專利名稱：利用染色體替換技術(shù)使鮭魚降鈣素蛋白在轉(zhuǎn)基因油菜油體中超高量、靶向表達的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及綜合利用植物油體特異表達技術(shù)和基因打靶技術(shù)進行染色體替換的方法，特別涉及利用Race技術(shù)克隆得到1900bp的油菜5’ UTR序列和酵母染色體重建蛋白&RAD54，以“油菜oleosin基因5游UTR序列-‘芝麻oleosin+CT融合蛋白基因，-Pnos-NPTII-Tnos-油菜oleosin基因3’ UTR序列”替代油菜基因組中的固有的內(nèi)源序列“油菜oleosin基因5，UTR序列-油菜oleosin基因-油菜oleosin基因3，UTR序列”，獲得的轉(zhuǎn)基因油菜籽油體中可超高量表達鮭魚降鈣素蛋白的方法。
背景技術(shù)：
基因打靶(gene targeting)產(chǎn)生于70年代末和80年代初，是指將攜帶有選擇標記的外源目的基因采用一定的實驗方法導入受體細胞，再通過外源DNA序列與受體細胞染色體上同源DNA序列間發(fā)生重組，最終將外源DNA定點整合入受體細胞基因組某一預定位點，改變細胞遺傳特性，或?qū)δ骋活A先確定的受體位點進行定點突變，導致受體細胞基因功能敲除或者點突變的技術(shù)。雖然基因打靶的原理和技術(shù)路線并不復雜，但是由于高等真核生物細胞內(nèi)外源DNA與靶細胞DNA序列發(fā)生同源重組的機率非常低，所以獲得定點整合的轉(zhuǎn)基因植株仍然是一件非常困難的工作。研究表明，植物細胞同源重組起始于DNA雙鏈斷裂(doublestrand break, DSB) 受體DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生DSB位點、供體DNA整合進入受體 DSB位點是進行同源重組的必要步驟。RAM4屬于SWI2/SNF2超家族，編碼蛋白具有ATP酶 /解旋酶的保守序列。RAM4在酵母中促進供體DNA向DSB位點的整合。酵母RAM4基因或鼠胚胎干細胞和雞DT40細胞系中的RAM4同源基因被破壞，基因靶向整合的幾率降低而輻射敏感性提高。在擬南芥中表達RAM4蛋白，基因靶向整合的幾率提高27倍，達到10_2 到 ΙΟ—1。植物種子中貯存的營養(yǎng)物質(zhì)主要包括蛋白、脂肪和碳水化合物。所有植物中的脂類物質(zhì)均以三酰甘油(triacylglycerolsTAG)的形式存在，只有jojcAa是唯一例外，它貯存蠟酯(wax esters) 0種子中的TAG分子之間不是彼此聚合的，而是分散成許多小的穩(wěn)定的亞細胞微滴，這些小的亞細胞微滴被稱為油體(Huang HC, 1992)。油體有其自身的結(jié)構(gòu)和特征，為直徑0. 5 2. 5 μ m的球體，其大小因植物種類的不同而不同，且受營養(yǎng)、環(huán)境影響。 油體的成份包括92 98%的中性脂類[主要為TAG及少量的二酰甘油(DAG)和自由脂肪酸]；1 4%的磷脂(PL)(主要為磷脂酰膽堿-占60% 70%及少量的磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)、1 4%油體蛋白oleosin和少量的油體鈣蛋白(CALE0SIN)、油體固醇蛋白(STER0LE0SIN)、細胞色素C還原酶。油體內(nèi)部為液態(tài)TAG，外部是由單層磷脂分子及其鑲嵌蛋白-oleosin組成的半單位膜。油體蛋白oleosin是小分子量(15 ^kD) 的堿性疏水蛋白，在種子中特異表達，為油體所特有，對維持油體的穩(wěn)定極為重要，占油體總重量的1 4%。不同物種來源的oleosin分子量不同，但都具有3個基本的結(jié)構(gòu)域， 即N端40 60個氨基酸組成的兩親性區(qū)域(兼具親水性和親脂性)，這一區(qū)域分布于油體表面朝向胞漿的一面；中間68 74個氨基酸的保守區(qū)域，為伸入油體內(nèi)部的反式平行 β-折疊結(jié)構(gòu)，這一區(qū)域的氨基酸序列在不同來源的oleosin中高度保守；位于或靠近C端的33 40個氨基酸組成的α-螺旋結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域兼具親水和親脂性，其帶正電荷的基團朝向油體表面的磷脂層(PL)，帶負電荷的部分位于油體表面朝向胞漿的一面。雖然所有的oleosin均具有上述3個結(jié)構(gòu)域(3個結(jié)構(gòu)域加起來約15kD)，但oleosin分子量的差別卻很大(15 ^kD)，多出的1 IlkD以C-端或N-端的延伸形式存在。通過對不同植物oleosin氨基酸序列的研究發(fā)現(xiàn)，不同oleosin分子間除中部疏水區(qū)域高度保守外，N端和C端氨基酸序列差異很大。這使人們想到，外源蛋白插入oleosin分子的N端或C端后， 不會影響oleosin在植物油體上的定位。植物油體表達體系正是以此為理論基礎建立起來的，將目的蛋白插在油體蛋白基因的N端或C端，構(gòu)成融合蛋白，在轉(zhuǎn)基因植物種子的油體上特異表達，利用油體親脂疏水的特性，將種子粉碎-離心-回收上層油相-去油，即可獲得融合蛋白，具有提取工藝簡單， 目的蛋白易于分離純化的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是提供一種綜合利用植物油體特異表達技術(shù)和基因打靶技術(shù)實現(xiàn)油菜染色體替換，在轉(zhuǎn)基因油菜籽油體中特異、超高量表達鮭魚降鈣素蛋白的方法。本發(fā)明利用染色體步移技術(shù)，克隆得到來源于甘藍屬油菜(Brassica napus) oleosin基因5’ UTR，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO=I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中的SEQ ID NO :1由2031個堿基組成。本發(fā)明中按照雙子葉植物偏愛密碼子人工合成了鮭魚降鈣素基因(Salmon Calcitonin, sCT)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 3的DNA序列3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中的SEQ ID NO 2由132個堿基組成，為便于獲得天然的鮭魚降鈣素，序列插入了腸激酶的酶切位點。本發(fā)明為提高同源重組的幾率從釀酒酵母基因組中PCR克隆得到了 RAM4蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 4的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 5的DNA序列
4
序列表中的SEQ ID NO 2由沈97個堿基組成，編碼具有序列表中SEQ ID NO 5的
氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中為確保獲得的轉(zhuǎn)基因油菜是同源重組而非隨機插入的轉(zhuǎn)基因油菜，我們引入了正、負篩選系統(tǒng)。正篩選系統(tǒng)采用的是抗化學試劑標記基因basta基因，正篩選系統(tǒng)采用的CodA基因。本發(fā)明中從大腸桿菌JM109基因組克隆了 CodA基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 6的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 7的DNA序列序列表中的SEQ ID NO 6由1284個堿基組成，編碼具有序列表中SEQ ID NO 7的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供在轉(zhuǎn)基因油菜籽油體中特異、超高量表達鮭魚降鈣素蛋白的方法是含有所述目標基因的植物表達載體導入植物組織或細胞后與染色體進行同源重組。用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它的參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。研究表明釀酒酵母RAM4蛋白可提高染色體同源重組的機率，本發(fā)明構(gòu)建含有 RAM4基因的植物表達載體pRAD3301。在pRAM4上有3個完整的基因表達盒，分別是 P35S-Basta-35SpolyA 表達盒、P^SIcRADM-iTnos 表達盒和 P35S-GUS-Tnos 表達盒。本發(fā)明中為實現(xiàn)油菜染色體同源重組，在轉(zhuǎn)基因油菜籽油體中特異、超高量表達鮭魚降鈣素蛋白的方法，構(gòu)建包括4個完整的基因表達盒的植物表達載體psCT，4個表達盒分別是 P35S-codA-Tnos 表達盒、1900bp 油菜 oleosin 基因 5，UTR- “芝麻 oleosin+sCT 融合蛋白基因” -Pnos-NPTII-Tnos表達盒、油菜oleosin基因3’ DNA序列表達盒和 P35S-codA-Tnos 表達盒。將pRAD3301和pGTO分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，用蘸花法轉(zhuǎn)化油菜，獲得轉(zhuǎn)基因油菜植株及株系。轉(zhuǎn)基因油菜后代分子生物學檢測結(jié)果表明，油菜基因組中的固有的內(nèi)源序列“油菜oleosin基因5’ UTR序列-油菜oleosin基因-油菜oleosin基因 3’ UTR序列”被新序列“油菜oleosin基因5’ UTR序列-‘芝麻oleosin+CT融合蛋白基因’ -Pnos-NPTII-Tnos-油菜oleosin基因3’ UTR序列”所取代，成功地綜合運用基因打靶技術(shù)和油體特異表達技術(shù)替換了油菜染色體部分序列，使鮭魚降鈣素蛋白在轉(zhuǎn)基因油菜籽中特異地、超高量地表達，目的蛋白表達量為種子總蛋白的10%，遠遠高于現(xiàn)有的外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中0. 2-1 %的表達量。該方法具有目的蛋白表達量高，表達的蛋白易于儲存和純化的顯著優(yōu)點。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為RAM4基因PCR產(chǎn)物的1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖2為pRAM4的限制性內(nèi)切酶HindIII酶切鑒定結(jié)果
圖3為中間載體p3301 EcoRI/Hindlll雙酶切鑒定結(jié)果圖4為植物表達載體pRAD3301 SacI、I^stI單酶切鑒定結(jié)果圖5為構(gòu)建oleosin基因5’上游序列步移文庫的1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖6為CodA基因PCR產(chǎn)物的1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖7為pCodA BamHI/SacI雙酶切鑒定結(jié)果圖8為中間載體pCodA121 BamHI/SacI雙酶切鑒定結(jié)果圖9為中間載體pCodAE2300/ka_EcoRI單酶切鑒定結(jié)果
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物均由上海生工合成，測序工作均由中國農(nóng)業(yè)科學院重大工程樓實驗室協(xié)助完成。實施例1、釀酒酵母RAM4基因的克隆一、釀酒酵母基因組的提取1)挑取酵母菌單菌落(購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號31141)，接種于10mlYPD(l%酵母提取物，2%葡萄糖，1.5%瓊脂粉，2%蛋白胨)液體培養(yǎng)基中，30°C 搖床培養(yǎng)過夜；2)取過夜培養(yǎng)的Iml酵母菌液，5000rpm離心5min，去上清，加入Iml無菌水， 重懸沉淀，5000rpm離心lmin，去上清，沉淀中加入200μ 1破菌buffer (1 % SDS, 2 % TritionX-100, IOOmM NaCl, IOmMTris-ClpH8. 0, ImM EDTA)，劇烈震蕩。3)加入200 μ 1酚/氯仿/異戊醇(體積比25 24 1)，劇烈震蕩，12000rpm離心5min，取上清，加入等體積氯仿，顛倒輕微震蕩，12000rpm離心5min，取上清，加入2倍體積無水乙醇和1/10體積NaAc，顛倒混勻，置于-20°C冷凍lOmin。4) 4°C 12000rpm離心，沉淀用70 %乙醇洗滌2遍，吹干，溶于20 μ 1水或TE溶液，-20°C保存?zhèn)溆?。二、RAD54基因PCR引物的設計根據(jù)GenBank (www. ncbi. nlm. nih. gov)公布的釀酒酵母RAM4基因(序列號為 M63232. 1)，設計5，引物Pl，3，引物P2，引物序列如下Pl :5’ -CTGCAGGATGGCAAGACGCAGATT-3’P2 :5’ -CTGCAGGTAAGAGATCAATGTG-3’三、RAM4基因的克隆以釀酒酵母基因組為模板，以引物Pl和P2進行RAM4基因的擴增，PCR程序為 先 95°C 5min ；再 94°C 30s，59°C lmin, 72°C lmin30s，共 32 個循環(huán)；最后 72°C IOmin0 PCR 反應結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示，在2700bp處有一明顯的擴增條帶。使用載體pMD18-T(TaKaRa，Cat. No. D504A)試劑盒進行PCR產(chǎn)物的克隆。具體方法為取步驟2獲得的PCR產(chǎn)物2 μ L，依次加入0. 5 μ L載體pMD18_T、2. 5 μ L Ligase Solution I，然后16°C連接他。將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍白斑篩選得到陽性重組克隆，將陽性克隆質(zhì)粒命名為PRAD54，用限制性內(nèi)切酶HindIII進行酶切鑒定， 對酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，表明2700bp的目的片段已正確連接入載體PMD18-T中，對pRAM4做進一步的測序鑒定，測序結(jié)果表明插入片段具有序列表中的核苷酸序列。實施例2、RAD54植物表達載體pRAD3301的構(gòu)建一、中間載體p3301的構(gòu)建本實施例所構(gòu)建的基因pRAD3301的表達盒中包括以下基因表達調(diào)控元件35S啟動子、RAM4基因和NOS終止子。首先將ρΤΩ4Α以限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII雙酶切，回收999bp片段，將其與相同酶切的植物載體PCAMBIA3301連接，得到中間載體，命名為 P3301。以EcoRI和HindIII雙酶切進行驗證，酶切鑒定結(jié)果如圖3所示，結(jié)果證明ρΤ Ω 4A 片段已經(jīng)連在PCAMBIA3301上。二、RAD54植物表達載體pRAD3301的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶I^stI酶切質(zhì)粒RAD54，回收2700bp片段，與相同酶切的載體 P3301連接，得到RAM4植物表達載體，命名為pRAD3301。對其分別用限制性內(nèi)切酶McI 和I3StI進行單酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖4所示，酶切產(chǎn)物片段大小分別為1170bp和 2700bp，與預期結(jié)果相符。實施例3、油菜oleosin基因5’上游序列的克隆植物材料油菜品種中雙4號，苗齡4周時。一、oleosin基因5’上游序列染色體步移引物的設計同源序列的大小是影響基因打靶效率的重要因素，構(gòu)建基因打靶載體時，一般要求需要有21Λ左右的DNA同源序列，但Genbank上已登錄的oleosin基因(序列號為 M63985)5，上游序列大小僅為944bp，為此，需用染色體步移進一步克隆oleosin上游序列。根據(jù)Genbank 上登錄的 oleosin 基因 5，UTR 序列和 GenomeWalker Universal Kit的要求，設計2個特異引物，引物序列如下GSPl :5’ -TAATCTCCGCCGCGTCTCTCTCTAAAC-3‘GSP2 :5’ -CCAAAGCTGCACTCTCTCTATCCAAAAG-3，二、oleosin基因5’上游序列的克隆用下述方法進行oleosin基因5’上游序列的克隆，具體過程包括以下步驟1)油菜基因組DNA提取取25 IOOmg新鮮油菜葉片，加液氮碾成粉末，轉(zhuǎn)入1. 5mL離心管中。加450 μ L 提取緩沖液(IOOmmol · L^1Tris-Cl, ρΗ 8. 0，500mmol · L-1NaCl, IOmmol · Γ1 β -巰基乙醇，50mmol · L-1EDTA, ρΗ 8. 0)及 100 μ LlO % SDS，劇烈振蕩。65°C水浴 30min，加 160 μ L 3mol · L^1NaAc (ρΗ 5. 2)，置冰上 20min。12000g 4°C離心 lOmin，取上清。加 2 倍體積的預冷的無水乙醇，顛倒混勻以利于DNA析出。用玻棒挑出絲狀DNA，置于1. 5mL小離心管中， 70 %乙醇漂洗數(shù)次后晾干備用。2)基因組DNA步移文庫的構(gòu)建參照GenomeWalker Universal Kit中的說明書進行。具體步驟如下①基因組DNA的酶切消化。將基因組DNA分別以Dral、EcoRV、PvuI和MuI平末端酶酶切消化，37°C，1 20h，以0. 6%的瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測酶切是否完全。②DNA的純化。在上一步酶切完全的EP管中加入等體積的苯酚，混勻，離心， 12000rpm,5min ；取上清到新的EP管中，加入等體積的氯仿，混勻，離心，12000rpm, 5min ；將
7上清吸到新的EP管中，每管加2倍體積冰預冷的95%的乙醇，1/10體積3mol · I^NaAc，輕輕混勻，4°C，14000rpm離心15min ；去上清，加入100 μ L冰預冷的80%的乙醇洗DNA，重復幾次，40C，HOOOrpm離心IOmin ；去掉液體，空氣干燥；用20 μ L無菌水溶解。③純化后的DNA與GenomeWalker 接頭的連接。將上一步回收的4管DNA分別與 Genomeffalker 接頭連接，16°C過夜，之后70°C，5min終止反應，構(gòu)建得4個基因組步移文庫(DL1、DL2、DL3 和 DL4)。3)0le0Sin基因5，上游序列的克隆oleosin基因5’上游序列的克隆通過兩輪PCR完成。①第一輪PCR反應在4個0. 5mL的EP管(Cl C4)中分別以構(gòu)建好的DNA 文庫(DLU DL2、DL3和DL4)為模板，以基因特異引物GSPl和接頭引物(Genomeffalker Universal Kit 提供)API (5，-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)在熱循環(huán)儀(BIO-RAD)上進行PCR反應。反應程序為95°C預變性5min ；隨后緊接著7個循環(huán)為94°C 25s, 72°C 3min ； 然后接著32個循環(huán)，94°C 25s，67°C 3min ；最后67°C延伸7min。反應完成后，將上述4管 PCR產(chǎn)物稀釋50倍(Dl D4)用作第二輪PCR擴增的模板。②第二輪PCR反應以基因特異引物GSP2和接頭引物 AP2(5，-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)進行 PCR 擴增，反應程序為首先 94°C 25s，72°C 3min 擴增5個循環(huán)；緊接著94°C 25s，67°C 3min擴增20個循環(huán)，最后67°C延伸7min。③PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖5所示1 λ DNA EcoRI/HindHI Marker2 =DarI酶切文庫3 =StuI酶切文庫4 =EcoRV酶切文庫5 =PvuII酶切文庫6 陰性對照7 試劑盒陽性對照8 試劑盒陰性對照9 試劑盒中提供構(gòu)建好的文庫)，通過膠回收純化后與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，篩選重組子酶切鑒定，測序驗證。4) oleosin基因5，上游序列的分析將重組子測序結(jié)果利用DNAMAN軟件進行分析，篩選獲得oleosin基因5’上游序列，將該陽性克隆命名為P0PF。實施例4、基因打靶載體pGTO的構(gòu)建實驗材料大腸桿菌JM109一、大腸桿菌CodA基因的克隆1)大腸桿菌基因組DNA的提?、偬羧. coli單菌落，接種到5ml帶有相應抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，200rpm、 37 °C培養(yǎng)過夜。②將2ml菌液加入2ml Eppendorf管中，12000rpm離心lmin，棄上清。③向管中加人200 μ 1 Solution I (50mM 蔗糖，IOmM EDTA pH8. 0,25mM Tris-Cl pH8. 0)混勻。④加入400 μ 1 SolutionII (1 % SDS, 0. 2M NaOH)，上下顛倒混勻 2 次。⑤迅速加入300μ1 SolutionIII (每 100ml 含 5Μ KAc 60ml，冰乙酸 11. 5ml，蒸溜水28. 5ml)，輕輕混勻，室溫放置IOmin。⑥12000rpm離心lOmin，吸上清于另一 EP管中。⑦分別用苯酚和氯仿各抽提一次，抽提條件是12000rpm離心lOmin。⑧小心取上清，加入2倍體積的無水乙醇，混勻，_20°C放置lOmin，12000rpm離心IOmin, DNA沉淀用70%乙醇洗2次，晾干備用。2)克隆CodA基因的引物設計根據(jù)GenBank(www. ncbi. nlm. nih. gov)公布的大腸桿菌CodA基因(序列號為 AY55^02)，設計5，引物codA5，3，引物codA3，引物序列如下CodA5 :5’ -GGATCCATGTCGAATAACGCTTTAC-3’CodA3 :5’ -GAGCTCTCAACGTTTGTAATCGATG-3’3) CodA基因的克隆以大腸桿菌JM109基因組為模板，以引物codA5和codA3進行PCR擴增，程序為 950C 5min ；94°C 30s,54°C 30s, 72°C lmin，共 32 個循環(huán)；最后 72°C IOmin0 反應結(jié)束后，對 PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖6所示，在1290bp處有一明顯的擴增條帶。使用載體pMD18-T(TaKaRa，Cat. No. D504A)試劑盒進行PCR產(chǎn)物的克隆。具體方法為取上一步獲得的PCR產(chǎn)物2 μ L，依次加入0. 5 μ L載體pMD18-T、2. 5 μ L Ligase Solution I，然后16°C連接8h。將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍白斑篩選得到陽性重組克隆，將陽性克隆質(zhì)粒命名為PCodA，用限制性內(nèi)切酶BamHI和McI進行雙酶切鑒定，對酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明1290bp的目的片段已正確連接入載體PMD18-T中(如圖7)，對pCodA做進一步的測序鑒定，測序結(jié)果表明插入片段是序列表中的核苷酸序列。二、中間載體pCodA2300/l r的構(gòu)建1)中間載體pCodA121的構(gòu)建及表達盒酶切位點的改變①中間載體pCodA121的構(gòu)建本實施例所構(gòu)建的基因pCodA121的表達盒中包括以下基因表達調(diào)控元件5’端的35S啟動子、基因CodA和3，端的NOS終止子。首先將質(zhì)粒pCodA以限制性內(nèi)切酶BamHI 和McI進行雙酶切，回收1290bp片段，將其與相同酶切的載體pBI121連接，構(gòu)成中間載體，命名為pCodA121。以BamHI和^icI雙酶切進行驗證，酶切鑒定結(jié)果如圖8所示，結(jié)果證明CodA片段已經(jīng)連在pBI121上。②中間載體pCodA121表達盒酶切位點的改變受可用限制性內(nèi)切酶位點的限制，本發(fā)明中將pCodA121表達盒兩端的酶切位點分別改變?yōu)镮 兩端都是Hindlll，命名為pCodA121H;II 兩端都是EcoRI，命名為 pCodA121E。2)中間載體pCodA2300/ka1 勺構(gòu)建①將pCAMBIA2300用限制性內(nèi)切酶BioI酶切消化，將nptll基因切下，再用T4連接酶連接，得到不含nptll基因的pCAMBIA2300，命名為pCAMBIA2300/ka\②將質(zhì)粒pCodA121E用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切消化，回收MOObp片段，與相同酶切的pCAMBIA2300/l r連接，得到中間載體，命名為pCodAE2300/ka\以EcoRI單酶切驗證，證明MOObp片段已經(jīng)連在pCodAE2300/ka_上，酶切鑒定結(jié)果如圖9所示。以限制性內(nèi)切酶I3StI單酶切，驗證CodA表達盒的方向。③將質(zhì)粒pCodA121H用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切消化，回收MOObp片段，與相同酶切的pCodAE2300/ka-連接，得到中間載體，命名為pCodA2300/ka-。以HindIII單酶切CN 102373196 A
說明書
8/9頁 驗證MOObp片段是否連上，以限制性內(nèi)切酶BamHI單酶切驗證方向，此步連上的CodA表達盒的方向需與上步的方向相反。三、基因打靶載體pGTO的構(gòu)建基因打靶載體pGTO所用的內(nèi)源序列I(OPF)為實施例3獲得的油菜oleosin基因 5，上游序列，內(nèi)源序列II(OPS)為油菜oleosin基因全長(包括exonl+intronl+exon2+in tron2+polyA)，目的基因為鮭魚降鈣素(sCT，本實驗室構(gòu)建好的)，正篩選標記為NptII (具有卡那霉素抗性)，負篩選標記為CodA。構(gòu)建過程如下所示設計引物從質(zhì)粒pB1121中將NptII表達盒序列PCR擴增出來，序列長度為 178;3bp，引物序列如下Npt5 5，-GGATCCAACGACAATCTGATC-3，Npt3 5，-GAATTCGCCCGATCTAGTAAC-3，將擴增出來的序列連到PMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，酶切驗證正確的送測序，將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒以BamHI和EcoRI雙酶切，將得到的1783bp片段，與相同酶切的載體Bluescript II KS+/-連接，得到中間載體，命名為pBluA。根據(jù)實施例3得到的序列設計引物，從油菜基因組中PCR得到ISOObp產(chǎn)物，將其連在pMD19-T載體上，測序，正確的克隆命名為0PF(內(nèi)源序列1)。將OPF以限制性內(nèi)切酶 XhoI和EcoRI雙酶切，將得到的片段與相同酶切的中間載體pBluA連接，得到中間產(chǎn)物，命名為pBluB。根據(jù)實驗室已有的質(zhì)粒pBOSC (載體為ρΤ Ω 4A，基因為油菜promoter-His6_芝麻 oleosin-EK-sCT)設計引物，將 His6_ 芝麻 oleosin-EK-sCT-NOS ter 這一段基因 PCR 擴增出來，改變酶切位點為兩端都是EcoRIdf PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，測序，將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒以限制性內(nèi)切酶EcoRI單酶切，回收780bp片段，與相同酶切的中間載體 PBluB連接，得到中間載體，命名為pBluC。引物序列如下Hoec5 :5， -GGATCCAACGACAATCTGATC-3，Hoec3e :5， -GAATTCGCCCGATCTAGTAAC-3，根據(jù)Genbank上已登錄的oleosin基因(序列號為M63985)設計引物，從油菜基因組中PCR擴增內(nèi)源序列2，將PCR產(chǎn)物連到pMD19-T載體上，測序，正確克隆命名為pOPS。 將POPS質(zhì)粒以限制性內(nèi)切酶SpeI單酶切，回收1672片段，與相同酶切的中間載體pBluC 連接，得到中間產(chǎn)物，命名為pBluD。將中間載體pBluD以限制性內(nèi)切酶KpnI單酶切，回收片段，與載體p2300/ka-COdA 連接，得到基因打靶載體，命名為PGT0。實施例5、轉(zhuǎn)基因油菜的獲得植物材料油菜中雙4號一、植物表達載體pRAD3301和pGTO將構(gòu)建好的通過熱激法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404。具體方法如下1)米用 Promega 公司的 WizardTM plus minipreps DNA purification system, 提取質(zhì)粒DNA加入到100 μ LLBA4404感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴5min。2)將離心管置液氮中冷凍5min，迅速轉(zhuǎn)至37°C水浴中溫浴5min。3)加入ImL YEB液體培養(yǎng)基，在搖床上250rpm復蘇4_釙。
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4)取適量菌液涂布到含利福平50mg/L和Kan (卡那霉素)100mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上，置28°C培養(yǎng)24-48h。挑取單菌落堿裂解法提取質(zhì)粒DNA篩選不同的重組子，轉(zhuǎn)化Ε. coli JM109，(具體方法同上)，酶切驗證將pRAD3301、pGTO轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。二、in planta方法轉(zhuǎn)化油菜從平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種到5mLYEB液體培養(yǎng)基中(Kan 100mg/L+Rif 50mg/L)，振蕩培養(yǎng)過夜，取ImL菌液接種到50mL Y^液體培養(yǎng)基(Kan 100mg/L+Rif 50mg/ L)中，劇烈振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 4-0. 5 (約3_4h)，2100g離心5min,菌體MSO培養(yǎng)基洗一次，重懸，使0D660 = 1 1. 5。將上述的農(nóng)桿菌懸浮液在5000 Xg下離心lOmin，沉淀后的農(nóng)桿菌用IL新鮮的LB 培養(yǎng)基重新懸浮。為提高侵染的轉(zhuǎn)化效率，添加了 0. 5%的表面活性物質(zhì)有機硅和5%的蔗糖。用農(nóng)桿菌懸浮液直接浸染油菜花序。選擇花即將開放且沒有露水和泥土的的分枝，剪去分枝上已經(jīng)開放的花。將枝條彎曲，使整個花序浸泡在盛有菌液的燒杯中，上下?lián)u動Imin 左右。在確保所有花都已被浸染后，用雜交袋將處理過的花序套住。整個過程自第一次浸染后每天進行一次，共5-10次。每次浸染選擇清晨和傍晚進行，以避免太陽紫外線過強使農(nóng)桿菌活性降低。雨天暫停浸染。待種子成熟時，將經(jīng)過in planta處理過的分枝剪下單獨收獲種子，曬干后脫粒儲藏。三、基因打靶轉(zhuǎn)基因油菜的篩選將in planta處理獲得種子滅菌后均勻播撒于含有270mg· L-I卡那霉素和 500mg-L-15-氟胞嘧啶的MS固體培養(yǎng)基上。四到五天后，in planta方法獲得的種子在含卡那霉素和5-氟胞嘧啶的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)出幼苗。萌發(fā)的幼苗中轉(zhuǎn)入外源基因者具有卡那霉素抗性，可以正常存活；未轉(zhuǎn)入外源基因的幼苗不具有卡那霉素抗性，子葉葉片邊緣褐化，在子葉及第一片真葉表面出現(xiàn)白斑，葉柄變紫變紅，最終死掉。CodA蛋白可將無毒5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為有毒的5-氟脲嘧啶。轉(zhuǎn)基因油菜中非同源重組的轉(zhuǎn)基因油菜由于CodA蛋白而將非同源重組的轉(zhuǎn)基因油菜殺死。將存活下來的幼苗移栽至營養(yǎng)缽，經(jīng)DNA檢測確信外源基因的存在后移至土壤中。
權(quán)利要求
1.油菜oleosin基因5，UTR序列，是下列序列之一1)序列表中SEQID NO 1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID NO 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。 所述高嚴謹條件為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中的SEQ ID NO 1由1900個堿基組成。利用染色體步移技術(shù)，克隆得到1900bp 油菜 oleosin 基因 5，UTR。
2.按照雙子葉植物偏愛密碼子人工合成了鮭魚降鈣素基因，是下列序列之一1)序列表中SEQID NO 2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID NO 3的DNA序列3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID NO 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。 所述高嚴謹條件為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中的SEQ ID NO :2由132個堿基組成，編碼40個氨基酸。為便于獲得天然的鮭魚降鈣素，在鮭魚降鈣素基因5’端引入了腸激酶的酶切位點。
3.釀酒酵母RAM4蛋白的基因序列，是下列序列之一1)序列表中SEQID NO 4的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID NO 5的DNA序列序列表中的SEQ ID NO 2由沈94個堿基組成，編碼898個氨基酸。
4.大腸桿菌CodA基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 6的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID NO 7的DNA序列序列表中的SEQ ID NO 6由1284個堿基組成，編碼427個氨基酸。
5.含有權(quán)利要求2、3、4、和5所述基因構(gòu)建的表達載體，轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌。
6.一種綜合利用植物油體特異表達技術(shù)和基因打靶技術(shù)實現(xiàn)油菜染色體替換，在轉(zhuǎn)基因油菜籽油體中特異、超高量表達鮭魚降鈣素蛋白的方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，該方法通過在轉(zhuǎn)基因油菜中過量表達&RAM4蛋白，使編碼芝麻oleosin+sCT融合蛋白的基因通過同源重組的方式，靶向整合到油菜基因組中， 并在油菜油體中特異地、超高量地表達。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中的目的蛋白包括但不限于芝麻oleosin+sCT融合蛋白、sCT、突變型sCT、高胰血糖素類似肽GLP-I等醫(yī)用或工業(yè)用蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求5、6所述的方法所獲得的表達目的蛋白的轉(zhuǎn)基因植物包括根、莖、葉、 花、果、種子等所有植物體部分和細胞、組織等。
10.根據(jù)權(quán)力要求9獲得的油菜作為親本雜交或轉(zhuǎn)育所產(chǎn)生的植物。
全文摘要
本發(fā)明是一種綜合利用植物油體特異表達和基因打靶來實現(xiàn)染色體靶向替換，在轉(zhuǎn)基因油菜籽中超高量表達鮭魚降鈣素蛋白的方法。用Race克隆得到1900bp的油菜5’UTR序列，以“油菜oleosin基因5游UTR序列-‘芝麻oleosin+CT融合蛋白基因’-Pnos-NPTII-Tnos-油菜oleosin基因3’UTR序列”替代油菜基因組中的固有的內(nèi)源序列。通過inplanta法，獲得轉(zhuǎn)基因油菜植株及株系。檢測結(jié)果表明，油菜基因組中的內(nèi)源序列被新序列所取代，成功的實現(xiàn)了目標基因的靶向表達，使鮭魚降鈣素蛋白在轉(zhuǎn)基因油菜籽中超高量地表達。該方法具有目的蛋白表達量高，表達的蛋白易于儲存和純化的顯著優(yōu)點。
文檔編號C12N15/12GK102373196SQ20101024771
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者劉昱輝, 李梅, 李珊珊, 賈士榮 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所