專利名稱：：α_s1-酪蛋白來源的阿片肽(AOPP)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，更具體的說，是涉及一種ocsl-酪蛋白來源的阿片肽(A0PP)。
背景技術(shù)：
：乳是外源性阿片肽的通常來源，一般把來自于酪蛋白的阿片肽，叫酪啡肽(Casomorphin，CM),來自于乳清蛋白的阿片肽，叫乳啡肽(Lactorphins)。1979年Brantl等人最早報道從喂食了牛乳酪蛋白酶解物的豚鼠的回腸縱行肌毛細(xì)血管中發(fā)現(xiàn)了具有類嗎啡活性的短肽，他們首先從酶解的(3-酪蛋白水解產(chǎn)物中分離到一個七肽物質(zhì)(Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-lie)為|3-酪蛋白第60-66氨基酸殘基片斷，命名為P-酪啡肽-7(P-CM-7),與ju受體具有良好的親和力，并呈現(xiàn)出阿片肽類所具有的特征，如依賴性、呼吸抑制性等。隨后人工合成了P-CM-7和它的同系物P-CM-6、P-CM-5、(3-CM-4,并證明(3-CM-5在豚鼠回腸試驗中具有最強(qiáng)的阿片活性。Meisel等則從飼喂牛酪蛋白的微型豬空腸食糜中分離到一個阿片肽，對應(yīng)(3-酪蛋白第60~70氨基酸殘基片斷Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-1le-Pro-Asn-Ser-Leu，稱為(3-CM-11，是p-CM-7的前體。'一般來講，從含3個氨基酸到含7個氨基酸的小肽均稱為P-酪啡肽，7個以上則稱P-酪啡肽前體。研究結(jié)果表明對于所有不同數(shù)量氨基酸殘基的酪啡肽，要保持其生物活性，N-末端Tyr-Pro-Phe-氨基酸結(jié)構(gòu)不能改變，這種結(jié)構(gòu)是其與阿片受體結(jié)合不可缺少的，所有類型的P-酪啡肽都是P-CM-11的C-末端丟掉一或多個氨基酸殘基形成的。p-酪啡肽由于脯氨酸的含量高，可避免被胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶降解。但當(dāng)它被腸吸收后，會被腸粘膜上的二肽基-二肽酶IV(DPIV)降解成X-Pro(N-末端)二肽類物質(zhì)。后來又發(fā)現(xiàn)來源于人(3-酪蛋白的阿片活性肽有f51-57、f51-54、f51-55、f41-44等4個氨基酸片斷，其中f51-57排列順序與牛的P-CM-7相似，只是在第4、5位上不同(Tyr-Pro—Phe—Val—Gin—Pro—lie),其阿片活性比牛(3—CM—7低4-5倍。Loukas等1983年報道牛乳a81-酪蛋白的三個水解片斷f90-95、f90-96、f91-96同樣具有阿片活性，而且均為5受體的選擇性配體。同年Ermisch等通過給鼠注射標(biāo)記的P-CM-5后發(fā)現(xiàn)這種阿片肽可以^L輕;^地通過血腦屏障，從而與腦內(nèi)的阿片受體結(jié)合。據(jù)Chabance報道，成年人在大量飲用牛奶后，在其胃腸道內(nèi)能檢測到多種酪蛋白水解產(chǎn)生的酪啡肽片斷1,我們認(rèn)為這些阿片肽可以直接作用于消化道中的阿片肽受體以影響胃腸道的運(yùn)動或者作為胃腸道激素的外源性調(diào)節(jié)劑，也可能在小腸刷狀緣降解成更小的疏水性阿片肽，穿過腸粘膜進(jìn)入外周血液，再透過血腦屏障與中樞阿片受體結(jié)合，從而發(fā)揮其鎮(zhèn)痛、呼吸抑制、促進(jìn)睡眠、調(diào)節(jié)行為、刺激攝食等作用。2003年P(guān)erpetuo等用胰蛋白酶水解y-酪蛋白又發(fā)現(xiàn)了一種含有8個氨基酸殘基的新阿片活性肽Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-Thr-Glu，對應(yīng)y-酪蛋白的第114-121氨基酸序列。2005年韓飛等利用基因重組畢赤酵母生產(chǎn)出一種短肽，含10個氨基酸殘基，序列為Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Arg-Tyr-Gly，在CM-7的基礎(chǔ)上又增加了3個氨基酸，經(jīng);險測具有明顯的阿片活性。同年，LiangJ等報道從硬虱中分離得到一種阿片肽，序列為Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Lys-Met,但因這種物質(zhì)與此前從哺乳動物血色素中4是:取的阿片肽hemorphin有;f艮大的序列相似性，而硬虱又是一種以吸食血液為生的動物，所以該肽是硬虱本身產(chǎn)生還是在吸食血液時從宿主獲得有待進(jìn)一步研究。另外，a-乳清蛋白含有一個阿片活性序列(Tyr-Gly-Leu-Phe),為第50-53氨基酸片斷，稱為a-乳啡肽(oc-Lactorphin)。與此相似，(3-乳球蛋白的第102-105氨基酸片斷(Tyr-Leu-Leu-Phe)同樣具有阿片活性，稱為p-乳啡肽(|3-Lactorphin)。來自于牛血清白蛋白(BSA)的399-404片斷(Tyr-Gly-Phe-Gin-Asn-Ala)也是一種阿片肽,稱為Serorphin。人們在水解酪蛋白得到阿片活性肽的同時，也發(fā)現(xiàn)了一些具有阿片拮抗作用的短肽。Chiba和Yoshikawa都報道從牛乳和人乳k-酪蛋白酶解液中發(fā)現(xiàn)其含有類似納洛酮阿片拮抗作用的短肽，稱為酪新素(Casoxins)。目前從k-酪蛋白發(fā)現(xiàn)的阿片拮抗肽有CasoxinsA(f35-41,Tyr—Pro-Ser-Tyr-Gly—Leu—Asn)、CasoxinsB(f58-61,Tyr-Pro-Tyr-Tyr)4和CasoxinsC(f25—34,Tyr-Ile-Pro—Ile-Gln-Tyr-Val-Leu-Ser-Arg),其中CasoxinsC的拮抗活性最高。而CasoxinsD則是從人乳a"-酪蛋白中分離得到的又一個阿片拮抗肽，其序列對應(yīng)于a"-酪蛋白的158-164氨基酸片斷Tyr-Va1-Pro-Phe-Pro-Pro-Phe。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這些酪新素的C-末端在曱氧基化能顯示出更高的活性。另外，人乳鐵蛋白經(jīng)酶解同樣可以產(chǎn)生阿片拮抗肽，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有三種LactorferroxinA(f318-323，Tyr-Leu-Gly-Ser-Gly-Tyr-0CH3)、LactorferroxinB(f536-540,Arg-Tyr-Tyr-Gly—Tyr—0CH2)、LactorferroxinC(f673-679，Lys-Tyr-Leu-Gly-Pro-Gin-Tyr-0CH3)。其中LactorferroxinA選擇性結(jié)合ju受體，LactorferroxinB、C則對k受體有比舉交高的親和力。同內(nèi)源性阿片肽類似，外源性阿片肽也具有自己特定的N-末端序列Y-X-F或Y-X-X-F/Y。它們的氨基末端均具有Tyr殘基(cc-酪啡肽除外)，而且在第三或四位上還有其他的芳香族氨基酸如Phe、Tyr的出現(xiàn)，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對于阿片肽和體內(nèi)受體位點(diǎn)的特異性結(jié)合非常重要。在Loukas報道的三個a-酪啡肽中，f90-95和f90-96片段的第一個氨基酸殘基是Arg，同其他酪啡肽不同，但研究發(fā)現(xiàn)這也是其本身活性所必需的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。由此可見，研究阿片肽的氨基酸序列，對于進(jìn)一步探討其結(jié)構(gòu)、功效有著十分重要的價值。表1列出了目前發(fā)現(xiàn)的一些主要外源性阿片肽及其序列。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為了提供一種oc81-酪蛋白來源的阿片肽及其制備方法。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)本發(fā)明利用胃蛋白酶酶解o^-酪蛋白，確立了生成最高阿片活性的酶解條件，并對酶解液進(jìn)行了醇沉粗提和Sephadex層析，從而分離得到了一種具有阿片活性的短肽，該阿片肽命名為AOPP(Alpha-SI-CaseinOpioidPeptide),其氨基酸序列為YFYPELFRQFYQLDA。該ocsi-酪蛋白來源的阿片肽的制備方法如下(1)酶解在底物中加入胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為2.0，在42。C酶解2.5h,其中，底物是濃度為3。/。(w/v)的0Cs,-酪蛋白溶液，胃蛋白酶與ou-酪蛋白的比例為1:30(w/w);(2)在上述酶解液中用濃度為80%的乙醇沉淀雜蛋白，阿片活性物質(zhì)6基本保留在上清液中，取上清液；之后，選用SephadexG-50層析柱對上述上清液進(jìn)行分離層析，收集活性峰即第三個峰。層析條件為洗脫速度為0.75ml/min，上樣濃度為50mg/ml，洗脫緩沖液采用pH為7.1、濃度為0.05mol/L的三羥甲基絲曱烷鹽酸鹽(tris-HC1)。(3)將收集液經(jīng)SephadexG-15層析柱再細(xì)分離層析，經(jīng)4企測第四個峰具有活性，收集第四個峰，凍干即得ocs廣酪蛋白來源的阿片肽。層析條件為洗脫速度為0.5ml/min，上樣濃度為10mg/ml,洗脫緩沖液采用pH為7.1、濃度為0.05mol/L的tris-HC1。本發(fā)明分離得到的阿片肽經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳和毛細(xì)管電泳檢測，是一種單一組分，經(jīng)過氨基酸組成分析和適合度檢驗得知，其對應(yīng)于Alpha-Si-casein的144-158序列YFYPELFRQFYQLDA,分子量為2252.48。在國際權(quán)威蛋白及生物活性肽數(shù)據(jù)庫查詢得知，這是一種新型的阿片活性肽。利用蛋白分析序列軟件ANTHEPROT5.0和TheSwiss-PdbViewer對其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了相應(yīng)預(yù)測，其等電點(diǎn)pl=4.035，二級結(jié)構(gòu)中螺旋占40%,盤繞占27%,轉(zhuǎn)角占20%,折疊占13°/。，第四位PRO處有一個折疊，且結(jié)構(gòu)中有四個電荷集中區(qū)域。最后經(jīng)離體豚鼠回腸實驗發(fā)現(xiàn)，該肽可以抑制回腸的自主收縮，繪制量效曲線得出它的半數(shù)抑制濃度為IC5。=3.177mg/ml,小鼠負(fù)重游泳試-險也證明該肽確有明顯的抗疲勞作用。圖1為本發(fā)明阿片肽空間結(jié)構(gòu)示意圖。具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例(1)酶解在底物中加入胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為2.0，在42。C酶解2.5h,其中，底物是濃度為3。/。(w/v)的ccs「酪蛋白溶液，胃蛋白酶與0Csi-酪蛋白的比例為1:30(w/w)。(2)在上述酶解液中用濃度為80%的乙醇沉淀雜蛋白，取上清液；之后，選用SephadexG-50層析柱對上述上清液進(jìn)行分離層析，收集第三個峰；層析條件為洗脫速度為0.75ml/min，上樣濃度為50mg/ml，洗脫緩沖液采用pH為7.1、濃度為0.05mol/L的tris-HCl。(3)將收集液經(jīng)SephadexG-15層析柱再分離層析，收集第四個峰，凍干即得oc酪蛋白來源的阿片肽。其中，層析條件為洗脫速度為0.5ml/min，上樣濃度為10mg/ml，洗脫緩沖液采用pH為7.1、濃度為0.05mol/L的tris-HC1。經(jīng)氨基酸組成分析及與酪蛋白的氨基酸序列比較獲知，該肽是一種新型阿片肽，并才艮據(jù)其序列推測其空間結(jié)構(gòu)如圖l所示。權(quán)利要求1、一種αs1-酪蛋白來源的阿片肽-AOPP，其氨基酸序列為YFYPELFRQFYQLDA。2、一種權(quán)利要求1所述的ocs廣酪蛋白來源的阿片肽的制備方法，其特征在于，包括下述步驟(1)酶解在底物中加入胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為2.0，在42'C酶解2.5h,其中，底物是濃度為3。/。(w/v)的ou廣酪蛋白溶液，胃蛋白酶與ct"-酪蛋白的比例為1:30(w/w);(2)在上述酶解液中用濃度為80%的乙醇沉淀雜蛋白，取上清液；選用SephadexG-50層析柱對上述上清液進(jìn)行分離層析，收集第三個峰；層析條件為洗脫速度為0.75ml/min，上樣濃度為50mg/ml;(3)將收集液經(jīng)SephadexG-15層析柱再分離層析，收集第四個峰，凍干即得ccu-酪蛋白來源的阿片肽；層析條件為洗脫速度為0.5ml/min，上樣濃度為10mg/ml。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的o^-酪蛋白來源的阿片肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)和步驟(3)中分離層析所使用的洗脫緩沖液采用pH為7.1、濃度為0.05mol/L的三幾曱基氨基曱烷鹽酸鹽。全文摘要本發(fā)明公開了一種α_s1-酪蛋白來源的阿片肽及其制備方法，其制備方法為在底物中加入胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為2.0，在42℃酶解2.5h，其中，底物是濃度為3％(w/v)的α_s1-酪蛋白溶液，胃蛋白酶與α_s1-酪蛋白的比例為1∶30(w/w)；在上述酶解液中用濃度為80％的乙醇沉淀雜蛋白，取上清液；之后，選用SephadexG-50層析柱對上述上清液進(jìn)行分離層析，收集第三個峰。將收集液經(jīng)SephadexG-15層析柱再細(xì)分離層析，收集第四個峰，凍干即得α_s1-酪蛋白來源的阿片肽。本發(fā)明得到的阿片活性肽，其對應(yīng)于Alpha-S1-casein的144-158序列YFYPELFRQFYQLDA，分子量為2252.48。該肽可以抑制回腸的自主收縮，有明顯的鎮(zhèn)痛和抗疲勞作用。文檔編號C12P21/06GK101525376SQ200910068509公開日2009年9月9日申請日期2009年4月17日優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日發(fā)明者龐廣昌,張建輝,胡志和,陳慶森申請人:天津商業(yè)大學(xué)