專利名稱：轉(zhuǎn)基因高油酸油菜w-4事件外源插入左邊界旁側(cè)序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域中甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜的檢測，具體地說，涉 及一種甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜w-4外源基因整合事件的外源插入載體(pCNFIRnos)左邊 界旁側(cè)序列及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
油酸是一種18碳單不飽和脂肪酸，是植物油脂的重要組成部分。油酸能降低低密 度脂蛋白膽固醇(LDL)水平，維持高密度脂蛋白膽固醇(HDL)含量；油酸比亞油酸和亞麻酸 等多不飽和脂肪酸穩(wěn)定，耐高溫不易被氧化；高油酸菜籽油不僅有益于人們的身體健康，而 且耐儲藏。發(fā)展高油酸油菜是目前油菜品質(zhì)育種的一個重要組成部分。通過基因工程途徑抑制油菜種子中油酸脫飽和酶基因(fad2)表達是提高油酸含 量的重要策略。這在國內(nèi)外均有成功的報道。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所成功構(gòu)建甘藍型油菜fad2基因的ihpRNA表達 載體(pCNFIRnos)，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入甘藍型油菜，獲得油酸含量高達84%以上的 甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜品系W-4。近年來，轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、油菜、水稻等作物已經(jīng)在很多國家獲準種植和商 品化，一些轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物被加工成食用油、食品或飼料。鑒于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的生態(tài)安全或食 用安全一直倍受爭議，30多個國家和地區(qū)相繼實施了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識制度。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測主要依據(jù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中外源基因的序列信息、外源基因在植物 表達載體上的組合方式，以及外源基因在受體基因組中的整合位點，而建立起來的方法。不 同的方法各有利弊。1.基因特異性檢測方法一個特定的基因具有特定的序列特征，即特異性，以此特征建立的檢測方法對于 檢測特定基因的存在與否是十分有效的，但是，問題是大量的轉(zhuǎn)基因載體使用了相同的基 因，因此，基因特異性檢測無法區(qū)別不同來源的轉(zhuǎn)了相同基因的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。2.載體特異性檢測方法不同的植物表達載體其T-DNA內(nèi)部基因元件之間的組成或排列具有一定的特征。 可以依據(jù)這些特征鑒別使用了類似基因元件的不同植物表達載體。但是同一個表達載體可 能獲得一個以上的轉(zhuǎn)化植株，甚至可能被轉(zhuǎn)化到不同的物種中，而這些轉(zhuǎn)化株未必全部通 過了轉(zhuǎn)基因的安全評估。因此，載體特異性檢測方法不能識別不同的轉(zhuǎn)基因品系。因此也 無法判別該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品是否通過了轉(zhuǎn)基因安全評估。3.事件特異性的檢測方法鑒于獨立的轉(zhuǎn)基因事件中，外源基因在受體基因組中的整合位點具有隨機性，即 使相同的載體多次轉(zhuǎn)化，整合的位置也是不可重復(fù)的，因此，外源基因的整合位點具有高度 的特異性?？梢岳谜衔稽c的序列特征，開發(fā)出轉(zhuǎn)基因事件特異性的檢測方法。應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性定量分析。分離外源基因插入位點的旁側(cè)序列是建立事件特異性檢測方法的基礎(chǔ)。由于外源 基因在整合過程中，T-DNA和基因組之間可能發(fā)生重組，導(dǎo)致T-DNA邊界的部分缺失。增加 了分離插入位點旁側(cè)序列的難度。2000年2月，歐盟特別資助了 Qpcrgmofood European Project項目，該項目已經(jīng)成功分離得到多個品種旁側(cè)序列并應(yīng)用于建立轉(zhuǎn)基因事件的特 異性檢測。國內(nèi)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所盧長明研究員實驗室也相繼獲得了多種轉(zhuǎn) 基因油菜的旁側(cè)序列，并建立了相應(yīng)的事件特異性檢測方法。經(jīng)對現(xiàn)有專利和其他文獻的檢索，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于甘藍型轉(zhuǎn)基因油菜W-4事件外源 基因插入載體(pCNFIRnos)左邊界旁側(cè)序列和利用此序列建立的事件特異性PCR檢測的報道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明目的提供一種甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體 旁側(cè)序列及其應(yīng)用。技術(shù)方案本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明以甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜品系W-4為材料，利用TAIL-PCR技術(shù)擴增獲得 W-4事件外源插入載體左邊界旁側(cè)序列SEQ ID NO. 1。由來源于油菜基因組序列1至365 個堿基和來源于外源插入載體序列525個堿基共同組成。甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界旁側(cè)序列SEQ ID NO. 1，序 列總長度890堿基，其特征是第1至365個堿基來源于油菜基因組序列；
第366至890個堿基來源于外源插入載體序列。上述甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體邊界旁側(cè)序列的應(yīng)用(1)利用該序列特征設(shè)計的甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜外源基因整合事件W-4的事 件特異性定性PCR檢測方法；(2)利用該序列特征設(shè)計的甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜外源基因整合事件W-4的事 件特異性定量PCR檢測方法；(3)利用該序列特征設(shè)計的甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4的品系特異性定性定性 PCR檢測方法；(4)利用該序列特征設(shè)計的甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4的品系特異性定性定量 PCR檢測方法；有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的具有的優(yōu)點和效果如下1.本發(fā)明首次公開甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件外源基因插入載體左邊界 旁側(cè)序列。2.本發(fā)明首次分析并確認甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件插入載體左邊界序 列中不同堿基來源，并確定外源插入載體序列和油菜基因組序列的接合位點。3.利用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的序列特征，建立甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件以及甘藍
4型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜品系W-4特異性定性PCR檢測方法。4.利用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的序列特征，可以建立甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件以及 甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜品系W-4特異性定量PCR檢測方法。5.本發(fā)明適用于建立甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件以及甘藍型轉(zhuǎn)基因高油 酸油菜W-4的其他事件特異性PCR檢測方法等方面。


圖1-甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件左邊界結(jié)合位點，其結(jié)合位點特征序列。圖2-甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件特異性定性PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠 電泳圖譜。其中1-非轉(zhuǎn)基因油菜Westar基因組DNA模板，引物對LBFN1/LBR2 ；2-非轉(zhuǎn)基因油菜Westar基因組DNA模板，引物對LBFN2/LBR2 ；3-非轉(zhuǎn)基因油菜Westar基因組DNA模板，引物對LBFN3/LBR2 ；M DNA 分子量 Marker4-甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4基因組DNA模板，引物對LBFN1/LBR2 ；5-甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4基因組DNA模板，引物對LBFN2/LBR2 ；6-甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4基因組DNA模板，引物對LBFN3/LBR2 ；
具體實施例方式(一 )甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W_4(公知公用，見轉(zhuǎn)基因高油酸甘藍型油菜新種 質(zhì)的獲得陳松，等江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，25 (6) :1234 1237)事件外源基因插入位點載體 (pCNFIRnos)左邊界旁側(cè)序列的TAIL-PCR擴增。(1)甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4基因組DNA提取采用CTAB方法。取0. 5g葉 片放在研缽中，加液氮研磨成粉末；轉(zhuǎn)移至2. Oml離心管中；加入1.5ml提取緩沖液(2% CTAB, IOOmM Tris, 20mMEDTA, 1. 4M NaCl, ρΗ8· 0)，混勻；65°C水浴 1. 5 小時；加氯仿異戊 醇溶液(24 1)600 μ 1，上下顛倒數(shù)次混勻；13000rpm，離心15min ；取上清液于新的2ml離 心管中，加等體積氯仿異戊醇溶液(24 1)，上下顛倒混勻；離心，收集上清液，加0.6體 積異丙醇，置室溫下15分鐘以沉淀DNA ； lOOOOrpm，離心，IOmin ；去上清，收集沉淀；用70% 乙醇清洗沉淀2次；棄乙醇，真空干燥5min ；DNA用600 μ 1無菌水溶解；_20°C保存?zhèn)溆谩?2) TAIL-PCR擴增用引物設(shè)計根據(jù)fad2基因的ihpRNA表達載體pCNFIRnos (公 知公用，見甘藍型油菜種子特異性表達fad2基因的ihpRNA載體構(gòu)建，陳松，等中國油料作 物學(xué)報，2006，28 (3) 251-256)的T-DNA左邊界序列設(shè)計特異性引物，序列如下LBFNl 5' TAG CGT TGG CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AGC TT 3'；LBFN2 5' TTC TAT CGC CTT CTT GAC GAG TTC TTC TGA GC 3'；LBFN3 5' AGT TTC TCC ATA ATA ATG TGG AGT AGT TCC CA 3'；隨機引物 AD2 參考 Liu (1995)等(Liu Y-G, N. Mitsukawa and Τ. Oosumi. (1995) Efficientisolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetricinterlaced PCR. Plant Journal 8:457—463.) :5' NGT CGA(G/C)(A/T)G ANA(A/T)GA A3'。(3)第一輪TAIL-PCR擴增以IOOng的基因組DNA作為模板，在20 μ 1的反應(yīng)體 系中，含IOX緩沖液2μ 1，0. 2mM dNTPs,2. 5mM MgC12，引物濃度0. 25 μ M，左邊界引物組 合 LBFN1/AD2，IU 的 Tag 酶(TaKaRa)；反應(yīng)條件:95V 2min ；94°C lmin，62°C lmin，72°C 2. 5min，循環(huán) 5 次；94°C lmin，25°C 3min,ramp to 72°C 3min，72°C 2. 5min ；94°C 30sec, 68°C lmin,72°C 2. 5min,94°C 30sec,68°C lmin,72°C 2. 5min,94°C 30sec,44°C lmin, 72°C 2. 5min，循環(huán) 15 次；72°C 5min ；(4)進行第二輪P°C R時，將第一輪的產(chǎn)物稀釋50倍，取1 μ L作為模板，引物組 合分別為 LBFN2/AD2 ；反應(yīng)條件94°C 30sec，64°C lmin, 72°C 2. 5min,94°C 30sec，64°C lmin，72°C 2. 5min,94°C 30sec，44°C lmin，72°C 2. 5min，循環(huán) 15 次；72°C 5min ；(5)在第3輪PCR時，將第二輪的產(chǎn)物稀釋50倍，取1 μ L作為模板，引物組合分別 為 LBFN3/AD2 ；反應(yīng)條件:94V lmin, 44°C lmin，72°C 2. 5min，循環(huán) 30 次；72°C 5min ；(6) 瓊脂糖凝膠電泳同時檢測第2輪、第3輪擴增產(chǎn)物，參比第2輪擴增產(chǎn)物， 選擇第3輪擴增產(chǎn)物中大小與預(yù)期結(jié)果相符的條帶，回收、克隆并測序。(7)第3輪TAIL-PCR產(chǎn)物回收采用北京天恩澤基因科技公司出品的DNA凝膠回 收試劑盒。(8)第3輪TAIL-PCR產(chǎn)物克隆采用北京全式金生物技術(shù)有限公司出品的 pEASY-ΤΙ克隆試劑盒。取4 μ 1 TAIL-PCR擴增產(chǎn)物與1 μ 1 pEASY-Tl克隆載體(北京全式 金生物技術(shù)有限公司出品)室溫下連接5分鐘；加連接產(chǎn)物于50 μ 1 Transl-Tl感受態(tài)細 胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司出品)中，冰浴下25分鐘；42°C熱激40秒，立即置冰上 2分鐘；加800 μ 1 SOC溶液，于37°C下，振蕩培養(yǎng)1小時。(9)取上述培養(yǎng)液100 μ 1涂布于含50mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培 養(yǎng)過夜。(10)挑取單克隆，于1. 5ml含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，抽取 質(zhì)粒DNA，限制性酶切鑒定重組子。(11)篩選出陽性重組子克隆送上海英俊公司測序。將序列手工去除pEASY-Tl克 隆載體序列后，通過NCBI網(wǎng)站進行序列比對分析和載體序列掃描，確定插入載體左邊界與 油菜基因組的結(jié)合位點。(二)應(yīng)用方法(1)利用本發(fā)明提供的旁側(cè)序列設(shè)計轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件和轉(zhuǎn)基因高油酸 油菜品系W-4的事件特異性定性PCR檢測方法。(2)共設(shè)計合成的3對巢式引物序列如下LBFNl 5' TAG CGT TGG CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AGC TT 3' /LBR25' CTA TGT GCA GGG TTG TGC CTG AAAA 3'；LBFN2 5' TTC TAT CGC CTT CTT GAC GAG TTC TTC TGA GC 3' /LBR25‘ CTA TGTGCA GGG TTG TGC CTG AAAA 3'；LBFN3 5' AGT TTC TCC ATA ATA ATG TGG AGT AGT TCC CA 3' /LBR25‘ CTA TGTGCA GGG TTG TGC CTG AAAA 3'(3)分別提取甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4，非轉(zhuǎn)基因油菜Westar基因組DNA，以
6此為模板，用上述3組引物對組合進行PCR擴增。在20μ 1 的反應(yīng)體系中，含 IOX 緩沖液 2μ 1，0. 2mM dNTPs,2. 5mM MgC12，引物 濃度0. 25 μ M，左邊界引物組合依次為LBFN1/AD2，LBFN2/AD2, LBFN3/AD2, IU的Tag酶 (TaKaRa)；反應(yīng)條件95°C 4min ；94°C 45sec，58°C 45sec，72°C循環(huán) 35 次；72°C 5min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后，鑒定是否存在特異性擴增產(chǎn)物，且條帶大小依 次為:813bp，709bp，625bp。(三)實驗結(jié)果(1)甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界旁側(cè)序列的TAIL-PCR 擴增與測序分析。通過TAIL-PCR的3輪擴增，以轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W_4基因組DNA為模板，獲得一大 小約600bp的擴增產(chǎn)物，經(jīng)過克隆、測序，及人工剔除克隆載體pEASY-Tl序列后，獲得大小 為641bp的序列。進一步網(wǎng)上Blastn分析，發(fā)現(xiàn)其中276bp與插入載體左邊界序列同源， 該轉(zhuǎn)基因事件中，其左邊界重復(fù)序列保持完整，只是發(fā)生一個堿的顛換，由C顛換成了 T。通 過進一步與插入載體序列拼接產(chǎn)生一總長度為890bp的左邊界旁側(cè)序列。其中第1-365堿 基為油菜基因組序列，第366-890堿基為插入載體序列。在此序列中可以清楚找到所設(shè)計 的引物L(fēng)BFNl，LBFN2和LBFN3的位點。具體轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊 界旁側(cè)序列見序列SEQ IDN0. 1。上述分析顯示的序列包含轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界序列 特點，其結(jié)合位點特征序列如圖1所示。第1-365堿基為油菜基因組序列，與插入載體 pCNFIRnos的T-DNA(transfer_DNA)左側(cè)序列序列相鄰；第366-890堿基為插入載體上 T-DNA的左側(cè)序列。(2)利用本發(fā)明所提供的旁側(cè)序列設(shè)計轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件和轉(zhuǎn)基因高油 酸油菜品系W-4的事件特異性定性PCR檢測方法。以轉(zhuǎn)基因高油酸W-4、非轉(zhuǎn)基因油菜Westar基因組DNA為模板，利用W-4事件外 源插入載體左邊界旁側(cè)序列特異性引物L(fēng)BR2來自油菜基因組序列；LBFN1、LBFN2和LBFN3 來自載體序列。其位置如圖1所示。應(yīng)用引物組合LBFN1/LBR2、LBFN2/LBR2、LBFN3/LBR2進 行PCR擴增，結(jié)果如圖2所示。只有轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4可以擴增出大小分別為813bp， 709bp，625bp的產(chǎn)物，而非轉(zhuǎn)基因油菜則無此特異性產(chǎn)物。因此，可以認為此引物組合具有 很好的特異性，適合于事件特異性檢測。
權(quán)利要求
轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W 4事件外源插入載體左邊界旁側(cè)序列，其特征在于，由來源于甘藍型油菜基因組序列和來源于外源插入載體的序列共同組成的DNA序列，即為甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W 4事件外源插入載體左邊界旁側(cè)序列SEQ ID NO.1，其中(1)SEQ ID NO.1的第1 365堿基來源于油菜基因組序列；(2)SEQ ID NO.1的第366 890堿基來源于外源插入載體。
2.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界旁側(cè)序列的應(yīng)用， 其特征是利用該旁側(cè)序列設(shè)計甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜外源基因整合事件W-4的事件特 異性定性PCR檢測方法。
3.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界旁側(cè)序列的應(yīng)用， 其特征是利用該旁側(cè)序列設(shè)計甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4品系的特異性定性PCR檢測 方法。
全文摘要
本發(fā)明公開一種轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界旁測序列及其應(yīng)用，涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域中轉(zhuǎn)基因油菜的檢測。本發(fā)明以甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4為材料，獲得W-4事件外源插入載體左邊界旁側(cè)序列，見序列1。其中第1-365堿基為油菜基因組序列，第366-890堿基為載體序列。本發(fā)明依據(jù)旁側(cè)序列設(shè)計特異性引物，建立了甘藍型轉(zhuǎn)基因高油酸油菜外源基因整合事件W-4的事件特異性定性PCR檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK101967478SQ20101051369
公開日2011年2月9日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月20日
發(fā)明者付三雄, 周曉嬰, 張潔夫, 戚存扣, 浦惠明, 胡茂龍, 陳新軍, 陳松, 陳鋒, 顧彗, 高建芹, 龍衛(wèi)華 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院