專利名稱：產生酪蛋白水解物的方法
產生酪蛋白水解物的方法涉及序列表本申請含有計算機可讀形式的序列表，所述計算機可讀形式通過提述并入本文。 發(fā)明領域本發(fā)明涉及使用微生物內肽酶產生酪蛋白水解物的方法。
背景技術：
酪蛋白用于(例如，運動飲料中的)蛋白質強化(protein fortification), 以及用于其他膳食飲料(dietary drink)、干混飲料(dry blended beaverage)、營養(yǎng)條 (nutritional bar)、嬰兒配方(infant formula)等中。在一些情況下，發(fā)現(xiàn)酪蛋白水解 物的過敏原性(allergenic)比乳清蛋白水解物低，這使得它們在，例如，嬰兒配方中可能 更加有用?？墒褂玫鞍姿饷杆饫业鞍讈碇苽淅业鞍姿馕?。在酪蛋白水解物的工業(yè) 生產中，所述水解蛋白的高溶解度或可懸浮性無論從加工的角度，單純產量/經濟(yield/ economical)的角度而言，還是口感和感覺特點(sensory attribute)而言都是重要的。因 此，對本發(fā)明人來說一個目的是鑒定對于制備具有高溶解度(如在低PH具有高溶解度和/ 或在低或中等水解度具有高溶解度)的酪蛋白水解物有用的蛋白水解酶。之前已經描述了發(fā)現(xiàn)可適用于本發(fā)明的內肽酶。例如，來源于擬諾卡氏菌屬 (Nocardiopsis)菌種NRRL 18262的內肽酶公開于WO 88/03947 (其中，該菌株稱為擬諾 卡氏菌屬菌種菌株10R)以及WO 01/58276。其他相關的根據(jù)本發(fā)明有用的內肽酶公開于 W088/03947、W004/111220、W004/111222、W004/111223、W005/123911 和 W004/072279。

發(fā)明內容
本發(fā)明人鑒定了下述內肽酶，其被發(fā)現(xiàn)適用于制備具有高溶解度并得到均一懸浮 物的酪蛋白水解物。所述內肽酶與本領域使用的其他內肽酶相比，當以等量的酶蛋白相比 時更加有效，這導致酪蛋白水解物生產者的產物更經濟。因此，本發(fā)明涉及產生酪蛋白水解 物的方法，包括a)將與SEQ ID NO 1具有至少50%同一性的內肽酶添加至包含酪蛋白的 組合物；和b)溫育以水解所述酪蛋白。發(fā)明詳述內肽酶本文中所使用的術語內肽酶是水解內肽鍵(internal peptide bond)的酶(具有 內肽酶活性)。對于根據(jù)本發(fā)明使用的內肽酶的來源并無限制。因此，術語內肽酶不僅包括天然 或野生型的內肽酶，還包括其顯示內肽酶活性的任何突變體、變體、片段等，以及合成的內 肽酶，如經改組的內肽酶?？扇绫绢I域所公知的制備經遺傳工程改造的內肽酶變體，例如， 通過定點誘變，通過PCR (使用包含所需突變的PCR片段作為所述PCR反應中的引物之一)， 或通過隨機誘變。內肽酶變體的實例，如用于本上下文中，是其中一個或多個氨基酸被缺 失、插入或以其他氨基酸取代的內肽酶。
根據(jù)本發(fā)明使用的內肽酶的實例是(i)來源于擬諾卡氏菌菌種NRRL 18262的內肽酶，其公開于W001/58276，其序列 如本申請文件的SEQ ID NO 1所示；(ii)與⑴的內肽酶具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90或至少95%氨基酸 同一性的內肽酶；(iii)⑴或(ii)的內肽酶顯示內肽酶活性的突變體、變體或片段。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列的比對可以通過使用EMBOSS程序包(http:// emboss, org)版本 2. 8. 0 的 Needle 程序來確定。Needle 程序執(zhí)行 Needleman，S. B.和 Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48，443-453 中描述的全局比對算法(global alignment algorithm)。使用的取代矩陣是 BL0SUM62，缺口產生罰分(gap opening penalty)是 10， 并且缺口延伸罰分(gap extension penalty)是 0· 5。兩個氨基酸序列之間的同一性程度這樣計算，用兩個序列的比對中的精確匹配的 數(shù)目除以兩個序列中最短序列的長度。結果以百分比同一性表示。當兩個序列在重疊的相同位置具有相同的氨基酸殘基時，出現(xiàn)精確匹配。序列的 長度為序列中的氨基酸殘基的數(shù)目(例如SEQ ID NO :1的長度是188)。作為可適用于本發(fā)明的細菌內肽酶的實例，還可提及的是W088/03947中 公開的來自白擬諾卡氏菌(Nocardiopsis alba)(先前為達松維爾擬諾卡氏菌 (Nocardiopsis dassonvillei)NRRL 18133的內肽酶；來自達松維爾擬諾卡氏菌達松維 爾亞種(Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei)DSM 43235、白擬諾卡氏菌 DSM 15647、擬諾卡氏菌屬菌種DSM 164M的內肽酶和合成的蛋白酶22，全部四種公開于 W004/111220 中；W004/111222 中公開的來自蔥綠擬諾卡氏菌(Nocardiopsis prasina) DSM 15648的內肽酶；W004/111223中公開的來自蔥綠擬諾卡氏菌DSM 15649的內肽酶； 來自蔥綠擬諾卡氏菌(先前為白擬諾卡氏菌)DSM 14010、嗜堿擬諾卡氏菌(Nocardiopsis alkaliphila)DSM44657 和盧森坦擬諾卡氏菌(Nocardiopsis lucentensis)DSM 44048 的 內肽酶，全部三種公開于 W005/123911 中；來自 Brachysporiella gayana CGMCC 0865、綠 僵菌(Metarhizium anisopliae)、粘帚酶屬菌種(Gliocladium sp.)CBS 114001、黑團孢 屬菌種(Periconia sp.)CBS 114002、黑團孢屬菌種 CBS 114000 和新月彎孢(Curvularia lunata)CBS 114003的內肽酶，全部六種公開于W004/072279中；以及這些顯示內肽酶活性 的突變體、變體或片段。根據(jù)本發(fā)明使用的內肽酶是微生物內肽酶，優(yōu)選細菌內肽酶，術語“細菌的 (bacterial) ”表明所述內肽酶衍生自或起源于細菌，或是源自細菌的類似物、片段、變體、 突變體或合成內肽酶。其可在原始野生型細菌菌株中、在另一微生物菌株中或在植物中產 生或表達；即所述術語涵蓋野生型、天然存在的內肽酶的表達，以及重組內肽酶、遺傳工程 內肽酶或合成內肽酶在任何宿主中的表達。在本發(fā)明的方法中，內肽酶可以是純化的。術語“純化的”用于本文包括富集了 所述酶蛋白的酶蛋白制備物。上述富集可為，例如，去除了產生胞外酶蛋白的生物的細胞， 通過蛋白質特異性沉淀去除非蛋白物質，或使用色譜法，其中所述酶蛋白被選擇性吸附并 從色譜基質中洗脫。所述內肽酶可經純化至這樣的程度使得僅僅存在少量的其他蛋白 質。表述“其他蛋白質”具體而言指其他酶。用于本發(fā)明方法的內肽酶可為“基本上純的(essentially pure) ”，即，基本上不含來自產生它的生物的其他組分，所述生物可為天然 存在的微生物，或經遺傳修飾的供重組產生所述內肽酶的宿主微生物。然而，對于本發(fā)明的使用，內肽酶不需要那么純。其可以例如包括其他酶，甚至其 他內肽酶。在一個優(yōu)選方面，用于本發(fā)明方法的內肽酶經純化以含有總蛋白質中至少20%、 優(yōu)選至少30%、至少40%或至少50% (w/w)的所述內肽酶。內肽酶的量可由制備物活性測 量值除以所述內肽酶的比活性(活性/mg EP)來計算，或可通過SDS-PAGE或本領域已知的 任何其他方法來量化?？偟鞍踪|的量可(例如)通過氨基酸分析來測定。本發(fā)明的內肽酶的使用可以與其他酶(例如其他蛋白酶)的使用組合。在一個優(yōu) 選的實施方案中，將內肽酶，例如源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL 18262的內肽酶，與外肽酶 組合，或與具有外肽酶活性的蛋白酶制備物組合，例如源自米曲霉(Aspergillus oryzae) 的蛋白Bl制備物，如 W094/25580 中所述,如 Flavourzyme (Novozymes A/S, Denmark)。在一個具體實施方案中，當通過對酪蛋白的水解和后續(xù)的TCA可溶性肽與鄰苯二 醛(o-phthaldialdehyde)及2_巰基乙醇的反應，然后測量所得復合物在340nm的吸光度 來進行測定時，用于本發(fā)明的內肽酶具有接近中性的PH-活性最優(yōu)值(最適pH)。術語pH活性最優(yōu)值接近中性可意為所述內肽酶具有PH 5.5-11，優(yōu)選pH7_l 1，更 優(yōu)選PH 8-11，甚至更優(yōu)選pH 9.5-10.5的區(qū)間中，且最優(yōu)選在大約pH 10的最適pH。在另一具體實施方案中，用于本發(fā)明的內肽酶是熱穩(wěn)定的。術語熱穩(wěn)定可意為，當如上所述通過酪蛋白水解確定時，在pH 9的最適溫度為至 少50°C或至少55°C，優(yōu)選至少60°C，更優(yōu)選至少65°C，且甚至更優(yōu)選至少67 V，如約70°C。酪蛋白水解物在本發(fā)明的上下文中，酪蛋白是奶中主要的蛋白質組，其可構成奶和奶酪中所 有蛋白質的75-80%。酪蛋白的可溶性形式可由酸和/或由干胃膜(rennet)來凝結 (coagulate)。 在一個優(yōu)選實施方案中，所述酪蛋白來自牛奶。用于本發(fā)明方法的酪蛋白可為，例如，酪蛋白酸鈉、酪蛋白酸鉀或酪蛋白酸鈣的形 式。在本發(fā)明方法中，所述酪蛋白物質通常在水中混合或分散以形成漿料，其包含按 重量計約1 %到約25%的蛋白質。在一個實施方案中，所述漿料可包含按重量計約1 %到約 5%的蛋白質。在另一個實施方案中，所述漿料可包含按重量計約6%到約10%的蛋白質。 在另一個實施方案中，所述漿料可包含按重量計約11%到約15%的蛋白質。還在另一個實 施方案中，所述漿料可包含按重量計約16%到約20%的蛋白質。還在另一個實施方案中， 所述漿料可包含按重量計約21%到約25%的蛋白質。在一個優(yōu)選實施方案中，所述漿料按 重量計可包含約5%到約25%的蛋白質。在將所述蛋白質物質分散于水中后，可調整所述蛋白質漿料的pH和/或溫度從而 優(yōu)化水解反應，特別是保證用于所述水解反應的內肽酶的功能接近其最優(yōu)活性水平。所述 蛋白質漿料的PH可根據(jù)本領域公知的方法進行調整并監(jiān)測。所述蛋白質漿料的pH可調整 至約5到約10。在一個實施方案中，所述蛋白質漿料的pH可調整至約6到約9。在一個優(yōu)選 實施方案中，所述蛋白質漿料的PH可調整至約6. 5到約8。所述蛋白質漿料的pH可在水解反應過程中保持在上述水平，或可允許隨著水解反應的進行而減少。在水解反應過程中根 據(jù)本領域公知的方法將所述蛋白質漿料的溫度優(yōu)選地調整并維持在約45°C到約70°C。在 一個優(yōu)選實施方案中，在水解反應過程中可將所述蛋白質漿料的溫度調整并維持在約63°C 到約70°C。一般而言，高于該范圍的溫度可能使所述內肽酶失活，而低于或高于該范圍的溫 度會降低(slow)所述內肽酶的活性。所述水解反應通常通過將所述內肽酶添加到蛋白質物質的漿料來起始?；蛘撸?述酶可分散于水中，并一邊攪拌一邊緩慢添加所述蛋白質物質。在制備濃縮的蛋白質漿料 以避免粘度過高時，后一方法可為有利的。優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的內肽酶量是每kg酪蛋白約0. 005到約100AU(定義如 下)，優(yōu)選每kg酪蛋白約0. 01到約50AU，更優(yōu)選每kg酪蛋白約0. 02到約30AU。一個Anson單位(AU)定義為在標準條件下(S卩，25°C，pH7. 5和10分鐘反應時間) 以下述初始速率消化血紅蛋白的酶量，所述速率使得每分鐘釋放的TCA可溶性產物的量與 一毫當量的酪氨酸在與酚試劑作用時得到相同的顏色。當確定AU活性時，血紅蛋白的濃度 可優(yōu)選為約1.3%。添加至蛋白質物質的內肽酶的量能夠且會依賴于所述蛋白質物質的來源、所需的 水解程度和水解反應的持續(xù)時間而變化。內肽酶的量的范圍可為每千克酪蛋白約Img酶蛋 白到約5000mg酶蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，所述量的范圍可為每千克酪蛋白Img酶蛋 白到約IOOOmg酶蛋白。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述量的范圍可為每千克酪蛋白約5mg 酶蛋白到約500mg酶蛋白。如本領域技術人員所理解的，水解反應的持續(xù)時間能夠且會變化。一般而言，水解 反應的持續(xù)時間的范圍可為幾分鐘到許多小時，如約30分鐘到約48小時。優(yōu)選地，用內肽酶處理具有約0. 1 %到約20 %，更優(yōu)選約0. 5 %到約10 %，或約 0. 5%到約8%，甚至更優(yōu)選約2%到約8%的水解度(DH)的酪蛋白水解物。水解度(DH)表示通過所述方法獲得的蛋白質水解的程度。在本發(fā)明的上下文中， 水解度(DH)定義如下DH =(被切割的肽鍵的數(shù)目/肽鍵總數(shù))χ100%本領域技術人員會知道如何測量DH。其可，例如，使用如Adler-Nissen，J.，1986， Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins，第 5 章，第 122-1M 頁所述的方法進行。在完成步驟b)之后，可將所述內肽酶失活。上述失活可通過本領域任何抑制方法 進行，例如，通過加熱至至少75°C，如至少80°C或至少85°C。在一個實施方案中，本發(fā)明方法進一步包含用一種或多種另外的具有蛋白酶活性 的酶處理所述酪蛋白組合物。上述另外的蛋白水解酶可為一種或多種內肽酶和/或一種或 多種外肽酶。所述一種或多種外肽酶可為，例如，一種或多種氨肽酶和/或一種或多種羧肽 酶。用具有與SEQ ID NO=I至少50%的同一性的內肽酶進行溫育，和用一種或多種另 外的具有蛋白酶活性的酶進行溫育可不同時進行。即，如果所述蛋白水解酶并不在相同的 PH和/或相同的溫度下起作用，則可將所述酪蛋白組合物先與一種(或多種)蛋白水解酶 溫育，然后是任選地調整PH和/或溫度和隨后與其他蛋白水解酶溫育。當使用一種或多種另外的具有蛋白酶活性的酶時，所得的酪蛋白水解物可具有高于上面所示的水解度(DH)。其可，例如，具有約5-25%的水解度。由本發(fā)明方法獲得的酪蛋白水解物可用于食品，例如，飲料。本發(fā)明的食品可為任 何意欲供人食用的產物。上述食品的非限制性實例包括營養(yǎng)條、干混飲料、運動飲料、能量 飲料(energy drink)和嬰兒配方。通過本發(fā)明方法獲得的酪蛋白水解物還可用于臨床營 養(yǎng)(clinical nutrition)，例如，在醫(yī)院中。實施例用來自擬諾卡氏菌菌種NRRL18262具有SEQ ID NO 1所示的序列的內肽酶和 Alcalase 2. 4L(Novozymes A/S, Denmark)水解酪蛋白酸鈉的比較。用蛋白酶水解蛋白質制備來自 Arla Foods，Denmark 的酪蛋白酸鈉，Miprodan 30，88%蛋白質15g+285g 水。將所述酪蛋白酸(鹽)產物用脫礦物質水(demineralised water) (Milli Q)懸 浮為5%W/v懸液。將水加熱至60°C，并將所述蛋白質添加至所述Milli Q水中同時在混 合器(blender)中攪拌1_2分鐘，或直至所述蛋白質懸浮或溶解。pH 調整將pH用4N NaOH調整為8. 0，并在水解反應過程中保持。酶劑量將所述擬諾卡氏菌屬蛋白酶和Alcalase 2. 4L以10、50和IOOmg酶蛋白(印)/kg 蛋白質劑量添加。在操作時將酶儲存于冰上。酶處理溫度60°C+/_1°C時間120分鐘在磁攪拌器上在水浴中將酶添加至所述蛋白質懸液。當?shù)鞍踪|溶液的溫度達到 60°C時添加酶。熱失活/儲存在酶處理后，立刻將試樣在85°C在振蕩水浴中熱處理15分鐘。將試樣在冰上冷 卻，并冷藏于4°C過夜。在4°C溫育過夜后，評價溶解度和水解度。溶解度使用Leco FP 5 蛋白質/氮分析儀在pH 4. 0和6. 5測量溶解度，其通過燃燒法 (combustion method)測定蛋白質和氮含量。所述氮含量在可溶性級分中測定，且將溶解度 計算為總干物質含量中氮含量的百分比。水解度如 Adler-Nissen, J. , 1986, Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins,第 5 章， 第122-1 頁所述通過pH恒定法(pH stat)來測量所述懸液的水解度。結果水解度
溶解度 pH 6. 5
權利要求
1.一種產生酪蛋白水解物的方法，包括a)向包含酪蛋白的組合物添加與SEQID NO :1具有至少50%同一性的內肽酶；和b)溫育以水解所述酪蛋白。
2.權利要求1的方法，其中所述內肽酶與SEQID NO 1具有至少60%的同一性。
3.權利要求1的方法，其中所述內肽酶與SEQID NO 1具有至少80%的同一性。
4.前述任一項權利要求的方法，其中所述內肽酶的最適pH為pH9.5至？!1 10.5。
5.前述任一項權利要求的方法，其中在pH9時所述內肽酶的最適溫度為至少60°C。
6.前述任一項權利要求的方法，其中所述內肽酶來自擬諾卡氏菌屬。
7.前述任一項權利要求的方法，其中所述內肽酶以每kg酪蛋白1到IOOOmg酶蛋白的 濃度添加。
8.前述任一項權利要求的方法，其中所述內肽酶以每kg酪蛋白0.01到50AU的活性添加。
9.前述任一項權利要求的方法，其中所述組合物包含約5%到約25%酪蛋白。
10.前述任一項權利要求的方法，其中所述酪蛋白水解物具有至少2%的水解度。
11.前述任一項權利要求的方法，其進一步包括用一種或多種另外的具有蛋白酶活性 的酶處理所述酪蛋白組合物。
12.前述任一項權利要求的方法，其進一步包括用一種或多種外肽酶處理所述酪蛋白 組合物。
13.由前述任一項權利要求的方法產生的酪蛋白水解物。
14.由權利要求1-12任一項所述的方法產生的酪蛋白水解物在食品中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用微生物內肽酶產生酪蛋白水解物的方法。
文檔編號A23J3/34GK102046782SQ200980119144
公開日2011年5月4日 申請日期2009年5月29日 優(yōu)先權日2008年6月3日
發(fā)明者吉特·B·林格里夫, 珀·M·尼爾森 申請人:諾維信公司