專利名稱：一種聚乙二醇修飾的降鈣素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚乙二醇修飾的降鈣素，具體為雙端活化的聚乙二醇修飾的降鈣
O
背景技術(shù)：
降鈣素(calcitonin)是由甲狀腺濾泡旁細胞(又稱c細胞)分泌的或非哺乳脊椎動物的腮腺合成分泌的，是一種降低血鈣和血磷的激素。是鈣代謝過程中的三大調(diào)節(jié)激素之一。降鈣素是多肽類物質(zhì)，能直接作用于破骨細胞的受體，抑制破骨細胞活性，促進成骨細胞形成、轉(zhuǎn)化為正常代謝。骨質(zhì)疏松癥患者可以通過補充外源性降鈣素，來刺激垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素，達到防止骨質(zhì)流失、增加骨量、提高骨骼強度的作用，同時還具有明顯的對骨骼的鎮(zhèn)痛作用。目前應(yīng)用的藥品主要是鮭降鈣素和依降鈣素。以鮭降鈣素(sCT)的活性較好，鮭降鈣素(Mlcalcitonin)是由32個氨基酸組成的多肽類物質(zhì)，是一類具有高度活性的降鈣素。目前的主要臨床藥物有注射劑和噴鼻劑兩種劑型。降鈣素在體內(nèi)代謝穩(wěn)定性較差，體內(nèi)半衰期短(如sCT的半衰期為Hmin)。給藥不方便，造成病人依從性下降，如治療骨質(zhì)疏松癥需每日給藥一次，高鈣血癥需每日一次或分兩次皮下或肌內(nèi)注射，如果注射的劑量超過ani，采取多個部位注射。對有效治療骨質(zhì)疏松癥的降鈣素類藥物的研究和應(yīng)用已有多年歷史，但仍未克服其在體內(nèi)代謝穩(wěn)定性差的問題，藥物的長效研究已經(jīng)成為近年來降鈣素研究的新熱點。大量文獻報道，化學(xué)修飾是延長蛋白質(zhì)藥物半衰期的一個有效途徑。它是一種將分子量小的蛋白質(zhì)藥物共價連接到具有較大分子量的分子上，例如聚乙二醇和白蛋白共價連接到大分子上能減小免疫原性，改善可溶性和生物學(xué)利用度，以及增加抗蛋白水解作用， 同時也能夠延長半衰期，減少給藥次數(shù)。其中，聚乙二醇(PEG)是由環(huán)氧乙烷聚合而成的大分子聚合物，PEG類修飾劑和其他修飾劑相比，具有無毒性，良好的溶解性，免疫原性低，且相對分子量范圍寬，選擇余地大等優(yōu)點。而且PEG可以將它的許多優(yōu)良特性賦予修飾后的生物分子。經(jīng)聚乙二醇共價修飾后，蛋白質(zhì)藥物的相對分子質(zhì)量有所增加，減少了藥物排泄，增加其抵抗蛋白酶分解的穩(wěn)定性，降低免疫原性，這些改變均有利于延長藥物在體內(nèi)的半衰期，從而，蛋白質(zhì)藥物的藥代動力學(xué)和藥效性質(zhì)得到明顯改善。例如，PEG修飾的干擾素α (IFN α)與未修飾的IFN α相比，半衰期延長10 20倍；超氧化物歧化酶PEG修飾前半衰期為5min，PEG修飾后半衰期延長至4.池。PEG修飾劑可以針對sCT肽鏈中不同的氨基酸殘基側(cè)鏈基團進行修飾，sCT中 N-端Cys1的α -氨基、Lys11和Lys18的ε -氨基均可發(fā)生PEG化反應(yīng)。PEG對sCT修飾產(chǎn)物中存在mono-，di-和tri-PEG三種類型，它們又都表現(xiàn)出了不同的藥代動力學(xué)特性，同時，mono-, di-修飾的PEG-sCT在藥物體內(nèi)組織分布方面也表現(xiàn)出不同特性。專利US6506730，降鈣素修飾位點為N端、Lysll和Lysl8，修飾劑為分子量為 200 20000的聚乙二醇。US 20060063914通過保護劑Fmoc or或Nsc保護蛋白或多肽的某些基團，進行PEG反應(yīng)，再脫除保護劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種聚乙二醇修飾的降鈣素，其中所用聚乙二醇雙端均經(jīng)過活化，活化后的醛或羰基與降鈣素的游離氨基反應(yīng)形成共價交聯(lián)的柔性分子，從而提高其穩(wěn)定性， 延長半衰期，降低給藥次數(shù)。本發(fā)明通過對PEG雙端活化，形成一種新的修飾劑ALD-PEG-ALD，方法參考文 獻 J. MiltonHarris, Evelyn C.Struck. Synthesis and Characterrization of Poly (ethylene GlycoDDerivatives，采用該新型修飾劑對鮭魚降鈣素進行修飾，獲得一種全新的多肽修飾藥物。


圖.SCT及其修飾物sCT-PEG-sCT的藥效學(xué)比較(注sCT組動物血鈣值在4.5小時時降到最低，下降了 50%左右，30小時時基本恢復(fù)至給藥前水平，36小時完全恢復(fù)正常值，而sCT-PEG-sCT組動物在8. 5小時時降至最低并維持此低水平至20小時，60小時時恢復(fù)至正常值，并且下降幅度也達到50%左右，因而可見修飾后的降鈣素相對于sCT有長效作用，并且能使血鈣維持低水平至少10小時以上。)
具體實施例實施例1雙端活化聚乙二醇獲得ALD-PEG-ALD以分子量為2000的藥用級聚乙二醇為底物，加入草酰氯，DMSO在-60 V 到-70°C Swern反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用三乙胺淬滅，二氯甲烷萃取，飽和的氯化鈉清洗，濃縮至干，加乙醚析出固體，抽濾干燥生成雙端活化的聚乙二醇ALD PEG-ALD。實施例2ALD-PEG-ALD修飾鮭魚降鈣素sCT純品濃度調(diào)節(jié)至3. Omg/ml，加入20mM氫硼氰化鈉，充分溶解，按摩爾比 sCT ALD-PEG-ALD2000 = 1 1,1 5,1 10 加入 ALD-PEG-ALD，4°C反應(yīng) 24hr，以確定兩種試劑的最佳比例。用非還原電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要為雙修飾產(chǎn)物，掃描分析修飾率達到80%。利用S-100分子篩層析將修飾物sCT-PEG-sCT與其他多修飾分子及未修飾的sCT 分離。目標物質(zhì)可用非還原電泳檢測，分離后純品凍干保存。實施例3修飾位點的鑒定分別對sCT-PEG-sCT和sCT進行胰蛋白酶酶切，采用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)sCT-PEG-sCT比sCT質(zhì)譜圖鋪中缺失N-端的 Cys1-Lys11,可以確定PEG應(yīng)該修飾在N端的Cysl位。實施例4藥效學(xué)評價sCT-PEG-sCT的降鈣活性測定主要依據(jù)sCT的效價測定方法。健康雌性大白鼠(體重40 150g，每次實驗各鼠體重相差不超過20g)，禁食18 個小時(同時喂蒸餾水)，在隨機分成4組，每組不少于5只，稱重，編號，按體重和順序自腹部皮下每組注射一種濃度的標準品或供試品稀釋液，注射體積按每IOOg鼠0. 4ml計算， 給藥后準確1小時按給藥順序自眼眶靜脈叢采血，使血液滴入小試管中，每鼠約取血10 15滴，3000r/min離心15 20min。取血清50 μ 1，加鈣顯色劑4. 0ml，搖勻，立即在570nm 波長處測定吸收度。每次實驗同時取各種濃度的鈣標準液與血清樣品同條件操作做標準曲線，求得血清樣品的鈣值。結(jié)果見附圖，sCT組動物血鈣值在4. 5小時時降到最低，下降了 50%左右，30小時時基本恢復(fù)至給藥前水平，36小時完全恢復(fù)正常值，而sCT-PEG-sCT組動物在8. 5小時時降至最低并維持此低水平至20小時，60小時時恢復(fù)至正常值，并且下降幅度也達到50%左右，因而可見修飾后的降鈣素相對于sCT有長效作用，并且能使血鈣維持低水平至少10小時以上。實施例5全身過敏反應(yīng)檢驗豚鼠60只，雌雄各半，體重250_300g，均分為三組，將sCT與sCT-PEG-sCT按人用劑量的三倍腹腔給藥，隔日一次，給藥三次，使其致敏，將sCT與sCT-PEG-sCT按人用劑量的六倍與致敏后的第14天，21天分別于豚鼠小腿脛靜脈注射激發(fā)，30min內(nèi)觀察并記錄結(jié)果。表1豚鼠全身過敏試驗級數(shù)判斷標準
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇修飾的降鈣素，其特征在于該聚乙二醇化降鈣素是以聚乙二醇為連接物的兩個降鈣素分子的串聯(lián)體。
2.權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的降鈣素，其特征在于所用降鈣素可以是鮭魚降鈣素、鰻魚降鈣素，也可以是人降鈣素，優(yōu)選鮭魚降鈣素。
3.權(quán)利要求1-2所述的聚乙二醇修飾的降鈣素，其特征在于所用的聚乙二醇雙端均經(jīng)過活化，并且都能與降鈣素共價交聯(lián)。
4.權(quán)利要求1-3所述的聚乙二醇修飾的降鈣素，其特征在于聚乙二醇兩端被活化成醛或酮結(jié)構(gòu)，優(yōu)選為醛結(jié)構(gòu)。
5.權(quán)利要求1-4所述的聚乙二醇修飾的降鈣素，其特征在于所用聚乙二醇分子量從 200-200000道爾頓，優(yōu)選2000-10000道爾頓，更優(yōu)選為2000道爾頓。
6.含有如權(quán)利要求1-5所述的聚乙二醇修飾的降鈣素的藥物制劑在制備用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚乙二醇修飾的降鈣素，旨在提供一種免疫原性低、活性高、半衰期長、給藥次數(shù)少、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥物。其中的聚乙二醇雙端活化，通過與多肽的游離氨基連接將兩個降鈣素連接成一個柔性分子。
文檔編號C07K14/585GK102190719SQ201010117318
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者吳彥卓, 徐明波, 楊仲璠, 王俊玲, 趙晶晶 申請人:北京雙鷺立生醫(yī)藥科技有限公司, 北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司