專利名稱：離子交換法制備高純度的酪蛋白糖巨肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及酪蛋白糖巨肽的分離純化方法，尤其是ー種利用大孔強(qiáng)堿苯性烯系陰離子交換樹脂分離純化酪蛋白糖巨肽，且利用噴霧干燥制備成品。
背景技術(shù)：
酪蛋白巨肽(CaseinGlycomacropeptide, CGMP)是ー種由凝乳酶(或胃蛋白酶)水解酪蛋白中K -casein的Phel05_Metl06的肽鍵得到的具有64個(gè)氨基酸殘基的短肽，具有多種生物活性，例如抑制細(xì)菌和病毒對(duì)宿主的毒害，調(diào)節(jié)胃腸道，預(yù)防腸道疾病，抗血栓 和降低血壓等功能，并且具有較高的溶解性和熱穩(wěn)定性、以及良好的乳化性和凝膠性等等。目前關(guān)于CGMP的制備一直是人們關(guān)注的話題，很多方法被嘗試用來制備和生產(chǎn)CGMP，但大多數(shù)方法并不能應(yīng)用于エ業(yè)化生產(chǎn)中。Tanimoto (1991年)用高溫?zé)崽幚淼姆椒ㄊ闺s蛋白變性、沉淀生產(chǎn)糖巨肽。但該方法需要長時(shí)間高溫處理，耗能量較多。Etzel (2001年)、袁永俊等利用凝膠層析法分離純化CGMP。但凝膠層析填料價(jià)格昂貴，不適合エ業(yè)エ業(yè)化生產(chǎn)。Saito T等于1991年報(bào)道了一種冷こ醇沉淀的技術(shù)方法生產(chǎn)CGMP，但該方法需要大量的冷こ醇，能耗多。2002年美國Holst申請(qǐng)的專利技術(shù)中分別采用20kDa和5kDa的膜對(duì)新鮮干酪甜乳清進(jìn)行截留，制備酪蛋白糖巨肽，但是膜分離技術(shù)在制備CGMP時(shí)也存在不足之處，如膜的清洗需要消耗大量的能量和水，同時(shí)對(duì)于目標(biāo)溶液中雜蛋白等含量較多吋，其分離效果和膜的污染等問題更加突出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種適合エ業(yè)化分離純化酪蛋白糖巨肽的方法，本方法提供的離子交換樹脂能夠較好的分離純化酪蛋白糖巨肽，且成本低，分離效果好。能夠應(yīng)用于酪蛋白糖巨肽的エ業(yè)化生產(chǎn)中。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下I、本發(fā)明中由大孔強(qiáng)堿苯性烯系陰離子交換樹脂來分離純化酪蛋白被糖巨肽，離子交換樹脂價(jià)格便宜，降低エ業(yè)化生產(chǎn)成本。2、本發(fā)明中分離純化的酪蛋白糖巨肽的離子交換樹脂對(duì)酪蛋白糖巨肽的吸附量高，解析附容易。對(duì)其他雜蛋白等的吸附量少。通過215nm和280nm吸光度計(jì)算酪蛋白糖巨肽的純度，用該種離子交換樹脂分離的酪蛋白糖巨肽的純度在90%以上，酪蛋白糖巨肽的回收率在80%以上。較高的酪蛋白糖巨肽純度和回收率充分證明了本發(fā)明分離純化酪蛋白糖巨肽的方法具有較好的純化效果。離子交換樹脂較低的價(jià)格，節(jié)約生產(chǎn)成本，給酪蛋白糖巨肽的エ業(yè)化生產(chǎn)帶來好處。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式對(duì)本專利進(jìn)ー步說明。圖I為本發(fā)明分離純化中酪蛋白糖巨肽洗脫結(jié)果曲線圖2為本發(fā)明分離純化洗脫結(jié)果中酪蛋白糖巨肽特征組分唾液酸驗(yàn)證圖；圖3為本發(fā)明分離純化酪蛋白糖巨肽電泳純度鑒定結(jié)果圖；其中圖2，從左到右分別為第27mL 90mL洗脫液的濃縮液；第93mL 138mL洗脫液的濃縮液；第141mL 207mL洗脫液的濃縮液 ’第2IOmL 267mL洗脫液合并濃縮液；第270mL 327mL洗脫液合并濃縮液。陰性空白対照。其中圖3為收集液電泳檢測(cè)結(jié)果圖，從左到右依次為，maker,第143mL, 149mL,155mL, 161mL, 167mL, 173mL, 179mL, 185mL, 191mL, CGMP 標(biāo)品
具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)ー步說明，其具體實(shí)施方案應(yīng)該理解為僅為舉例說明，不是限定性的，不能以下述舉例說明來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)例I酪蛋白糖巨肽的分離純化方法，步驟如下(I)配置干酪素水溶液，調(diào)整其pH為酶解的pH，酶解得到酶解液，沉淀雜蛋白離心得到上清液，經(jīng)中空纖維等濃縮；(2)向步驟(I)中得到的濃縮液通過離子交換樹脂D280進(jìn)行吸附，對(duì)吸附酪蛋白糖巨肽的離子交換樹脂以不同濃度的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，各濃度NaCl溶液的洗脫體積為1BV。(3)收集目標(biāo)洗脫液，經(jīng)中空纖維濃縮除鹽后，經(jīng)噴霧干燥得到酪蛋白糖巨肽產(chǎn)品，保存。實(shí)例2酪蛋白糖巨肽的制備方法，步驟如下(I)配置干酪素水溶液，調(diào)整其pH為酶解的pH，酶解得到酶解液，沉淀雜蛋白離心得到上清液，經(jīng)中空纖維等濃縮；(2)向步驟(I)中得到的濃縮液通過離子交換樹脂D296進(jìn)行吸附，對(duì)吸附酪蛋白糖巨肽的離子交換樹脂以不同濃度的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，各濃度NaCl溶液的洗脫體積為1BV。(3)收集目標(biāo)洗脫液，經(jīng)中空纖維濃縮除鹽后，經(jīng)噴霧干燥得到酪蛋白糖巨肽產(chǎn)品，保存。說明1、發(fā)明中應(yīng)用到的干酪素的來源(甘肅干酪素總廠購買)2、分離用離子交換樹脂不是特制產(chǎn)品，可以從任何離子交換樹脂生產(chǎn)公司購買3、噴霧干燥機(jī)，中空纖維等可以從任何公司購買。為驗(yàn)證本發(fā)明中絮凝劑在酪蛋白糖巨肽分離純化中的效果，特進(jìn)行如下驗(yàn)證試驗(yàn):驗(yàn)證試驗(yàn)I :離子交換樹脂分離純化酪蛋白糖巨肽的洗脫效果鑒定試驗(yàn)參見張惟杰，糖復(fù)合物生化研究技木，pp. 455-456中所述的間苯ニ酚-鹽酸法進(jìn)行酪蛋白糖巨肽的特性組分-唾液酸鑒定，以唾液酸含量的變化來表征酪蛋白糖巨肽的變化。具體試驗(yàn)如下2%間苯ニ酚溶液，O. lmol/1硫酸銅的水溶液O. 25ml，濃鹽酸80mL，カロ水至IOOml混均置室溫，4h后儲(chǔ)于4°C，此工作液呈黃色或緑色；對(duì)洗脫的收集液根據(jù)圖I的洗脫曲線，分成5組，對(duì)每一組的收集液進(jìn)行超濾除鹽。分別除鹽后溶液2ml，加間苯ニ酚試劑工作液2ml ;試管加蓋于100°C沸水浴15min，快速冷卻；加醋酸正丁醇酯-正丁醇(85 14)細(xì)1，振蕩提取后在37で下水浴151^11，取上層有機(jī)相，測(cè)定其在58011111波長下的吸光度；以水為陰性對(duì)照，結(jié)果見圖1，圖2。圖2經(jīng)間苯ニ酚-鹽酸法檢測(cè),只有收集的第141mL 207mL洗脫液的濃縮液上層有機(jī)相顯為藍(lán)紫色，此為唾液酸特征顏色，說明離子交換后洗脫液中含有CGMP。驗(yàn)證試驗(yàn)2 :離子交換分離純化后目標(biāo)洗脫峰中的酪蛋白糖巨肽純度鑒定取10 μ L目標(biāo)溶液，通過分離膠濃度為15%的SDS-PAGE電泳，檢測(cè)目標(biāo)峰中酪蛋白糖巨肽的純度，結(jié)果見圖3。參見郭堯君.蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)(1999版)ρρ92-118·中SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度方法，檢測(cè)目標(biāo)峰中酪蛋白糖巨肽純度。結(jié)果見圖3。 試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明中提供的離子交換樹脂及分離純化方法在酪蛋白糖巨肽的分離純化中能起到較好的分離純化效果。
權(quán)利要求
1.一種酪蛋白糖巨肽分離純化方法，其特征在于在分離純化CGMP中，利用離子交換樹脂等分離純化酪蛋白糖巨肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的離子交換樹脂，其特征在于離子交換樹脂為大孔強(qiáng)堿苯性烯系陰離子交換樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離純化方法，其特征包括利用鹽溶液，改變PH等對(duì)酪蛋白糖巨肽進(jìn)行解析附洗脫。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離純化方法，其特征包括利用不同濃度鹽溶液的梯度洗脫，線性洗脫等。利用梯度改變PH或線性改變pH等的洗脫。
5.一種去權(quán)利要求I所述的酪蛋白糖巨肽的分離純化方法，其特征在于分離純化步驟如下 含CGMP的目標(biāo)溶液，調(diào)整pH為5 9，利用相同pH的緩沖液平衡離子交換樹脂，上樣，上樣體積為1/20 1/4柱床體積(BV)，上樣流速為0. 2 4BV/h。洗脫采用線性洗脫或梯度洗脫。收集含目標(biāo)成分的洗脫液，過中空纖維除鹽，噴霧干燥制備產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的酪蛋白糖巨肽的分離純化方法，其特征在于應(yīng)用噴霧干燥制備酪蛋白糖巨肽，噴干條件為進(jìn)風(fēng)溫度100 250°C，鼓風(fēng)為40 80m3/h，進(jìn)料蠕動(dòng)泵流速為25 125rpm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離純化酪蛋白糖巨肽的方法，由離子交換樹脂對(duì)酪蛋白糖巨肽進(jìn)一步提純，精制的方法。本發(fā)明提供的用于酪蛋白糖巨肽分離的離子交換樹脂價(jià)格便宜，對(duì)酪蛋白糖巨肽的吸附量高，且易于解吸附。運(yùn)用該離子交換樹脂進(jìn)行分離時(shí)，洗脫步驟少，洗脫的酪蛋白糖巨肽純度高。樹脂較低廉的價(jià)格，節(jié)約了工業(yè)化生產(chǎn)成本。較高的吸附量，易于解析附，洗脫酪蛋白糖巨肽純度高使工業(yè)化能保證在獲得較高純度的情況下，提高了產(chǎn)品得率，給酪蛋白糖巨肽的工業(yè)化生產(chǎn)帶來好處。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102746392SQ20111010159
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者王艷萍, 趙運(yùn)星 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)