專利名稱：：乳清蛋白水解物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種使用微生物內(nèi)肽酶來生成乳清蛋白水解物的方法。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)補(bǔ)充物(諸如乳清蛋白粉末)普遍被健身者和其它運(yùn)動(dòng)員用于加速肌肉發(fā)育和幫助恢復(fù)。同樣地，此類蛋白質(zhì)補(bǔ)充物對于臨床營養(yǎng)是有用的。一般而言，預(yù)先消化的、經(jīng)過部分水解的乳清蛋白比未水解的蛋白質(zhì)更容易吸收，這便是為何蛋白質(zhì)水解物被認(rèn)為具有營養(yǎng)益處。但是未水解的乳清蛋白在味道方面清淡略有奶味(mildandslightlymilky)，而經(jīng)過水解的乳清蛋白趨于嘗起來完全不同，通常在某種程度上是不受多數(shù)人歡迎的。因此，在此類水解物使用在例如飲料中時(shí)，該味道不得不通過例如添加人造香料來掩至ΓΤΠο使用特定內(nèi)肽酶來水解蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域已知的，參見例如W097/43910。對β-乳球蛋白(其是乳清蛋白中所存在的蛋白質(zhì)之一)的水解已經(jīng)在Madsen等(1997)，Int.DairyJournal，7，399-409頁中進(jìn)行了研究。還有，用不同蛋白酶水解β-乳球蛋白的表位記載于FoodProteinsandTheirApplications;Ed.S.Damodaran禾口A.Paraf;MarcelDekker，NewYork,1997；443-472頁。發(fā)明概述本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了一種用于生成乳清蛋白水解物的方法，其中用針對精氨酸和賴氨酸具有特異性的微生物內(nèi)肽酶對所述乳清蛋白進(jìn)行處理，接著使所述內(nèi)肽酶失活，這產(chǎn)生具有可口味道的水解物。所述水解物可能甚至具有比未水解的乳清蛋白更好的味道。此外，通過本發(fā)明方法所獲得的乳清蛋白水解物是穩(wěn)定的，而且與用其它內(nèi)肽酶獲得的水解物相比在熱處理時(shí)具有降低的膠化趨勢。因此，本發(fā)明涉及一種用于生成乳清蛋白水解物的方法，包括a)提供包含β-乳球蛋白和α_乳清蛋白的乳清蛋白的水性組合物；b)使所述組合物受到在精氨酸或賴氨酸的羧基端一側(cè)進(jìn)行特異性切割的微生物內(nèi)肽酶的作用；并c)使所述內(nèi)肽酶失活。本發(fā)明還涉及通過上文方法所獲得的乳清蛋白水解物在臨床營養(yǎng)或能量飲料(energydrink)或運(yùn)云力飲料(sportsdrink)中的用途。發(fā)明詳述如上文所提及的，本發(fā)明涉及一種用于生成乳清蛋白水解物的方法，包括a)提供包含β-乳球蛋白和α_乳清蛋白的乳清蛋白的水性組合物；b)使所述組合物受到在精氨酸或賴氨酸的羧基端一側(cè)進(jìn)行特異性切割的微生物內(nèi)肽酶的作用；c)使所述內(nèi)肽酶失活。要在本發(fā)明方法中使用的乳清蛋白要理解為可從乳清獲得的蛋白質(zhì)，諸如自乳清分離的蛋白質(zhì)。乳清可定義為在乳因酸和/或粗制凝乳酶(rennet)凝結(jié)時(shí)分開的液體部分。如此，乳清可以是來自干酪生產(chǎn)或來自酪蛋白生產(chǎn)的副產(chǎn)物。在本發(fā)明語境中的乳可以源自任何哺乳動(dòng)物，諸如牛(cow)、山羊、綿羊、驢、駱駝、camelid、牦牛、或水牛。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述乳是牛奶。要在本發(fā)明方法中使用的乳清蛋白包含乳球蛋白和α-乳清蛋白。它還可以包含可從乳清獲得的其它蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白。步驟a)的水性組合物還可以包含不可從乳清獲得的其它蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，步驟a)的水性組合物包含占總干物質(zhì)至少15%，諸如至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%的β-乳球蛋白。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，步驟a)的水性組合物包含占總干物質(zhì)至少5%，諸如至少10%、至少15%或至少20%的α-乳清蛋白。另一方面，步驟a)的水性組合物包含占總干物質(zhì)至少1%、諸如至少2%、至少3%、至少4%或至少5%的血清清蛋白。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，步驟a)的水性組合物包含占總蛋白質(zhì)至少15%(w/w(重量/重量))，諸如至少20%(w/w)、至少25%(w/w)、至少30%(w/w)、至少35%(w/w)、至少40%(w/w)、至少45%(w/w)、至少50%(w/w)、至少55%(w/w)或至少60%(w/w)的β-乳球蛋白。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，步驟a)的水性組合物包含占總蛋白質(zhì)至少5%(w/w)，諸如至少10%(w/w)、至少15%(w/w)或至少20%(w/w)的α-乳清蛋白。另一方面，步驟a)的水性組合物包含占總蛋白質(zhì)至少(w/w)，諸如至少2%(w/w)、至少3%(w/w),至少4%(w/w)或至少5%(w/w)的血清清蛋白。優(yōu)選地，乳清蛋白已經(jīng)從乳清中分離出來，且乳球蛋白和α-乳清蛋白之間的比率大體上與從中分離乳清蛋白的乳清中的相同。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法中所使用的乳清蛋白可以是乳清蛋白濃縮物，其具有約29%至小于約90%(以無水物為基礎(chǔ))的蛋白質(zhì)含量。乳清蛋白濃縮物含有低水平的脂肪和膽固醇，但是一般具有較高水平的乳糖形式的碳水化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，乳清蛋白可以是乳清蛋白分離物。一般而言，乳清蛋白分離物具有至少約90%乳清蛋白(以無水物為基礎(chǔ))的蛋白質(zhì)含量。一般而言，此類分離物已經(jīng)進(jìn)行了加工以除去脂肪和乳糖。要在本發(fā)明方法中使用的乳清蛋白可以是乳清蛋白濃縮物和乳清蛋白分離物的混合物。乳清蛋白可以包含完整的乳清蛋白或其可以包含經(jīng)過部分水解的乳清蛋白。在本發(fā)明的方法中，乳清蛋白材料通?；旌匣蚍稚⒃谒幸孕纬砂s至約20%蛋白質(zhì)(按重量計(jì))的漿料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述漿料可以包含約至約5%蛋白質(zhì)(按重量計(jì))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述漿料可以包含約6%至約10%蛋白質(zhì)(按重量計(jì))。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述漿料可以包含約11%至約15%蛋白質(zhì)(按重量計(jì))。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述漿料可以包含約16%至約20%蛋白質(zhì)(按重量計(jì))。在蛋白質(zhì)材料在水中分散后，可以對蛋白質(zhì)漿料的ρΗ和溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)以優(yōu)化水解反應(yīng)，具體地，以確保水解反應(yīng)中所使用的內(nèi)肽酶幾乎以其最佳活性水平起作用?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域普遍知道的方法對蛋白質(zhì)漿料的PH進(jìn)行調(diào)節(jié)和監(jiān)測。可以對蛋白質(zhì)漿料的PH進(jìn)行調(diào)節(jié)，并維持在約5.0至約10.0。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以對蛋白質(zhì)漿料的ρΗ進(jìn)行調(diào)節(jié)，并維持在約6.5至約8.0。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以對蛋白質(zhì)漿料的ρΗ進(jìn)行調(diào)節(jié)，并維持在約7.5。優(yōu)選地，依照本領(lǐng)域中已知的方法在水解反應(yīng)過程中對蛋白質(zhì)漿料的溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)，并維持在約40°C至約70°C。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以在水解反應(yīng)過程中對蛋白質(zhì)漿料的溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)，并維持在約40°C至約60°C。一般而言，高于此范圍的溫度可能使內(nèi)肽酶失活，而低于或高于此范圍的溫度趨于減緩內(nèi)肽酶的活性。一般地，通過將內(nèi)肽酶添加至蛋白質(zhì)材料的漿料來啟動(dòng)水解反應(yīng)。要在本發(fā)明方法中使用的內(nèi)肽酶在精氨酸殘基或賴氨酸殘基中任一的羧基端一側(cè)進(jìn)行特異性切割?！疤禺愋郧懈睢币庵竷?nèi)肽酶具有的在精氨酸或賴氨酸中任一的羧基端一側(cè)進(jìn)行切割的特異性高于在任何其它氨基酸的羧基端一側(cè)進(jìn)行切割的特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶在精氨酸的羧基端一側(cè)進(jìn)行特異性切割，意味著所述內(nèi)肽酶具有的在精氨酸的羧基端一側(cè)進(jìn)行切割的特異性高于在任何其它氨基酸的羧基端一側(cè)進(jìn)行切割的特異性。通常，內(nèi)肽酶在pH約6.0至約11.0，優(yōu)選地，pH約8至約10，且在約40°C至約70°C的溫度，優(yōu)選地，在約45°C至約60°C或約45°C至約55°C的溫度具有最佳的蛋白水解活性。要在本發(fā)明方法中使用的內(nèi)肽酶是微生物來源的。微生物酶(而不是動(dòng)物或植物酶)的使用是有利的，有利之處在于微生物酶展現(xiàn)出廣譜的特征(最適pH、溫度等)，而且可以相對大量地一致地獲得。優(yōu)選地，所述內(nèi)肽酶是微生物來源的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶。在本發(fā)明的語境中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶是具有與胰蛋白酶的特異性類似的特異性的內(nèi)肽酶，例如具有大于100的胰蛋白酶比率(Trypsinratio)的內(nèi)肽酶，其中所述胰蛋白酶比率根據(jù)該酶在Arg或Lys后切割時(shí)的活性(取較大者)除以該酶在任何其它氨基酸之后切割時(shí)的活性來測定。應(yīng)當(dāng)在如下pH值進(jìn)行用以測定胰蛋白酶比率的此類活性測量，內(nèi)肽酶在所述pH值的活性至少是內(nèi)肽酶在其最適PH的活性的一半?？梢匀绫旧暾埖膶?shí)施例3中所描述的那樣測定胰蛋白酶比率。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶是細(xì)菌內(nèi)肽酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶是真菌內(nèi)肽酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶來自鐮孢屬(Fusarium)菌株，優(yōu)選地，來自尖鐮孢(Fusariumoxysporum)，例如具有如本申請的SEQIDNO:2所示的氨基酸序列(SWISSPROTNo.P35049)。先前已經(jīng)描述了來自尖鐮孢的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶，其具有如SEQIDNO:2的氨基酸25-248所示的氨基酸序列(US5,288，627；US5,693，520)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶是來自水解無色桿菌(Achromobacterlyticus)的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶，例如具有如本申請的SEQIDN0:4所示的氨基酸序列(UNIPR0TP15636)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶是來自腐皮鐮孢(Fusariumsolani)的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶，例如具有如本申請的SEQIDN0:6所示的氨基酸序列(GENESEQP:ADZ80577)的AP977S。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶是來自腐皮鐮孢相似種(Fusariumcf.solani)的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶，例如具有如本申請的SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的AP971。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶選自下組i)多肽，其具有與如下的(A)或(B)至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%相同的氨基酸序列(A)SEQIDNO:2、4、6或8中任一，或⑶這些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段；ii)多肽，其由與SEQIDNO1、3、5或7中任一至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%相同的多核苷酸編碼；iii)多肽，其由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸的補(bǔ)體在至少低嚴(yán)格性條件，優(yōu)選至少中等嚴(yán)格性、至少高嚴(yán)格性或至少極高的嚴(yán)格性條件下，與SEQIDN0:l、3、5或7中任一雜交；和iv)多肽，其具有通過在如下的㈧或⑶中取代、缺失、和/或插入一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而修飾的氨基酸序列(A)SEQIDNO:2、4、6或8中任一，或(B)這些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段。氨基酸序列中具有蛋白酶活性的片段可以是活性酶的氨基酸序列，例如在加工后，諸如在切除任何信號肽和/或前肽后。優(yōu)選的片段是SEQIDNO:2的氨基酸25-248、SEQIDNO4的氨基酸21-653、SEQIDNO6的氨基酸26-251、或SEQIDNO8的氨基酸18-250。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶具有這樣的氨基酸序列，其與SEQIDNO2的氨基酸25-248至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%相同。極低的至極高的嚴(yán)格性條件定義為于42°C在5XSSPE、0.S^SDSJOOyg/ml經(jīng)過剪切的且變性的鮭精DNA、和或是用于極低的和低的嚴(yán)格性的25%甲酰胺、或是用于中等的和中_高的嚴(yán)格性的35%甲酰胺、或是用于高的和極高的嚴(yán)格性的50%甲酰胺中遵循標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡規(guī)程進(jìn)行最佳12至24小時(shí)的預(yù)雜交和雜交。最后，使用2XSSC、0.2%SDS，優(yōu)選至少在45°C(極低的嚴(yán)格性)、更優(yōu)選至少在50°C(低的嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在550C(中等嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在60°C(中-高嚴(yán)格性)，甚至更優(yōu)選至少在65°C(高嚴(yán)格性)，和最優(yōu)選至少在70°C(極高的嚴(yán)格性)清洗載體材料3次，每次15分鐘。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用0.2X33(、0.2%303，優(yōu)選至少在451(極低的嚴(yán)格性)、更優(yōu)選至少在50°C(低的嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在55°C(中等嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在60°C(中-高嚴(yán)格性)，甚至更優(yōu)選至少在65°C(高嚴(yán)格性)，和最優(yōu)選至少在70°C(極高的嚴(yán)格性)進(jìn)行清洗。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用0.IX33(、0.2%303，優(yōu)選至少在451(極低的嚴(yán)格性)、更優(yōu)選至少在50°C(低的嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在55°C(中等嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在60°C(中-高嚴(yán)格性)，甚至更優(yōu)選至少在65°C(高嚴(yán)格性)，和最優(yōu)選至少在70°C(極高的嚴(yán)格性)進(jìn)行清洗。就本發(fā)明而言，可以通過使用來自EMBOSS軟件包(Rice，P.，Longden,I.andBleasby,Α.(2000)EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite.TrendsinGenetics16，(6)276-277頁；http://emboss,org)第2.8.0版的Needle程序來確定兩個(gè)氨基酸序列的比對。Needle程序執(zhí)行Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中所記載的全局比對算法。所使用的取代矩陣是BL0SUM62，缺口產(chǎn)生罰分是10，而缺口延伸罰分是0.5。兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度以兩個(gè)序列比對中的精確匹配的數(shù)目除以兩個(gè)序列中最短序列的長度來計(jì)算。結(jié)果以百分比同一性表示。精確匹配在兩個(gè)序列在重疊的同一位置中具有相同氨基酸殘基時(shí)發(fā)生。序列的長度是該序列中氨基酸殘基的數(shù)目(例如SEQIDNO2的長度是248個(gè)氨基酸)。通過Wilbur-Lipman方法(Wilbur禾口Lipman,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80:726_730)使用LASERGENEMEGALIGN軟件(DNASTAR，Inc.，Madison,WI)用同一性表和以下多重比對參數(shù)來測定兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性程度缺口罰分為10，且缺口長度罰分為10。成對比對參數(shù)是Ktuple=3、缺口罰分=3、和窗口=20。核苷酸序列之間的同一性程度以兩個(gè)序列的比對中的精確匹配的數(shù)目除以兩個(gè)序列中最短序列的長度來計(jì)算。結(jié)果以百分比同一性表示。精確匹配在兩個(gè)序列在重疊的同一位置中具有相同核苷酸時(shí)發(fā)生。序列的長度是該序列中核苷酸的數(shù)目(例如SEQIDNO1的長度是744個(gè)核苷酸)。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法中所使用的微生物內(nèi)肽酶量是每kg乳清蛋白約0.01至約500AU(如下文所定義的)，優(yōu)選每kg乳清蛋白約0.1至約100AU，更優(yōu)選每kg乳清蛋白約0.5至約50AU。一個(gè)安森單位(AnsonUnit,AU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件(即25°C，pH7.5和10分鐘反應(yīng)時(shí)間)下以如下的起始速率消化血紅蛋白的酶量，所述起始速率使得每分鐘釋放的TCA可溶性產(chǎn)物的量給出與一毫當(dāng)量的酪氨酸相同的用酚試劑顯現(xiàn)的顏色。根據(jù)蛋白質(zhì)材料的來源、想要的水解程度、和水解反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間，向蛋白質(zhì)材料所添加的內(nèi)肽酶量可以且會(huì)有所變化。內(nèi)肽酶量可以在每kg蛋白質(zhì)材料約Img酶蛋白至約5000mg酶蛋白的范圍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述量可以在每kg蛋白質(zhì)材料IOmg酶蛋白至約2000mg酶蛋白的范圍。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述量可以在每kg蛋白質(zhì)材料約50mg的酶蛋白至約IOOOmg的酶蛋白的范圍。如技術(shù)人員可領(lǐng)會(huì)的，水解反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間可以且會(huì)有所變化。一般而言，水解反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間可以在少許幾分鐘至許多個(gè)小時(shí)的范圍，諸如約30分鐘至約48小時(shí)。優(yōu)選地，用微生物內(nèi)肽酶進(jìn)行的處理導(dǎo)致這樣乳清蛋白水解物，其具有約0.至約20%，更優(yōu)選約0.5%至約10%或約0.5%至約8%，甚至更優(yōu)選約1%至約5%的水解程度(DH)。水解程度(DH)表示通過該方法所獲得的蛋白質(zhì)水解的程度。在本發(fā)明的語境中，水解程度(DH)定義如下DH=(所切割的肽鍵數(shù)/肽鍵總數(shù))χ100%技術(shù)人員會(huì)知道如何測量DH。在本發(fā)明方法的步驟C)中，使內(nèi)肽酶失活?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方法來實(shí)施這種失活，例如通過加熱至至少70°C，諸如至至少75°C或至少80°C。通過本發(fā)明方法所獲得的乳清蛋白水解物可以在食品中(例如在飲料中)使用。此類食品的非限制性例子包括運(yùn)動(dòng)飲料或能量飲料。通過本發(fā)明方法所獲得的乳清蛋白水解物還可以在臨床營養(yǎng)中使用，例如在醫(yī)院中使用。實(shí)施例實(shí)施例1使用5種不同的蛋白水解酶來水解來自AriaFoods,Denmark的乳清蛋白濃縮物(Lacprodan80)(包含占總干物質(zhì)約80%的蛋白質(zhì))。酶和劑量是來自尖鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白酶，劑量為500mg酶蛋白/kg原料。PTN6.0(NovozymesA/S)，劑量為原料的0.5%0Alcalase2.4L(NovozymesA/S)，劑量為原料的0·2%。Neutrase0.8L(NovozymesA/S)，劑量為原料的1%。Protamex1.5MG(NovozymesA/S)，劑量為原料的0.5%。添加酶之前將乳清蛋白濃縮物與水(19)混合。水解在燒杯中于50°C發(fā)生，所述燒杯安裝有堿(0.INNaOH)添加劑量系統(tǒng)以將pH保持在PH7.5不變，直至水解程度(DH)=4%。將樣品加熱至85°C以使酶失活，并在感覺小組中測試。使用三個(gè)一組測試(triangletest)來比較用微生物胰蛋白酶樣蛋白酶所獲得水解物與用其它4種酶所獲得的每一種水解物。6位小組成員各接受3個(gè)編碼的樣品。他們被告知樣品中的兩個(gè)是相同的而一個(gè)是不同的。要求各位小組成員鑒別出單獨(dú)的樣品。下表中“正確答案”的數(shù)目指明能夠鑒別出單獨(dú)樣品的小組成員數(shù)。各位小組成員還被要求選出每項(xiàng)三個(gè)一組測試中苦味最小的樣品。用Alcalase、Neutrase和Protamex制備的樣品在巴斯德消毒法過程中均具有明顯的凝膠化趨勢。用PTN和微生物胰蛋白酶樣蛋白酶制備的樣品保持同質(zhì)。在味覺評估之前將樣品稀釋至3%蛋白質(zhì)含量。下文顯示了來自三個(gè)一組味覺評估的結(jié)果。MTP是來自尖鐮孢的實(shí)驗(yàn)用微生物胰蛋白酶樣蛋白酶。該評估中包括6位小組成員。如果給出至少5個(gè)正確答案(第2列)，那么認(rèn)為樣品之間的差異是顯著的。第3列和第4列是(在第2列具有正確答案的小組成員中)發(fā)現(xiàn)任一樣品具有較小苦味的小組成員的數(shù)目__正確答案__苦亨較小_試驗(yàn)1,PTN5__PTN__MTP______23.試驗(yàn)2,Alcalase4Alcalase__MTP_______2試驗(yàn)3,Neutrase2Neutrase__MTP--__1__試驗(yàn)4,Protamex3Protamex__MTP__2_1_該結(jié)果顯示了MTP和PTN生成的樣品之間有顯著性差異，其中因?yàn)镸TP生成的樣品沒有PTN生成的樣品苦，所以選擇MTP生成的樣品。MTP生成的樣品和用沒有Lys和Arg特異性的酶(Alcalase，Neutrase,Protamex)生成的任何樣品之間沒有顯示顯著性差異。實(shí)施例2使用5種不同的蛋白水解酶來水解來自L印rinoFoodS，US的乳清蛋白濃縮物(包含占總干物質(zhì)約80%的蛋白質(zhì))。酶和劑量是來自尖鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白酶，劑量為500mg酶蛋白/kg原料。PTN6.0(NovozymesA/S)，劑量0.5%的原料。Alcalase2.4L(NovozymesA/S)，劑量為原料的0.2%。Neutrase0.8L(NovozymesA/S)，劑量為原料的1%。Protamex1.5MG(NovozymesA/S)，劑量為原料的0.5%。添加酶之前將乳清蛋白濃縮物與水(19)混合。水解在燒杯中于50°C發(fā)生，所述燒杯安裝有堿(0.INNaOH)添加劑量系統(tǒng)以將pH保持在PH7.5不變，直至水解程度(DH)=4%。將樣品加熱至85°C以使酶失活，并在感覺小組中測試。使用三個(gè)一組測試來比較用微生物胰蛋白酶樣蛋白酶所獲得水解物與用其它4種酶所獲得的每一種水解物。7位小組成員各接受3個(gè)編碼的樣品。他們被告知樣品中的兩個(gè)是相同的而一個(gè)是不同的。要求各位小組成員鑒別出單獨(dú)的樣品。下表中“正確答案”的數(shù)目指明能夠鑒別出單獨(dú)的樣品的小組成員數(shù)。各位小組成員還被要求選出每項(xiàng)三個(gè)一組測試中苦味最小的樣品。所有樣品在巴斯德消毒法期間/之后均保持同質(zhì)。在味覺評估之前將樣品稀釋至3%蛋白質(zhì)含量。下文顯示了來自三個(gè)一組味覺評估的結(jié)果。MTP是來自尖鐮孢的實(shí)驗(yàn)用微生物胰蛋白酶樣蛋白酶。該評估中包括7位小組成員。如果給出至少5個(gè)正確答案(第2列)，那么認(rèn)為樣品之間的差異是顯著的。第3列和第4列是(在第2列具有正確答案的小組成員中)發(fā)現(xiàn)任一樣品具有較小的苦味的小組成員數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>該結(jié)果顯示了用MTP生成的樣品和用Alcalase或PTN生成的樣品之間有顯著性差異，其中因?yàn)镸TP生成的樣品沒有Alcalase和PTN生成的兩種樣品苦，所以選擇MTP生成的樣品。實(shí)施例3胰蛋白酶比率的定義、測量和計(jì)算Mfi為了進(jìn)行可測量的測定法以測定胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶活性，我們使用了10種具有通式Suc-AAPX-pNA的不同顯色底物，在所述通式Suc-AAPX-pNA中X是20種天然氨基酸殘基之一的單字母縮寫。該內(nèi)肽酶會(huì)在X的羧基端一側(cè)進(jìn)行切割，并釋放可以被測量的黃色(對硝基苯胺)。我們使用了可從Bachem獲得的這10種不同Suc-AAPX-pNA底物(X=A、R、D、E、I、L、K、M、F和V)以進(jìn)行我們所稱的胰蛋白酶比率的測量和計(jì)算。胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶在本發(fā)明的語境中可定義為具有大于100的胰蛋白酶比率的內(nèi)肽酶。胰蛋白酶比率以對Suc-AAPR-pNA或Suc_AAPK-pNA的最大活性除以對8種其它Suc-AAPX-pNA底物之任一種的最大活性來計(jì)算胰蛋白酶比率=對Suc-AAP(R/K)-pNA的最大活性/對Suc-AAP(非R/K)-pNA的最大活性應(yīng)當(dāng)在如下pH值進(jìn)行活性測量，其中在所述PH值的活性至少是在最適pH的活性的一半。材料和方法Suc-AAPX-pNA測定法底物Suc-AAPA-pNA(BachemL-1775)Suc-AAPR-pNA(BachemL-1720)Suc-AAPD-pNA(BachemL-1835)Suc-AAPE-pNA(BachemL-1710)Suc-AAPI-pNA(BachemL—1790)Suc-AAPL-pNA(BachemL-1390)Suc-AAPK-pNA(BachemL-1725)Suc-AAPM-pNA(BachemL—1395)Suc-AAPF-pNA(BachemL-1400)Suc-AAPV-pNA(BachemL-1770)溫度室溫(25°C)測定緩沖液100mM琥珀酸、IOOmMHEPESUOOmMCHESUOOmMCABSUmMCaCl2,150mMKCUO.01%TritonX-100，pH9.0。測定法將20ul(微升)肽酶稀釋物(在0.01%TritonX-100中稀釋)置于微量滴定板的孔中。通過添加200ulpNA底物(50mg在1.0mlDMSO中溶解，并用測定緩沖液進(jìn)一步稀釋90x)來開始該測定法。監(jiān)測OD4tl5的起始增加，作為對肽酶活性的測量。若在4分鐘測量時(shí)間中沒有實(shí)現(xiàn)線性(或接近線性)的曲線，則進(jìn)一步稀釋肽酶，并重復(fù)該測定法。肽酶Alcalase(NovozymesA/S,Denmark)水解無色桿菌賴氨酰_內(nèi)肽酶(SEQIDNO4)來自尖鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白酶豬胰蛋白酶(NovozymesA/S,Denmark)通過層析將所有的酶純化至高純度。在經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠上針對每種肽酶僅看到一條條帶。肽酶的特征Alcalase對Suc—AAPF—pNA的pH最佳=pH9。水解無色桿菌蛋白酶對Suc-AAPK-pNA的pH最佳=pH10。鐮孢屬胰蛋白酶樣蛋白酶對Boc-VLGR-pNA的pH最佳=pH10。豬胰蛋白酶對Boc-VLGR-pNA的pH最佳=pH10。MM肽酶在pH9對Suc-AAPX-pNA底物的特異性和胰蛋白酶比率的計(jì)算在pH9實(shí)施特異性實(shí)驗(yàn)。如在材料和方法段落中所看到的，3種測試的肽酶具有ρΗΛβ>pH9。然而，對于這3種肽酶，在pH9的活性大于在活性的一半。在下表中顯示了該結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>可以看出，依照我們的定義，水解無色桿菌蛋白酶、鐮孢屬胰蛋白酶樣蛋白酶和豬胰蛋白酶是胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶。而Alcalase不是胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶。權(quán)利要求一種用于生成乳清蛋白水解物的方法，包括a)提供包含β-乳球蛋白和α-乳清蛋白的乳清蛋白的水性組合物；b)使所述組合物受到在精氨酸或賴氨酸的羧基端一側(cè)進(jìn)行特異性切割的微生物內(nèi)肽酶的作用；c)使所述內(nèi)肽酶失活。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物內(nèi)肽酶是真菌內(nèi)肽酶。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述真菌內(nèi)肽酶源自鐮孢屬菌株。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述真菌內(nèi)肽酶源自尖鐮孢菌株。5.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)肽酶在PH約8至約10具有最佳的蛋白水解活性。6.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)肽酶在約45°C至約60°C的溫度具有最佳的蛋白水解活性。7.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)肽酶選自下組i)多肽，其具有與(A)SEQIDNO:2、4、6或8中任一，或⑶這些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段至少60%相同的氨基酸序列；ii)多肽，其由與SEQIDNO:1、3、5或7中任一至少60%相同的多核苷酸編碼；iii)多肽，其由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸的補(bǔ)體在低嚴(yán)格性條件下與SEQIDNO:1、3、5或7中任一雜交；和iv)多肽，其具有通過在(A)SEQIDN0:2、4、6或8中任一，或⑶這些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段中取代、缺失、和/或插入一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而修飾的氨基酸序列。8.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)肽酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸25-248至少60%相同的氨基酸序列。9.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述乳清蛋白是乳清蛋白濃縮物或乳清蛋白分離物。10.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述乳清蛋白的水溶液包含占總干物質(zhì)至少5%的α-乳清蛋白。11.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述乳清蛋白水解物具有約0.至約20%的水解程度。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述乳清蛋白水解物具有約0.5%至約8%的水解程度。13.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)包括加熱至至少70°C。14.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)肽酶以每kg乳清蛋白0.Ol-IOg酶蛋白的濃度添加。15.通過上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法所獲得的乳清蛋白水解物在臨床營養(yǎng)中的用途。16.通過權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法所獲得的乳清蛋白水解物在運(yùn)動(dòng)飲料中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種使用在精氨酸或賴氨酸的羧基端一側(cè)特異性切割的微生物內(nèi)肽酶來生成乳清蛋白水解物的方法。本發(fā)明還涉及此乳清蛋白水解物在運(yùn)動(dòng)飲料或臨床營養(yǎng)中的用途。文檔編號A23J3/34GK101801209SQ200880012256公開日2010年8月11日申請日期2008年4月16日優(yōu)先權(quán)日2007年4月16日發(fā)明者吉特·B·林雷夫,珀·M·尼爾森申請人:諾維信公司