0012]與棉花優(yōu)質(zhì)纖維品系魯原343的19號染色體上與纖維長度有關(guān)的主效基因位點qFL-19-1、qFL-19-2 連鎖的 SSR 分子標記，qFL_19_l、qFL_19_2 均位于 Chr.19 號染色體上，與qFL-19-l連鎖的標記為SSR分子標記HAUl 185，SSR分子標記DPL0595，SSR分子標記GH109,與qFL-19-2連鎖的標記為SSR分子標記DPL0556，SSR分子標記CGR5582。
[0013]本發(fā)明中，QTL命名參考McCouch等在水稻中的命名規(guī)則，以q+性狀(英文縮寫)+連鎖群代號+QTL個數(shù)的形式表示(參考文獻:McCouch SR, Cho YG, Yano M, et al.Reporton QTL nomenclature, Rice Genet Newslett,1997,14:11-13)。
[0014]一種魯原343的19號染色體上與棉花纖維長度有關(guān)的主效基因位點qFL_19_l、qFL-19-2連鎖的SSR標記的篩選方法,包括如下步驟:
[0015](I)以魯原343為父本與魯棉研22雜交后連續(xù)自交，獲得優(yōu)質(zhì)次級漸滲系R497 ；
[0016](I)利用優(yōu)質(zhì)次級漸滲系R497為父本和魯棉研22號回交，構(gòu)建F2和F2 ;3群體；
[0017](2)以優(yōu)質(zhì)次級漸滲系R497為父本與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉魯棉研22進行回交獲得F1,經(jīng)自交獲得次級定位群體F2種子；次級定位群體F2植株自交，收獲F2:3種子，種植回交后代群體F2:3家系；
[0018](3)提取親本及F2群體的基因組DNA ；
[0019](4)利用SSR分子標記篩選棉花高纖維長度標記，得到親本R497和魯棉研22號間的多態(tài)性引物，利用多態(tài)性引物對步驟(3)提取的F2群體的基因組DNA進行擴增，構(gòu)建連鎖圖譜，結(jié)合利用&群體構(gòu)建的連鎖圖譜和F2:3家系纖維品質(zhì)測定結(jié)果，對纖維品質(zhì)性狀進行QTL定位。
[0020]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述方法步驟(4)中，利用多態(tài)性引物對&群體進行擴增的反應(yīng)體系為10 μ I,具體如下:
[0021]超純水(ddH20)6.5μ 1，F(xiàn)2 群體的基因組 DNAl μ 1，IOXBufferl μ 1，濃度為 IOmM的dNTP0.2μ 1，濃度為10 μ M的上游引物0.6 μ 1，濃度為10 μ M的下游引物0.6 μ 1，TaqDNA聚合酶0.1 μ I ;
[0022]擴增反應(yīng)程序:
[0023]95°C預(yù)變性 45s ;94°C變性 30s，52 ~57°C退火 45s ;72°C延伸 lmin，循環(huán) 33 次；72°C延伸2min，保 存4°C至取出；利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，記錄結(jié)果。
[0024]根據(jù)QTL定位結(jié)果，qFL-19-l在兩個環(huán)境下都能檢測到，位于19號染色體的HAUl 185—GH109標記區(qū)間內(nèi)，增效基因來自親本魯原343，解釋的表型變異為
4.31% —5.54%。與 qFL-19-l 連鎖的標記為 HAU1185、DPL0595、GH109 ;另一個纖維長度主效QTL，qFL-19-2位于Chr.19的DPL0556—DPL0595標記區(qū)間內(nèi)，增效基因來自親本魯原343，解釋的表型變異為10.77%，與qFL-19-2的連鎖標記為DPL0556、CGR5582。只在一個環(huán)境中能檢測到，具有環(huán)境特異性。
[0025]有益效果
[0026]本發(fā)明以海島棉漸滲系魯原343的衍生系R497(纖維長度35.47mm、纖維比強度39.30(^/1^1、馬克隆值4.01)為親本，與魯棉研22號回交，構(gòu)建次級作圖群體，進一步剖析魯原343中與纖維品質(zhì)相關(guān)的分子標記，獲得與棉花優(yōu)質(zhì)纖維材料魯原343的Chr.19染色體上與纖維長度有關(guān)的主效基因qFL-19-1、qFL-19-2連鎖的SSR標記，對分子標記輔助聚合棉花纖維品質(zhì)改良乃至漸滲優(yōu)異纖維主效QTL候選基因圖位克隆具有重要的應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1是本發(fā)明F2群體(R497X魯棉研22號)Chr.19的分子標記連鎖及纖維長度QTL位置圖。
【具體實施方式】
[0028]下面通過【具體實施方式】的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明，但不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。
[0029]實施例1
[0030]本發(fā)明所述的存在于魯原343的19號染色體上與棉花纖維長度有關(guān)的主效基因位點qFL-19-1、qFL-19-2連鎖的SSR標記的篩選方法如下:
[0031](I)以優(yōu)質(zhì)纖維漸滲系魯原343和高產(chǎn)、抗病轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種魯棉研22號作親本進行雜交，F(xiàn)1進行嚴格自交，得到F2種子，以單粒傳法構(gòu)建重組自交系群體，其間各代都進行嚴格自交至F8代，利用魯原343和魯棉研22間有多態(tài)的SSR引物掃描F8代重組自交系群體的基因型，結(jié)合表型性狀，挑選出攜帶魯原343部分染色體區(qū)段且纖維品質(zhì)優(yōu)異的R497作為構(gòu)建次級群體的親本。[0032]2011年在山東棉花研究中心臨清試驗站以優(yōu)質(zhì)次級漸滲系R497與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉魯棉研22為親本進行回交獲得F1，冬季在海南島加代自交，獲得次級定位群體F2種子。2012年，在山東臨清種植F2，群體單株全部自交，收獲期每株收取棉樣用于纖維品質(zhì)測定。收獲自交鈴用于下年度種植F2:3群體。2013年，分別在山東臨清和湖南長沙種植F2:3家系，考察纖維品質(zhì)數(shù)據(jù)，綜合兩年的品質(zhì)數(shù)據(jù)進行QTL精確定位。
[0033](2)2012年、2013年種植的次級定位群體，在吐絮期采集棉樣測定纖維品質(zhì)，F(xiàn)2按照單株測定纖維品質(zhì)，F(xiàn)213則收取50鈴作為考種樣進行纖維品質(zhì)測定，獲得纖維品質(zhì)表型數(shù)據(jù)。纖維品質(zhì)利用HVI900(HVICC校準水平)測定。
[0034](3) F2群體(R497 X魯棉研22號)單株DNA提取采用CTAB法(Paterson etal., 1993) ο
[0035](4)多態(tài)性SSR標記的篩選:利用篩選出的魯棉研22號和魯原343間有多態(tài)的334對引物，篩選次級作圖群體親本R497和魯棉研22號的DNA多態(tài)性，共得到105對多態(tài)性引物。這些引物中以NAU編號的引物為南京農(nóng)業(yè)大學開發(fā)，共4對(引物來源:http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_date/CMD_PRIMER_NAU.xis) ; Wbnl編號的引物為美國布魯海文國家實驗室開發(fā),共9對(引物來源:http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_date/BNL_PRIMER_marker_in f0.xls)；以CGR、DPL, SHIN、DC等編號的引物為孟山都公司開發(fā)，共59對(引物來源:http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_date/CMD_PRIMER_M0N.xls)； 以HAU編號的引物為華中農(nóng)業(yè)大學開發(fā)，共24對(引物來源:http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_date/CMD_PRIMER_HAU.xls);以 JESPR、GH 編號的引物為美國德州農(nóng)工大學開發(fā)，共4對(引物來源:①http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_date/CMD_PRIMER_JESPR.xls ；② http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_date/CMD_PRIMER_GH.xls);以 CIR 編號的引物為國際農(nóng)業(yè)研究發(fā)展中心開發(fā)，共3對(引物來源:①http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_date/CMD_PRIMER_CIR.xls !② Nguyen TB, Giband M, BrottierP, et al., Wide coverage of the tetraloid cotton genome using newly developedmicrosatellite markers.Theor Appl Genet, 2004, 109:167-175) ;#TMB編號的引物為美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)署開發(fā)，共2對(引物來源:http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_date/CMD_PRIMER_TMB.xls)。
[0036](5)利用篩選得到的親本R497和魯棉研22號間的多態(tài)性引物，對F2群體進行擴增，構(gòu)建連鎖圖。結(jié)合F2群體和F2:3家系纖維品質(zhì)測定結(jié)果，對纖維品質(zhì)性狀進行QTL定位。PCR反應(yīng)體系為10 μ 1，其中超純水(ddH20)6.5μ 1，模板DNAl μ 1，IOXBufferl μ 1，濃度為IOmM的dNTP0.2 μ I,濃度為10 μ M的正向引物(Forward primer)0.6 μ 1，反向引物(Reverse primer)0.6 μ I, Taq DNA 聚合酶 0.1 μ I。SSR 擴增反應(yīng)程序:預(yù)熱 95°C 45s ;變性94°C 30s ;退火52~57°C 45s ;延伸72°C lmin ;循環(huán)33次；延伸72°C 2min ;保存4°C至取出。利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，記錄結(jié)果。
[0037]5對特征引物序列和擴增片段大小，如表1所示:
[0038]表1
[0039]
【權(quán)利要求】
1.與棉花優(yōu)質(zhì)纖維品系魯原343的19號染色體上與纖維長度有關(guān)的主效基因位點qFL-19-l、連鎖的 SSR 分子標記，qFL-19-1、qFL_19_2 均怔千 Chr.19 號染色體上，與qFL-19-l連鎖的標記為SSR分子標記HAUl 185，SSR分子標記DPL0595，SSR分子標記GH109,與qFL-19-2連鎖的標記為SSR分子標記DPL0556，SSR分子標記CGR5582。
2.一種魯原343的19號染色體上與棉花纖維長度有關(guān)的主效基因位點qFL-19-l、
連鎖的SSR標記的篩選方法，包括如下步驟: (O以魯原343為父本與魯棉研22雜交后連續(xù)自交，獲得優(yōu)質(zhì)次級漸滲系R497 ； (2)利用優(yōu)質(zhì)次級漸滲系R497為父本和魯棉研22號回交，構(gòu)建F2和F2:3群體； (3)以優(yōu)質(zhì)次級漸滲系R497為父本與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉魯棉研22進行回交獲得F1，經(jīng)自交獲得次級定位群體F2種子；次級定位群體F2植株自交，收獲F2:3種子，種植回交后代群體F2:3家系； (4)提取親本及F2群體的基因組DNA； (5)利用SSR分子標記篩選棉花高纖維長度標記，得到親本R497和魯棉研22號間的多態(tài)性引物，利用多態(tài)性引物對步驟(4)提取的F2群體的基因組DNA進行擴增，構(gòu)建連鎖圖譜，結(jié)合利用F2群體構(gòu)建的連鎖圖譜和F2:3家系纖維品質(zhì)測定結(jié)果，對纖維品質(zhì)性狀進行QTL定位。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中利用多態(tài)性引物對F2群體進行擴增，反應(yīng)體系 為10 μ 1，具體如下: ddH20 6.5 μ 1，F(xiàn)2 群體的基因組 DNA I μ 1，IOXBufferl μ 1，濃度為 IOmM 的(^?0.2 4 1，濃度為1(^]\1的上游引物0.6 μ 1，濃度為10 μ M的下游引物0.6 μ l,Taq DNA聚合酶0.1 μ I ; 擴增反應(yīng)程序: 95°C預(yù)變性45 s;94°C變性30 S，52~57°C退火45 s ;72°C延伸I min，循環(huán)33次；72°C 延伸 2min。
【文檔編號】C12N15/11GK103981178SQ201410225898
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】張軍, 馬和歡, 王芙蓉, 張傳云, 劉國棟, 張景霞, 周娟 申請人:山東棉花研究中心