專利名稱：HER2/neu-特異性抗體和其使用方法
HER2/neu-特異性抗體和其使用方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2008年4月2日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)系列第61/041，649號(hào)(待決) 的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)引用將其整體并入本文。序列表的引用根據(jù)37C. F. R. 1. 821以及其下列，本申請(qǐng)包含一個(gè)或多個(gè)序列表，它們已在紙件 和計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中公開(kāi)，并且所述紙件和計(jì)算機(jī)可讀公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本申請(qǐng)涉及特異性結(jié)合HER2/neU的新穎4D5抗體，尤其是HER2/neU的新穎嵌合 4D5抗體，所述新穎4D5抗體與已知的4D5抗體相比具有減少的糖基化和改變的效應(yīng)子功 能。本發(fā)明還涉及抗體和包含它們的組合物用于下列疾病的診斷、預(yù)后和治療的方法例 如，癌癥、自身免疫疾病、炎性疾患和傳染病。相關(guān)技術(shù)說(shuō)明HER2/neu 和 HER2/neu 受體細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過(guò)程涉及生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子通過(guò)特異性受體如酪氨酸激酶發(fā) 揮它們的作用。配體與酪氨酸激酶受體的結(jié)合觸發(fā)最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分化的事件級(jí) 聯(lián)。(Carpenter 等人(1979)Biochem. 48 :193-216 ；Sachs 等人(1987) Cancer Res. 47 1981-8196)。酪氨酸激酶受體根據(jù)它們的序列相似性和不同特征可以分為幾組。一種 這類家族是ErbB或表皮生長(zhǎng)因子受體家族，該家族包括多種受體，它們稱為HER-I (也 稱為 erbB-Ι 或 EGFR)、HER-2 或 HER2/neu(也稱為 erbB-2、c-neu 或 pl85)、HER-3 (也 稱為erbB-3)和HER_4(也稱為erbB_4)。(參見(jiàn)，例如，Carpenter等人，如上；Semba等 人(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. Α.) 82 :6497-6501 ；Coussens 等人(1985) Science, 230 :1130-1139, Bargmann 等人(1986)Cell 45 :649-657 ；Kraus 等人(1989)PNAS 86 9193-9197 ；Carraway 等人(1994) J. Biol. Chem. 269 :14303-14306 ；和 Plowman 等人(1993) Nature 366 :473-475 ；Tzahar 等人(1994)Biol. Chem. 269 :25226-25233)。在正常發(fā)育過(guò)程和人腫瘤發(fā)生二者中ErbB受體在傳播調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移 和凋亡的信號(hào)中起重要作用。(Slamon等人(1989) kience244 :707-712)。例如，erbB受體 的激活偶聯(lián)并刺激下游MAPK-Erkl/2和磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT生長(zhǎng)和存活途徑。在 癌癥中這些途徑的失調(diào)與疾病進(jìn)展和治療不應(yīng)性相聯(lián)系。(Fukazawa等人(1996) J.Biol. Chem. 271 :14554-14559 ；Tzahar 等人(1996)Mol. Cell. Biol. 16:5276-5287 ；Lange 等 人(1998)J. Biol. Chem. 273 :31308-31316 ；Olayioye ^ 人(1998)Mol. Cell. Biol. 18 5042-5051 ；Hackel 等人(1999)Curr. Opin. Cell Biol. 11 :184-189)。PI3K/AKT 的激活促 進(jìn)細(xì)胞存活和腫瘤侵襲性增強(qiáng)，并且據(jù)報(bào)道在過(guò)表達(dá)HER2/neU的乳癌中AKT2被激活并過(guò) 表達(dá)。(Shak (1999) Semin. Oncol. Suppl 12 :71-77 ；Huang 等人(2000) Clinical Cancer Res. 7 :2166-2174 ；Bacus 等人(2002) Oncogene 21 :3532-3540)。
受體ErbB家族的信號(hào)傳導(dǎo)由配體結(jié)合啟動(dòng)，配體結(jié)合觸發(fā)同源或異源受體二聚 化、胞質(zhì)尾部的相互酪氨酸磷酸化和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活。(Citri等人00(Χ3)ΕΧρ. Cell Res. 284 :54)。結(jié)合并激活ErbB受體的配體的有效性是由多種金屬蛋白酶介導(dǎo)的，如 催化特異性蛋白的細(xì)胞表面胞外域脫落的ADAM(解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶)家族的鋅依賴性 金屬蛋白酶。(參見(jiàn) Chang 和 WerM200l)Trends in Cell Biology 11 :537-543 ;Moss 和 Lambert(2002)Essays in Biochemistry 38 :141-153 ;Seals 禾口 Courtneidge(2003)Genes and Development 17:7-30)。具體地，據(jù)顯示ADAM家族切割負(fù)責(zé)激活ErbB受體的配體，例 如 APP 和 Notch。(Blobel(2005)Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6 :32-43)。ErbB家族的一個(gè)重要成員HER2/neu是185kDa的受體蛋白，它最初是作為來(lái)自化 學(xué)處理的大鼠的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物鑒定的。HER2/neU由于其在幾種人的癌中 和在哺乳動(dòng)物發(fā)育中的作用而被廣泛地研究。(Hynes和Mem(1994)Biochim. et Biophys. Acta 1198 :165-184 ；和 Dougall 等人(1994) Oncogene 9 :2109-2123 ；Lee 等人(1995) Nature378 :394-398)。人 HER2/neu 基因和 HER2/neu 蛋白描述于 kmba 等人(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A. )82 :6497-6501 和 Yamamoto 等人(I986)Nature 319 :230-234 中 并且其序列可以在GenBank中以登錄號(hào)X03363獲得。HER2/neu包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域配體結(jié) 合的胞外結(jié)構(gòu)域；親脂的跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和羧基端信號(hào)傳導(dǎo) 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有可以被磷酸化的幾個(gè)酪氨酸殘基。(Plowman等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A. )90 :1746-1750)。HER2/neu 胞外(ECD)結(jié)構(gòu)域的序列由 Franklin 等人 (2004) Cancer Cell. 5(4) :317-3 描述，并且可以在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)記錄(Protein DataBank Record) 1S78(2004)中獲得。HER2/neU充當(dāng)生長(zhǎng)因子受體并且通常由諸如乳癌、卵巢癌和肺癌等腫瘤表達(dá)。 HER2/neU在25-30%的人乳癌和卵巢癌中過(guò)表達(dá)，并且與這些患者中的侵襲性臨床進(jìn)展或 弱的預(yù)后相關(guān)。(Slamon 等人(1987) Science 2；35 ； 177-182 ;Slamon 等人(1989) Science 244 :707-712)。已在其他癌中觀察到HER2/neu的過(guò)表達(dá)，所述其他癌癥包括胃癌、子宮 內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌和膀胱癌。(參見(jiàn)，例如King等 人(1985)kience 229 :974 ；McCann 等人(1990) Cancer 65 :88-92 ；Yonemura 等人(1991) Cancer Research 51:1034)。HER2/neu的激活與在乳癌患者中對(duì)激素治療的臨床反應(yīng)性降低相關(guān)。(Wright 等人(1989) Cancer Res. 49 :2087-2090 ；Kurokawa & Arteaga (2001) Clin. Cancer Res. 7 4436s-42s，4411s-4412s)。實(shí)際上，HER2/neu表達(dá)足以傳達(dá)抗雌激素抗性。(Benz等人 (1993) Breast Cancer Res. Treat. 24 :85-95)。HER2/neu 和 HER-3 似乎還參與了前列腺癌 患者中激素抗性的發(fā)病。大約三分之一的前列腺癌患者接受以破壞睪丸和腎上腺雄激素為 目的的激素治療。對(duì)于乳癌，抗性是不可避免的。最近的數(shù)據(jù)表明，由HER2/neU和HER-3所 發(fā)出的信號(hào)誘導(dǎo)“激素-不應(yīng)”狀態(tài)。(Mellinghoff等人(2004) CancerCell 6:517-527)。已經(jīng)知道幾種截?cái)嗪图艚有问降腍ER2/neu。例如，位于一些胃癌細(xì)胞的核周胞 質(zhì)的截?cái)郋CD是通過(guò)使用內(nèi)含子中的多聚腺苷酸化信號(hào)產(chǎn)生的替代性轉(zhuǎn)錄物來(lái)制備的。 (Yamamoto 等人(1986)Nature 319 :230-234 ；和 Scott 等人(1993)Mol. Cell. Biol. 13 2247-2257)。還沒(méi)有可歸因于這種截短E⑶多肽的具體治療、診斷或研究效用。HER2/neU 的ECD還可以以蛋白水解的方式從培養(yǎng)的乳癌細(xì)胞脫落，并且它出現(xiàn)在一些癌癥患者的血清中，此時(shí)它可以是轉(zhuǎn)移性乳癌的和總體差預(yù)后的血清標(biāo)記物。(Petch等人(1990)Mol. Cell. Biol. 10 :2973-2982 ；Leitzel 等人(1992) J. Clin. Oncol. 10 :1436-1443 ；Scott 等人 (1993)Mol. Cell. Biol. 13 :2247-2257 ；和 Lee 和 Maihle (1998) Oncogene 16 :3243-3252)。 在一些過(guò)表達(dá)HER2/neu的腫瘤細(xì)胞中，熟知的金屬蛋白酶激活劑乙酸4-氨基苯汞(APMA) 激活諸如ADAMlO和ADAM15等金屬蛋白酶以將HER2/neU受體切割成兩部分截?cái)嗟哪そY(jié) 合受體，稱為P95 ；和可溶性E⑶，稱為pl05或E⑶105。(參見(jiàn)，例如，Molina等人Q001) Cancer Res. 61 :4744-4749 ；美國(guó)專利公布第2004/0247602號(hào))。ECD的丟失使得p95受體 成為組成型活性的酪氨酸激酶，該組成型活性的酪氨酸激酶可以遞送生長(zhǎng)和存活信號(hào)給癌 細(xì)胞。(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利第6，M1，214號(hào))。研究已顯示在過(guò)表達(dá)HER2/heu的乳癌細(xì)胞中，用HER2/neu特異性抗體與化療劑 (例如，順鉬、阿霉素(doxoubicin)、紫杉醇)組合治療引發(fā)了比用單獨(dú)的化療劑治療更高 的細(xì)胞毒性反應(yīng)。(Hancock 等人(1991)CancerRes. 51 :4575-4580 ；Arteaga 等人(1994) Cancer 54 :3758-3765 ；Pietras 等人(1994)Oncogene 9 :1829-1838)。HER2/neu 抗體可 以增強(qiáng)對(duì)化療劑的反應(yīng)的一個(gè)可能機(jī)制是通過(guò)HER2/neU蛋白表達(dá)的調(diào)控或通過(guò)DNA修復(fù) 的干擾。Gtancovski 等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. Α.) 88 :8691-8695 ；Bacus 等 人(1992)Cell Growth & Diff. 3 :401-411 ；Bacus等人(1993)Cancer Res. 53 :5251-5261 ； Klapper 等人(1997)Oncogene 14 :2099-2109 ；Klapper φ 人 U000)Cancer Res. 60 3384-3388 ;Arteaga 等人(2001) J ClinicalOncology 19 (18s) :32s_40s)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了靶向HER-I或HER2/neu的大量單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑 制劑。例如，稱為4D5的鼠單克隆抗體識(shí)別與跨膜區(qū)極為接近的HER2/neU富半胱氨酸結(jié) 構(gòu)域II中的胞外表位(氨基酸5 至627)。如通過(guò)受體磷酸化測(cè)定所測(cè)量的，用4D5進(jìn) 行的乳癌細(xì)胞治療部分阻斷HER2/neu-HER-3復(fù)合體的NDF/heregulin激活。(Carter等 人(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A. )89 :4285-4289 ；Sliwkowski 等人(1999) Sem. inOncol. 26 :60-70 ；Ye 等人(1999)Oncogene 18 :731-738 ；Vogel 等人(2001)Oncology 61(增刊 2) :37-42 ;Vogel 等人 Q002) Journal of Clinical 0ncology20 (3) :719-726; Fujimoto-Ouchi 等人 O002) Cancer Chemother. Pharmacol. 49 :211-216)。然而，給人施用 4D5是臨床上失敗的，因?yàn)榛颊邥?huì)迅速地出現(xiàn)HAMA反應(yīng)，因此開(kāi)發(fā)了人源化形式。人源化抗 體4D5的序列和晶體結(jié)構(gòu)已在美國(guó)專利第6，054, 297號(hào)；Carter等人，如上；和Eigenbrot 等人(1993) J. Mol. Biol. 229 :969-95 中描述。開(kāi)發(fā)了稱為曲妥單抗(由Genentech，Inc.以赫賽汀 銷售)的人源化形式 的4D5，并且它已被批準(zhǔn)用于治療涉及HER2/neU的過(guò)表達(dá)或基因擴(kuò)增的癌癥，包括乳癌。 (Cobleigh 等人(1999) J. Clin. Oncol. 17 :2639-2648)。曲妥單抗在體外抑制 ΑΡΜΑ 介導(dǎo) 的HER2/neu向E⑶和p95部分的切割，并且相信它在體外通過(guò)不同的機(jī)制起作用，包括 可能抑制 HER2/neu 脫落。(Pegram 等人(1998) Journal of Clinical Oncology 16(8) 2659-2671 ;Baselga 等人 OOOlWeminars in Oncology 28(5)(增刊 16) :4-11 ；Baselga 等人(2001)Annals of Oncology 12(增刊1) :S35_S41)。然而，曲妥單抗治療具有許多缺 點(diǎn)，如在一些患者中的心臟毒性和HAHA反應(yīng)的出現(xiàn)。因此，仍然存在對(duì)于用于癌癥治療的新的或改進(jìn)形式的HER2/neU抗體的需求，例 如具有增加的親和力或特異性、降低的HAMA或HAHA反應(yīng)的可能、改變的效應(yīng)子功能和類似特征的4D5抗體。Fc 受體抗體-抗原復(fù)合體與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致了廣泛的一系列的反應(yīng)，其 范圍從效應(yīng)子功能如抗體依賴性細(xì)胞毒性、肥大細(xì)胞脫顆粒和吞噬作用到免疫調(diào)節(jié)信號(hào)， 如調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用均是通過(guò)抗體的Fc結(jié)構(gòu)域或免疫復(fù) 合體與Fc受體的結(jié)合啟動(dòng)的，F(xiàn)c受體是造血細(xì)胞上的特化的細(xì)胞表面受體。由抗體和免 疫復(fù)合體所觸發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)的多樣性是由Fc受體的結(jié)構(gòu)不均一性產(chǎn)生的。Fc受體共同擁 有結(jié)構(gòu)上相關(guān)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域大概介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。免疫球蛋白基因超家族的蛋白成員Fc受體是可以結(jié)合免疫球蛋白分子的Fc部 分的表面糖蛋白。該家族的每個(gè)成員通過(guò)Fc受體的α鏈上的識(shí)別結(jié)構(gòu)域識(shí)別一種或多 種同種型的免疫球蛋白。Fc受體是由他們對(duì)免疫球蛋白亞型的特異性定義的。IgG的Fc 受體稱為"Fe y R”，IgE的Fc受體稱為"F ε R”并且IgA的Fc受體稱為"Fe α R”。不同的 佐細(xì)胞擁有不同同種型抗體的Fc受體，并且抗體的同種型決定了哪些佐細(xì)胞將參與給定 的反應(yīng)(Billadeau 等人(2002) J. Clin. Investigat. 2 (109) :161-81 ；Gerber 等人(2001) Microbes Infection 3 :131-139 ；Ravetch 等人(2001)Annu. Rev. Immunol. 19 :275-90 ； Ravetch 等人(2000) Science 290:84-89 ；Ravetch (1994) Cell78(4) :553-560 ；Ravetch ^ 人(1991) Annu. Rev. Immunol. 9 :457-492 ；還參見(jiàn)，Immunobiology :The Immune System in Health and Disease (免疫生物學(xué)健康與疾病中的免疫系統(tǒng))(第4版，1999年)Jlsevier Science Ltd/Garland Publishing, New York)。各種受體的總括呈現(xiàn)在表 1 中。
權(quán)利要求
1.一種多肽，所述多肽包含含有N65S取代的嵌合4D5免疫球蛋白輕鏈。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含具有SEQID NO :4的氨基酸序列的輕 鏈可變結(jié)構(gòu)域。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其中所述多肽具有SEQID NO :2的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽是抗體。
5.如權(quán)利要求4所述的抗體，其中所述抗體包含在Fc結(jié)構(gòu)域中具有至少一種修飾的變 體Fc結(jié)構(gòu)域。
6.如權(quán)利要求5所述的抗體，其中所述修飾包含選自由下列組成的組的至少一個(gè)取 代L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I 和 P396L。
7.如權(quán)利要求6所述的抗體，其中所述修飾包括(A)選自由下列組成的組的至少一個(gè)取代F243L、D270E、R292P、S298NJ300L、V305I、 A330V 和 P396L ；(B)選自由下列組成的組的至少兩個(gè)取代FM3L和P396L；FM3L和R292P ；以及R292P 和 V305I ；(C)選自由下列組成的組的至少三個(gè)取代F243L、R292P和Y300L；F243L、R292P和 V305I ；F243L、R292P 和 P396L ；以及 R292P、V305I 和 P396L ；或(D)選自由下列組成的組的至少四個(gè)取代FM3L、I^92P、Y300L和P396L；以及F243L、 R292P、V305I 和 P396L。
8.如權(quán)利要求7所述的抗體，其中所述抗體包括下列取代(A)F243L.R292P和 Y300L ；(B)L235V,F243L、R292P、Y300L和 P396L ；或(C)F243L、R292P、Y300L、V305I 和 P396L。
9.如權(quán)利要求5所述的抗體，其中所述變體Fc結(jié)構(gòu)域與野生型Fc結(jié)構(gòu)域相比表現(xiàn)出(A)增強(qiáng)的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；(B)增加的與Fcy RIIA或與Fc y RIIIA的結(jié)合；(C)降低的與Fcy RIIB的結(jié)合；或(D)增加的與Fcy RIIB的結(jié)合。
10.一種多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重鏈，所述免疫球蛋白重鏈包含具有選自由 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 13組成的組的氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域。
11.一種多肽，所述多肽包含含有下列的4D5免疫球蛋白重鏈(A)選自由下列組成的組的至少一個(gè)取代F243L、D270E、R292P、S298NJ300L、V305I、 A330V 和 P396L ；(B)選自由下列組成的組的至少兩個(gè)取代(1)F243L和 P396L ；(2)F243L和 R292P ；以及(3)R292P和 V305I ；(C)選自由下列組成的組的至少三個(gè)取代(1)F243L、R292P和 Y300L ；(2)F243L、R292P和 V305I ；(3)F243L、R292P 和 P396L ；以及(4)R292P.V305I和 P396L ；(D)選自由下列組成的組的至少四個(gè)取代(1)F243L、R292P、Y300L 和 P396L ；以及(2)F243L、R292P、V305I和P396L ； 或(E)至少F243L、R292P、Y300L、V305I 和 P396 取代。
12.如權(quán)利要求11所述的多肽，其中所述多肽是抗體。
13.如權(quán)利要求4或5所述的抗體，其中所述抗體還包含免疫球蛋白重鏈，所述免疫球 蛋白重鏈包含具有 SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO 13 的氨基酸 序列的可變結(jié)構(gòu)域。
14.如權(quán)利要求13所述的抗體，其中所述抗體包括(A)選自由下列組成的組的至少一個(gè)取代F243L、D270E、R292P、S298NJ300L、V305I、 A330V 和 P396L ；(B)選自由下列組成的組的至少兩個(gè)取代(1)F243L和 P396L ；(2)F243L和 R292P ；以及(3)R292P和 V305I ；(C)選自由下列組成的組的至少三個(gè)取代(1)F243L、R292P和 Y300L(2)F243L、R292P和 V305I(3)F243L、R292P 和 P396L ；以及(4)R292P.V305I和 P396L(D)選自由下列組成的組的至少四個(gè)取代(1)F243L、R292P、Y300L 和 P396L ；以及(2)F243L、R292P、V305I和P396L ； 或(E)至少F243L、R292P、Y300L、V305I 和 P396 取代。
15.如權(quán)利要求13所述的抗體，其中所述免疫球蛋白輕鏈包含具有SEQID NO :4的氨 基酸序列的可變結(jié)構(gòu)域，并且所述免疫球蛋白重鏈包含SEQ ID NO 9,SEQ ID N0:11或SEQ ID NO 13的氨基酸序列。
16.如權(quán)利要求5、6、7、8、9、13、14或15任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體是F(ab')2 片段、F(ab)片段、單鏈抗體、單克隆抗體或雙體。
17.如權(quán)利要求5、6、7、8、9、13、14、15或16任一項(xiàng)所述的抗體，其中。
18.如權(quán)利要求5、6、7、8、9、13、14、15或16任一項(xiàng)所述的抗體在制備用于治療患者的 癌癥的藥物中的用途。
19.如權(quán)利要求18所述的用途，其中所述癌癥是表達(dá)HER2/neu的癌癥并且其中所述抗 體結(jié)合人HER2/neu。
20.如權(quán)利要求18或19任一項(xiàng)所述的用途，其中所述治療還包括與所述抗體同時(shí)或順序施用第二治療劑的步驟，其中所述第二治療劑選自由下列組成的組抗血管發(fā)生劑、抗腫 瘤劑、化療劑和細(xì)胞毒性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合HER2/neu的抗體，并且尤其是HER2/neu的嵌合4D5抗體，所述4D5抗體與已知的4D5抗體相比具有減少的糖基化。本發(fā)明還涉及4D5抗體和包含它們的組合物用于下列疾病的診斷、預(yù)后和治療的方法例如，癌癥、自身免疫疾病、炎性病患和傳染病。
文檔編號(hào)C12P21/08GK102046195SQ200980119403
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月2日
發(fā)明者埃茲奧·泊韋尼, 納丁·泰朗, 萊斯利·S·約翰遜, 菱·黃 申請(qǐng)人:宏觀基因有限公司