專利名稱：基因重組降鈣素或降鈣素類似物的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種基因重組降鈣素或降鈣素類似物的制備工藝。
降鈣素是一種內(nèi)源性的含32個(gè)氨基酸殘基的鈣調(diào)節(jié)激素。主要作用于骨?，F(xiàn)已從多種動(dòng)物分離得到降鈣素(人、鼠、牛、豬、雞、鮭魚、鰻魚、蛙)，并化學(xué)合成其中5種或降鈣素類似物。臨床使用的為鮭魚降鈣素、人降鈣素、豬降鈣素及鰻魚降鈣素的類似物。現(xiàn)降鈣素臨床適應(yīng)癥主要包括高鈣血癥、佩吉特病、骨質(zhì)疏松癥、維生素D中毒癥、骨痛癥、急性胰腺炎。
由于降鈣素的實(shí)用價(jià)值，全世界許多公司和廠家正在研究生產(chǎn)降鈣素的新方法或新工藝。目前，市場(chǎng)上的商品均為化學(xué)合成，由于其工藝復(fù)雜，對(duì)硬件設(shè)備、合成試劑、生產(chǎn)環(huán)境要求苛刻，使得產(chǎn)品成本昂貴、規(guī)?；a(chǎn)的固定投入巨大，且易污染環(huán)境。本世紀(jì)80年代生物技術(shù)特別是基因工程技術(shù)的發(fā)展，為生物合成多肽、蛋白質(zhì)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。M.Yabuta(Appl Microbiol Biotechnol42:703-708)和Martha V.L.Ray(Bio/Technology,1993,11:64-70)等通過(guò)基因工程生產(chǎn)降鈣素都是先由大腸桿菌表達(dá)得到羧基端(C末端)為甘氨酸(Gly)的降鈣素前體，再經(jīng)α-酰胺化酶(α-AE)的作用，加工為成熟重組降鈣素。這是由于大腸桿菌原核的表達(dá)系統(tǒng)不具備翻譯后酰胺化修飾作用，因此所得的C末端為Gly的由33個(gè)氨基酸組成的降鈣素前體，必須用α-AE才能修飾C末端產(chǎn)生成熟降鈣素，但問(wèn)題是α-AF尚未商品化，通過(guò)生物提取或基因工程得到α-AE工藝復(fù)雜，不僅造成降鈣素生產(chǎn)周期延長(zhǎng)，又提高了成本。也有研究通過(guò)使用具有乙酰化功能的細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)C末端酰胺化的，例如Silvia Merli等(Protein Expression and Purification,1996,7:347-354)將人降鈣素基因克隆在真核表達(dá)載體pRC/RSV上，轉(zhuǎn)染具有酰胺化作用的鼠垂體細(xì)胞(AtT-20)，經(jīng)G-418抗性篩選，得到分泌成熟重組人降鈣素的細(xì)胞株。但是由于產(chǎn)率極低，故至今該酰胺化線路只能停留于實(shí)驗(yàn)室階段。因此，基因工程制備降鈣素的關(guān)鍵是C末端酰胺化。
本發(fā)明的目的是改革上述基因工程的制備工藝，提供一種工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、不造成環(huán)境污染的生產(chǎn)降鈣素或降鈣素類似物的新工藝。
本發(fā)明利用基因工程制備降鈣素或降鈣素類似物主要在C末端酰胺化方面作了至關(guān)重要的改進(jìn)1．使大腸桿菌基因表達(dá)的降鈣素或降鈣素類似物前體C末端為亮氨酸(Leu)或丙氨酸(Ala)或其它可被羧基肽酶-Y水解的氨基酸，以便使用已經(jīng)商品化且價(jià)格低廉的羧基肽酶-Y進(jìn)行C末端酰胺化。
2．采用羧基肽酶-Y修飾降鈣素或降鈣素類似物前體時(shí)，加入鄰硝基苯甘氨酰胺(O-PNGA)，使降鈣素或降鈣素類似物前體的第33位氨基酸被O-PNGA取代，成為光敏感中間體，再通過(guò)光解作用，就得到C末端為NH2的線形肽。此舉提高了酰胺化效率，降低了酰胺化的成本。
本發(fā)明利用基因工程生產(chǎn)重組降鈣素或降鈣素類似物，主要步驟如圖1所示，包括1．合成降鈣素或降鈣素類似物前體基因片段為提高降鈣素或降鈣素類似物在大腸桿菌中的表達(dá)量，按照降鈣素或降鈣素類似物前體的氨基酸序列，用大腸桿菌的偏愛密碼，編碼成若干基因片段，使位于全長(zhǎng)基因C末端為丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)或其它可以被羧基肽酶-Y水解的氨基酸的密碼子，以便使由大腸桿菌表達(dá)出的產(chǎn)物，可用羧基肽酶-Y進(jìn)行C末端酰胺化?；蚱尾捎脕喠姿岫シㄓ葾BI 391 DNA合成儀合成。
2．構(gòu)建含降鈣素或降鈣素類似物前體基因的克隆載體的工程菌將合成的基因片段按常規(guī)用《BASIC METHODS IN MOLECULARBIOLOGY》方法拼接起來(lái)。首先將片段磷酸化，再加熱至96℃后，退火到室溫，拼接成全長(zhǎng)降鈣素或降鈣素類似物前體基因，然后通過(guò)連接酶的作用與經(jīng)BamH1、Xho1雙酶切的pGEM-7z克隆載體相連接，成為pGEM-降鈣素或降鈣素類似物前體克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，根據(jù)α互補(bǔ)作用篩選含pGEM-降鈣素或降鈣素類似物前體基因的陽(yáng)性克隆工程菌。
3．構(gòu)建含降鈣素或降鈣素類似物前體基因的融合表達(dá)載體的工程菌將含有pGEM7z-降鈣素或降鈣素類似物前體基因的單菌落和含有pGEX-4T-3質(zhì)粒的單菌落分別于LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，純化質(zhì)粒，用BamH1、Xho1雙酶切，再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收降鈣素或降鈣素類似物前體基因和雙酶切完全的pGEX-4T-3載體片段，按降鈣素或降鈣素類似物前體基因雙酶切完全的pGEX-4T-3載體片段為1∶3的摩爾量比進(jìn)行連接，形成pGEX-4T-降鈣素或降鈣素類似物前體基因，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得工程菌。將其質(zhì)粒DNA經(jīng)雙酶切和DNA測(cè)序鑒定插入序列后，進(jìn)行融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的鑒定。
4．降鈣素或降鈣素類似物工程菌的高密度發(fā)酵將工程菌接種于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，作為一級(jí)種子，次日將一級(jí)種子接種于含2％甘油的2-YT培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)，用作二級(jí)種子(詳見Lee SY,TIBTECH,1996,14:98-105)，然后將二級(jí)種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程pH控制在7.0左右，溶解氧在35％左右，攪拌速度逐漸增大，最高轉(zhuǎn)速每分鐘800轉(zhuǎn)(詳見M.Yabuta,Y.Suzuki,K.Ohsuye.Appl Microbiol Biotechnol.1995,42:703-708)。
5．分離純化降鈣素或降鈣素類似物前體按常規(guī)采用親和層析從高密度發(fā)酵獲得的菌體中純化得到谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶-降鈣素或降鈣素類似物前體的融合蛋白，經(jīng)酶或化學(xué)裂解，再經(jīng)離子交換層析、反相凝膠脫鹽，獲得高純度的降鈣素或降鈣素類似物的前體。
6．降鈣素或降鈣素類似物前體經(jīng)體外酰胺化，復(fù)性成為成熟降鈣素或降鈣素類似物將含1mM EDTA、200mM O-PNGA的溶液用5N NaOH調(diào)pH值到6.0，加入降鈣素或降鈣素類似物前體、羧基肽酶-Y，于35℃保溫，反應(yīng)完成后用RP-C18脫鹽和純化，冷凍干燥，得到光敏感的中間體降鈣素-0-PNGA或降鈣素類似物-0-PNGA。將產(chǎn)物溶解于60mM NaHSO3甲醇-水溶液中，充入氬氣5分鐘，開始光解可得到線形降鈣素或降鈣素類似物，反應(yīng)完成后用RP-C18脫鹽，再用高效液相(HPLC)純化。純化得到的線形肽，經(jīng)空氣氧化折疊，重建二硫鍵[以二甲基亞砜，半胱氨酸，K3(FeCN6)或谷胱甘肽為介質(zhì)的系統(tǒng)]，得到具有生物活性的降鈣素或降鈣素類似物。
6．測(cè)定活性按《中國(guó)藥典》方法。將體重為40-50g同一來(lái)源、同一品系、同一性別的健康大白鼠，隨機(jī)分成5組(對(duì)照組、生產(chǎn)樣品高濃度組、生產(chǎn)樣品低濃度組、標(biāo)準(zhǔn)品高濃度組、標(biāo)準(zhǔn)品低濃度組)，每組10只，編號(hào)后，分別按順序，尾靜脈注射0.4ml相應(yīng)濃度的降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品、生產(chǎn)樣品及空白稀釋液。給藥后準(zhǔn)確1小時(shí)，分別取血樣，用鄰甲酚酞絡(luò)合劑比色法測(cè)定血鈣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果按《中國(guó)藥典》附錄檢定統(tǒng)計(jì)法中量反應(yīng)平行線計(jì)算，隨機(jī)設(shè)計(jì)法計(jì)算效價(jià)以及實(shí)驗(yàn)誤差。并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)可靠性檢驗(yàn)。


圖1本發(fā)明操作流程2人降鈣素類似物前體基因的拼接片段序列F1-F6圖3人降鈣素類似物前體基因全長(zhǎng)序列圖4高密度發(fā)酵不同時(shí)間蛋白表達(dá)量的電泳圖譜圖5谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶-人降鈣素類似物前體親和純化的電泳圖譜圖6人降鈣素類似物前體電噴霧-質(zhì)譜鑒定圖譜圖7人降鈣素類似物電噴霧-質(zhì)譜鑒定圖譜圖8鮭魚降鈣素前體基因全長(zhǎng)序列圖9鮭魚降鈣素前體的基因片段序列F＇1-F＇8圖10鮭魚降鈣素前體電噴霧-質(zhì)譜鑒定圖譜圖11鮭魚降鈣素電噴霧-質(zhì)譜鑒定圖譜現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明的制備工藝。
實(shí)施例1基因重組人降鈣素類似物的制備一．材料與方法1．限制性內(nèi)切酶BamH1、Xho1購(gòu)自Biolab,T4連接酶、T4激酶購(gòu)自Promaga。凝血酶、羧基肽酶-Y購(gòu)白Sigma。
2．菌種與質(zhì)粒pGEM-7z(+)購(gòu)自Promaga,pGEX-4T-3購(gòu)自Pharmacia Biotechs。DH5α、TG1購(gòu)自Promaga。
3．放射性同位素α-32P-dATP北京亞輝生物醫(yī)學(xué)公司。
4．瓊脂糖、生物瓊脂購(gòu)自Sigma，酵母粉、蛋白胨購(gòu)自O(shè)xid。
5．質(zhì)粒抽提、凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程公司，T7sequencingTMKit購(gòu)自Pharmacia Biotechs.
6．Glutathione Sepharose4B、SP-Sepharose Fast Flow resin、G-25購(gòu)自Pharmacia Biotech,RP-C18購(gòu)自Merk。
7．質(zhì)粒DNA的制備及片段的回收按華舜生物工程公司試劑盒操作手冊(cè)。人降鈣素類似物基因測(cè)序按T7sequencingTMKit操作手冊(cè)。其它常規(guī)操作按Molecular Cloning 。
8．高密度發(fā)酵參照[M.Yabuta,Y.Suzuki,K.Ohsuye.ApplMicrobiol Biotechnol.1995,42:703-708]。
9．發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定用SDS-PAGE法。染色膠用BioRad DENSITOMETER掃描。
10．融合蛋白的純化按Glutathione Sepharose4B操作手冊(cè)進(jìn)行。
11．降鈣素或降鈣素類似物的復(fù)性參照David Andreu,FernandoAlvericio,Nuria A.Sole Mark C.Munson,Mare Fer rer；and GeorgeBarany.(1994)in Methods in Molecular Biology.Vol.35:Peptide synthesis protocols(Pennington M.W.and Dunn B.M.,Eds.),pp91-169, Humana Press Inc.,Totowa,NJ。
12．活性鑒定按《中國(guó)藥典》降鈣素的生物測(cè)定法測(cè)定注射降鈣素后大鼠血清鈣下降程度。
二．具體操作1．構(gòu)建重組人降鈣素類似物前體基因1.1．重組人降鈣素類似物前體基因片段的化學(xué)合成將重組人降鈣素類似物前體基因分為6個(gè)片段F1-F6(詳見圖2)，采用亞磷酸二酯法由ABI 391 DNA合成儀合成，經(jīng)45℃過(guò)夜氨解，產(chǎn)物用12％聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，再用G-25脫鹽后備用。其中片段F3、F6退火后形成人降鈣素類似物前體C端的編碼序列，含有Leu的密碼子CTG。
1.2．拼接重組人降鈣素類似物前體的全長(zhǎng)基因及構(gòu)建含克隆載體的工程菌在連接反應(yīng)管中加入上述6個(gè)基因片段各20pmol,10倍濃度的連接酶緩沖液3微升，T4激酶10單位，再加水19微升，使Tris-鹽酸、MgCl2、二硫蘇糖醇的終濃度分別為50mM、10mM、10mM，置37℃30分鐘，再96℃2分鐘滅活T4激酶，經(jīng)30分鐘退火至20℃左右。取10微升退火片段溶液，加入6微升BamH1、Xho1雙酶切的pGEM-7z載體溶液、連接酶5單位，再加連接酶緩沖液2微升，使Tris-鹽酸、MgCl2、二硫蘇糖醇的終濃度分別為50mM、10mM、10mM，在14℃連接過(guò)夜。吸取該連接載體溶液10微升，加200微升TG1大腸桿菌溶液(約含106-107個(gè)感受態(tài)細(xì)胞)，冰浴30分鐘后，42℃90秒鐘，加入800微升LB培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)45分鐘后涂板。使用α-互補(bǔ)篩選陽(yáng)性克隆，其插入序列的大小由雙酶切和DNA測(cè)序鑒定。拼接成的人降鈣素類似物全長(zhǎng)基因?yàn)?20bp，如圖3所示，其中包括5’BamH1位點(diǎn)(Ⅰ)，3’Xho1位點(diǎn)(Ⅱ)，兩個(gè)終止密碼(Ⅲ)，在GST與hCTa編碼序列之間加入GAA構(gòu)成V8裂解位點(diǎn)(Ⅳ)，是為了以后進(jìn)-步通過(guò)酶加工得到與天然人降鈣素完全一致的氨基酸序列。為便于體外酰胺化修飾，在人降鈣素類似物C末端加Leu密碼子CTG(V)。
1.3．構(gòu)建含重組人降鈣素類似物基因表達(dá)載體的工程菌分別挑取含pGEM7z-人降鈣素類似物前體基因的單菌落和pGEX-4T-3質(zhì)粒的單菌落各于5毫升LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，利用質(zhì)粒抽提試劑盒純化質(zhì)粒，各取10微升質(zhì)粒，經(jīng)4單位BamH1、4單位Xho1在37℃雙酶切2小時(shí)后，用1.2％瓊脂糖凝膠電泳回收人降鈣素類似物前體基因和雙酶切完全的pGEX-4T-3載體片段。分別取人降鈣素類似物前體基因溶液和經(jīng)BamH1、Xho1雙酶切的pGEX-4T-3載體溶液按摩爾量比為1∶3混勻，加4單位T4連接酶，再加連接酶緩沖液和水，使Tris-鹽酸、MgCl2、二硫蘇糖醇的終濃度分別為50mM、10mM、10mM，在4℃過(guò)夜連接形成pGEX-4T-人降鈣素類似物前體基因，此產(chǎn)物為重組人降鈣素類似物基因表達(dá)載體。吸取該載體溶液10微升，加200微升TG1大腸桿菌(約含106-107個(gè)感受態(tài)細(xì)胞)，冰浴30分鐘后，于42℃水浴90秒鐘，加入800微升LB培養(yǎng)基，于37℃振搖培養(yǎng)45分鐘后涂板。陽(yáng)性工程菌質(zhì)粒DNA經(jīng)雙酶切和DNA測(cè)序鑒定插入序列后，按常規(guī)進(jìn)行融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的鑒定。
2．高密度發(fā)酵3微升OD600=0.7的工程菌接種于3毫升LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過(guò)夜作為一級(jí)種子，次日將3毫升一級(jí)種子接種于200毫升含2％甘油的2-YT培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)至OD600=0.7用作二級(jí)種子，然后按常規(guī)將二級(jí)種子接種于含3升發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程pH控制在7.0左右并不斷攪拌，為維持溶解氧在35％左右，需要不斷增加攪拌速度，轉(zhuǎn)數(shù)從起始每分鐘50轉(zhuǎn)，逐漸加大，在7小時(shí)左右達(dá)到最高速每分鐘800轉(zhuǎn)，然后供應(yīng)純氧，以維持大腸桿菌的需氧量。分批培養(yǎng)5小時(shí)后菌體密度達(dá)到5.3OD600，隨后進(jìn)入10小時(shí)的補(bǔ)料培養(yǎng)階段，菌體生長(zhǎng)近10倍。37℃培養(yǎng)12小時(shí)，加入0.3mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，隨著目的蛋白表達(dá)量增加到一定程度，菌體的比生長(zhǎng)速率明顯減小，生長(zhǎng)趨勢(shì)開始減緩故終止發(fā)酵。發(fā)酵菌體終濃度53OD600、重量150克/升，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，最終融合蛋白表達(dá)量占可溶菌體蛋白25-30％。誘導(dǎo)后融合蛋白表達(dá)量的變化，通過(guò)SDS-凝膠電泳圖譜(圖4)可以明顯地看出，加入IPTG后目的蛋白的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加。圖中泳道1為IPTG誘導(dǎo)0.5小時(shí)菌體蛋白，2為IPTG誘導(dǎo)1小時(shí)菌體蛋白，3為IPTG誘導(dǎo)1.5小時(shí)菌體蛋白，4為IPTG誘導(dǎo)2小時(shí)菌體蛋白，5為IPTG誘導(dǎo)2.5小時(shí)菌體蛋白，6為IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)菌體蛋白。分子量30kDa的條帶為目的蛋白，即谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶-人降鈣素類似物前體融合蛋白。
3．純化人降鈣素類似物前體將100g大腸桿菌菌體置于1000毫升pH7.2的磷酸緩沖液中，冰浴中超聲破碎，加入20％Triton-X100至終濃度1％，靜置30分鐘，15,000g離心25分鐘，取上清液與40毫升GlutathioneSepharose4B混合，溫和振搖30分鐘，500g離心5分鐘，將沉淀裝柱，磷酸緩沖液洗脫至OD280＜0.02，再用3倍于柱體積緩的沖液(10mM glutathione,50mMTris-HCl,pH8.0)洗脫，洗脫樣品用SDS-凝膠電泳分析結(jié)果見圖5，可溶性的菌體總蛋白經(jīng)過(guò)親和樹脂純化，獲得的目的融合蛋白(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶-人降鈣素類似物前體)純度大于90％。泳道1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，2為純化后的目的融合蛋白。3為純化前可溶性的菌體總蛋白。分子量約30kDa處為目的融合蛋白。用Bradford方法測(cè)定洗脫液中的蛋白含量，按100ug融合蛋白加入1單位凝血酶，于25℃酶切20小時(shí)。加1M二硫蘇糖醇至終濃度10mM，用濃鹽酸調(diào)至pH2.0，過(guò)SP-Sepharose Fast Flow柱。用1號(hào)液(2M Urea,10mMHCl)洗脫至OD280＜0.02，換2號(hào)液(2M Urea,10mMHCl,100mM NaCl)洗脫，用分光光度計(jì)220nm下檢測(cè)，收集吸收峰的洗脫液。過(guò)RP-C18脫鹽柱，先用3號(hào)液(5％CNCH3∶95％H2O∶0.1％TFA)洗脫至OD220＜0.02后，再用4號(hào)液(50％CNCH3∶50％H2O∶0.1％TFA)洗脫，收集樣品，冰凍干燥。用高效液相(HPLC)分析產(chǎn)物，條件是甲流動(dòng)相為0.5％CNCH3∶0.1％TFA，乙流動(dòng)相為90％CNCH3∶0.1％TFA，流速為每分鐘1毫升，線性梯度為30分鐘內(nèi)乙流動(dòng)相由0到60％。分析結(jié)果表明產(chǎn)物純度大于90％。用電噴霧質(zhì)譜鑒定人降鈣素類似物前體見圖6，圖譜說(shuō)明人降鈣素類似物前體的分子量為3805，與理論計(jì)算值完全一致。
4．體外酰胺化將含1mM EDTA、200mM O-PNGA的溶液用5N NaOH調(diào)pH值到6.0，加入人降鈣素類似物前體至終濃度1mM，再加羧基肽酶-Y30微克，置35℃水浴90分鐘后用RP-C18脫鹽，冷凍干燥得到光敏感中間體人降鈣素類似物-O-PNGA。將其溶解于60mM NaHSO3甲醇-水(甲醇∶水=1∶1)溶液中，充入氬氣后進(jìn)行光解，可得到線形人降鈣素類似物，反應(yīng)完成后，RP-C18脫鹽，冷凍干燥，用HPLC純化產(chǎn)物，條件是甲流動(dòng)相為0.5％CNCH3∶0.1％TFA，乙流動(dòng)相為90％CNCH3∶0.1％TFA，流速每分鐘1毫升，線性梯度為30分鐘內(nèi)乙流動(dòng)相由0到60％，得到的線形人降鈣素類似物的純度大于95％。
5．復(fù)性將1mg線形人降鈣素類似物溶于1ml乙酸-水溶液(乙酸∶水=1∶19)中，加(NH4)2CO3調(diào)至pH6.0，于37℃保溫4小時(shí)，復(fù)性完成后，用HPLC進(jìn)行純化，條件同上，所得人降鈣素類似物的純度大于98％。用電噴霧質(zhì)譜鑒定人降鈣素類似物，結(jié)果見圖7，圖譜說(shuō)明人降鈣素類似物分子量為3691，與理論計(jì)算值完全一致。
6．測(cè)定活性按《中國(guó)藥典》方法。將體重40-50g同一來(lái)源、同一品系、同一性別的健康大白鼠，隨機(jī)分成5組(對(duì)照組、人降鈣素類似物樣品高濃度組、人降鈣素類似物樣品低濃度組、標(biāo)準(zhǔn)品高濃度組、標(biāo)準(zhǔn)品低濃度組)，每組10只，編號(hào)后，分別按順序，尾靜脈注射1×10-2單位/毫升和5×10-2單位/毫升兩種濃度的降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品和人降鈣素類似物樣品0.4ml/只，對(duì)照組注射空白稀釋液0.4ml/只。給藥后準(zhǔn)確1小時(shí)，分別取血樣，用鄰甲酚酞絡(luò)合劑比色法測(cè)定血鈣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果按《中國(guó)藥典》附錄檢定統(tǒng)計(jì)法中量反應(yīng)平行線計(jì)算，隨機(jī)設(shè)計(jì)法計(jì)算效價(jià)以及實(shí)驗(yàn)誤差。并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)可靠性檢驗(yàn)。結(jié)果見表1。
表1．人降鈣素類似物活性測(cè)定結(jié)果

統(tǒng)計(jì)結(jié)果平均可信限(FL％)=23.890，效價(jià)180國(guó)際單位/毫克。表1及統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明人降鈣素類似物具有顯著的降血鈣活性，效價(jià)與天然人降鈣素單位比活一致。
實(shí)施例2基因工程生產(chǎn)鮭魚降鈣素1．構(gòu)建重組鮭魚降鈣素前體基因1.1化學(xué)合成重組鮭魚降鈣素前體基因片段將鮭魚降鈣素前體基因分為F1′-F8′，8個(gè)片段合成，詳見圖8，操作過(guò)程同實(shí)施例1中1.1。其中片段F1′-F8′退火后形成鮭魚降鈣素前體C端的編碼序列，含有Ala的密碼子GCT。
1.2．拼接重組鮭魚降鈣素前體的全長(zhǎng)基因及構(gòu)建含克隆載體的工程菌操作同實(shí)施例1中1.2。拼接的重組鮭魚降鈣素前體基因全長(zhǎng)序列見圖9，全長(zhǎng)基因120bp，包括5’BamH1位點(diǎn)(Ⅰ)，3’Xho1位點(diǎn)(Ⅱ)、兩個(gè)終止密碼(Ⅲ)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶與鮭魚降鈣素前體之間加入溴化氰裂解位點(diǎn)蛋氨酸密碼子ATG(Ⅵ)和為便于以后的化學(xué)修飾位于鮭魚降鈣素C末端的丙氨酸密碼子GCT(Ⅶ)。
1.3．構(gòu)建含重組鮭魚降鈣素前體基因表達(dá)載體的工程菌操作同實(shí)施例1中1.3。
2．高密度發(fā)酵操作同實(shí)施例1中2。
3．純化鮭魚降鈣素前體3.1．谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶-鮭魚降鈣素前體融合蛋白的純化純化過(guò)程同實(shí)施例1中4。
3.2．S-磺酸化及溴化氰裂解用55％飽和(NH4)2SO4沉淀谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶-鮭魚降鈣素前體融合蛋白，15,000g離心15分鐘，加水調(diào)整蛋白濃度至10毫克/毫升。加入1/10體積1M Tris-鹽酸調(diào)至pH8.0，按每毫升融合蛋白加入52毫克Na2SO3和25毫克Na2S4O4的比例分別加入Na2SO3和Na2S4O4，避光反應(yīng)12小時(shí)。經(jīng)G-25柱(6×60cm)脫鹽(預(yù)先用10mMTris-鹽酸，pH8.0平衡)。收集洗脫液的流穿峰，加尿素至終濃度8M，加濃鹽酸至終濃度50mM，加入溴化氰避光反應(yīng)4小時(shí)，得重組鮭魚降鈣素前體等裂解產(chǎn)物。
3.3．裂解產(chǎn)物純化將上述裂解反應(yīng)液加4倍體積水，經(jīng)SP-Sepharose Fast Flow層析柱，用1號(hào)液(2M尿素，10mM鹽酸)洗脫至OD280＜0.02，換2號(hào)液(2M尿素，10mM鹽酸，100mM NaCl)，用分光光度計(jì)，以220nm檢測(cè)，收集該吸收峰的洗脫液。收集液經(jīng)RP-C18柱，先用3號(hào)液(5％乙腈∶95％水∶0.1％三氟乙酸)洗脫至OD220＜0.02，再用38％-49％乙腈梯度洗脫，收集樣品，冰凍干燥得到重組鮭魚降鈣素前體。HPLC分析產(chǎn)物，條件是流動(dòng)相丙為水∶0.1％三氟乙酸，流動(dòng)相丁為乙腈∶0.1％三氟乙酸，流速為每分鐘1毫升，線性梯度為40分鐘丁流動(dòng)相由0到80％，所得重組鮭魚降鈣素前體產(chǎn)物純度大于95％。用電噴霧質(zhì)譜鑒定鮭魚降鈣素前體，見圖10，圖譜表明鮭魚降鈣素前體的分子量為3666，與理論計(jì)算完全一致。
4．體外酰胺化將含1mM EDTA、200mM O-PNGA的溶液用5N NaOH調(diào)pH值到6.0，加入鮭魚降鈣素前體至終濃度1mM，再加羧基肽酶-Y150微克，置35℃水浴中120分鐘后用RP-C18脫鹽，冷凍干燥，得到光敏感中間體鮭魚降鈣素-O-PNGA。將其溶解于60mM NaHSO3甲醇-水(甲醇∶水=1∶1)溶液中，充入氬氣后進(jìn)行光解，可得到線形鮭魚降鈣素，反應(yīng)完成后，RP-C18脫鹽，冷凍干燥，用HPLC進(jìn)行純化，條件同上。得到的線形鮭魚降鈣素純度大于95％。
5．復(fù)性將鮭魚降鈣素1毫克溶于1毫升pH為8.0含0.1M Tris-鹽酸和5mM半胱氨酸的溶液中，置37℃5分鐘。HPLC純化產(chǎn)物，條件同上。得到的鮭魚降鈣素純度大于99％。用電噴霧質(zhì)譜鑒定鮭魚降鈣素見圖11，圖譜表明鮭魚降鈣素分子量為3432，與理論計(jì)算值完全一致。
6．活性測(cè)定操作同實(shí)施例1中6。結(jié)果見表2。
表2．測(cè)定鮭魚降鈣素的活性

統(tǒng)計(jì)結(jié)果平均可信限(FL％)=25.790，效價(jià)4100國(guó)際單位/毫克。表2及統(tǒng)計(jì)結(jié)果說(shuō)明基因工程表達(dá)的重組鮭魚降鈣素具有顯著的降血鈣活性，效價(jià)與天然鮭魚降鈣素單位比活一致。
優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明同以往的基因工程制備降鈣素或降鈣素類似物工藝相比優(yōu)點(diǎn)在于工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、生產(chǎn)周期短。
權(quán)利要求
1．一種基因重組降鈣素或降鈣素類似物的制備工藝，包括1.1．構(gòu)建降鈣素或降鈣素類似物前體基因及其含克隆載體pGEM-降鈣素或降鈣素類似物前體基因的工程菌；1.2．構(gòu)建含降鈣素或降鈣素類似物前體基因融合表達(dá)載體pGEX-降鈣素或降鈣素類似物前體基因的工程菌；1.3．降鈣素或降鈣素類似物工程菌的發(fā)酵；1.4．分離、純化降鈣素或降鈣素類似物前體；1.5．降鈣素或降鈣素類似物前體的酰胺化及復(fù)性成為成熟降鈣素或降鈣素類似物；1.6．降鈣素或降鈣素類似物活性的測(cè)定；其特征在于構(gòu)建降鈣素或降鈣素類似物前體基因時(shí)，首先按降鈣素或降鈣素類似物前體的氨基酸序列，用大腸桿菌的偏愛密碼編碼成若干基因片段，并化學(xué)合成基因片段，再拼接成降鈣素或降鈣素類似物前體的全長(zhǎng)基因，所拼接成的全長(zhǎng)基因C末端為丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)或其它可以被羧基肽酶-Y水解的氨基酸的密碼子，以便使由大腸桿菌表達(dá)出的產(chǎn)物，可用羧基肽酶-Y進(jìn)行C末端酰胺化。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組降鈣素或降鈣素類似物的制備工藝，其特征在于降鈣素或降鈣素類似物的前體采用羧基肽酶-Y進(jìn)行酰胺化時(shí)，同時(shí)加入鄰硝基苯甘氨酰胺(O-PNGA)，使得降鈣素或降鈣素類似物前體的第33位被O-PNGA取代，得到光敏感的降鈣素-O-PNGA或降鈣素類似物-O-PNGA，該產(chǎn)物經(jīng)光解得線形降鈣素或降鈣素類似物，并可通過(guò)空氣氧化折疊，重建二硫鍵，得到具有生物活性降鈣素或降鈣素類似物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因重組降鈣素或降鈣素類似物的制備工藝。先化學(xué)法合成降鈣素或降鈣素類似物前體基因片段,再拼接成全長(zhǎng)基因,其C末端是丙氨酸或亮氨酸或其它可以被羧基肽酶－Y水解的氨基酸密碼,以便用羧基肽酶－Y對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行C末端修飾,修飾時(shí)加入鄰硝基苯甘氨酰胺為取代親核試劑,使降鈣素或降鈣素類似物前體的第33位被鄰硝基苯甘氨酰胺取代,成為光敏感的產(chǎn)物,經(jīng)光解得線形降鈣素或降鈣素類似物,再通過(guò)復(fù)性,獲得具有與天然降鈣素活性相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)物。
文檔編號(hào)C07K14/575GK1303868SQ00111438
公開日2001年7月18日 申請(qǐng)日期2000年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月13日
發(fā)明者毛積芳, 竇鴻 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)