專利名稱:蛋白酶體激活性增亮肽水解產(chǎn)物和含有它們的組合物的制作方法
蛋白酶體激活性增亮肽水解產(chǎn)物和含有它們的組合物本發(fā)明涉及除色素活性成分領(lǐng)域以及特別是它們?cè)诨瘖y品中的用途。更具體地, 本發(fā)明涉及富含生物活性肽的肽水解產(chǎn)物,所述水解產(chǎn)物是蛋白酶體激活劑,以及涉及其在化妝品和/或制藥中作為增亮劑、除色素劑和/或增白劑的用途。所述水解產(chǎn)物也使得能夠預(yù)防和/或治療因光老化而產(chǎn)生的色素沉著過多性質(zhì)的皮膚跡象、以及不同來源的色素沉著過多的瑕疵。在人類中,毛發(fā)和皮膚的顏色與個(gè)體因素(種族來源、性別、年齡等)及環(huán)境因素 (特別是季節(jié)、生活區(qū)域等)相關(guān)聯(lián)。其主要由黑素細(xì)胞產(chǎn)生的黑色素的性質(zhì)和濃度來決定。黑色素具有保護(hù)皮膚細(xì)胞免受UV輻射損害作用并延緩皮膚光老化的特性。黑素細(xì)胞是特化的細(xì)胞,其通過稱為黑素體的特定細(xì)胞器合成黑色素。黑色素合成、或黑素生成是復(fù)雜的過程,其精確的機(jī)制仍未被弄清楚,其圖示化地涉及以下步驟酪氨酸一多巴一多巴醌一多巴色素一黑色素。此黑色素事實(shí)上在決定皮膚顏色中起了基本所用。黑色素是由大的樹突狀細(xì)胞合成的黑素細(xì)胞,位于表皮基底層的細(xì)胞。黑色素以兩種不同的形式存在褐黑素,黃色的色素;和真黑素,黑色的色素。正是這些色素的不同比例和大小,還有胡蘿卜素和血液微循環(huán),賦予了皮膚其很大的顏色多樣性。黑色素的產(chǎn)生及其轉(zhuǎn)移是通過不同因素調(diào)節(jié)的,諸如UV輻射、激素或化學(xué)產(chǎn)物。 因此,UV輻射暴露的增加引起色素的合成并導(dǎo)致皮膚變深。會(huì)出現(xiàn)此色素形成中的失調(diào) (或多或少是良性的)。這些失調(diào)表現(xiàn)為例如雀斑、美人斑、彌漫性瑕疵諸如妊娠斑、黃褐斑和黑斑病、以及其它色素沉著過多疾病如雀斑痣。其它色素沉著過多瑕疵可以是由于例如不良的瘢痕形成,尤其在具有深色表型的個(gè)體中,或者其也可以是由于使用光敏性的藥物等。但老化本身也可調(diào)節(jié)皮膚色素沉著。因此,一些人皮膚上中可出現(xiàn)斑點(diǎn),其或多或少深色的或有色的,造成異質(zhì)著色區(qū)形成老年斑或雀斑。最后,在一些亞洲或非洲群體中,需要增亮化妝治療以獲得純凈和均勻的膚色。因此,黑色素合成抑制劑或調(diào)節(jié)劑以及任何其它脫色素和/或增白產(chǎn)品的用途, 在美容學(xué)和/或皮膚病學(xué)中受到特別關(guān)注。此用途不僅僅是在真皮膚有脫色素的需求時(shí)被關(guān)注,正如增白高度色素沉著的皮膚的情形或者抑制導(dǎo)致難看皮膚表象的色素沉著過度皮膚區(qū)的情形;其在某些致力于增亮膚色以賦予皮膚光亮度或賦予表面組織光澤的應(yīng)用中也受到關(guān)注。至今,提出了許多或多或少有效的分子。在這些分子中,可以引用的有酚衍生物諸如氫醌和間苯二酚,其通過抑制酪氨酸酶活性來抑制L-酪氨酸轉(zhuǎn)化成黑色素的一系列反應(yīng)(Takano,1984)。還可以引用的有L-抗壞血酸及其衍生物、抗壞血酸基醋酸鎂、曲酸或乳酸。但目前市場(chǎng)上的大多產(chǎn)品是有毒性的和/或不表現(xiàn)出足夠的功效。例如,氫醌對(duì)黑素細(xì)胞有刺激性和有細(xì)胞毒性的。例如曲酸在溶液中不穩(wěn)定等等。因此有需要有新的增白劑,其不表現(xiàn)出現(xiàn)有藥劑的缺點(diǎn)但卻一樣有效。這就是為何需要探索其它途徑,以發(fā)現(xiàn)作用于酪氨酸酶和黑色素的新脫色素劑。
4
令人吃驚地,申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)了富含生物活性肽的肽水解產(chǎn)物,所述水解產(chǎn)物是蛋白酶體激活劑,可被用作增白劑并表現(xiàn)出良好的脫色素活性,且并不必然具有毒性。泛素-蛋白酶體途徑在大量的生物學(xué)過程中起基本作用。事實(shí)上,蛋白通過蛋白酶體的降解機(jī)制中涉及重要的細(xì)胞機(jī)制,諸如DNA修、基因表達(dá)控制、細(xì)胞周期進(jìn)展調(diào)節(jié)、 新合成蛋白質(zhì)量控制、凋亡或免疫應(yīng)答(Glickman and Ciechanover,2002)。人細(xì)胞中存在的蛋白酶體是存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的大尺寸多蛋白復(fù)合物。純化形式的蛋白酶體包含2個(gè)大的亞基一方面是被稱為20S蛋白酶體的蛋白水解核,另一方面是結(jié)合至20S蛋白酶體兩端的19S調(diào)節(jié)復(fù)合物(Coux et al.,1996 ;Glickman and Coux, 2001)。20S蛋白酶體是中空?qǐng)A柱體形的顆粒,由觀個(gè)α和β亞基組成,分布在4個(gè)七元環(huán)中。肽酶活性存在于圓柱體內(nèi)表面并且變構(gòu)地相互影響。三種蛋白水解活性(“胰蛋白酶、糜蛋白酶和半胱天冬蛋白樣酶”)與20S蛋白酶體相關(guān),并幫助將蛋白破壞成含有3到 20個(gè)氨基酸的無活性肽。在20S蛋白酶體之外,26S蛋白酶體包含由大約20個(gè)亞基構(gòu)成的 0. 7MDa的19S調(diào)節(jié)復(fù)合物。最近的免疫純化研究顯示,其它蛋白可以與20S和19S蛋白酶體結(jié)合(例如lis調(diào)節(jié)復(fù)合物)??紤]到由蛋白降解所控制的細(xì)胞過程的多樣性,發(fā)現(xiàn)泛素-蛋白酶體途徑的改變是一些遺傳疾病和許多人類病理的根源或與其緊密相連并不令人意外,諸如結(jié)腸直腸癌、 淋巴瘤、炎癥反應(yīng)綜合癥、或神經(jīng)退行性疾病如帕金森病或阿爾茨海默病。近些年來完成了對(duì)于蛋白酶體在皮膚老化中作用的許多工作。最近所探索的一條途徑是蛋白酶體及其對(duì)涉及黑素生成蛋白的降解作用。實(shí)驗(yàn)顯示,在人的黑素細(xì)胞中, 由藻類提取物激活蛋白酶體對(duì)酪氨酸酶的降解(Bulteau et al. Antioxid. Redox Signal ; 2006,1-2 :136-143)。專利申請(qǐng)(US 12/088.919)中公開了能夠增加蛋白酶體活性并對(duì)皮膚色素沉著有效果的組合物,其包含水飛薊素、白及和溪蓀(Iris sanguinea)的提取物。這就是申請(qǐng)人如何發(fā)現(xiàn)富含生物活性肽的肽水解產(chǎn)物能夠激活蛋白酶體并因而可以對(duì)皮膚和上皮附屬物進(jìn)行脫色素、增亮甚或增白。因此,本發(fā)明的首個(gè)目標(biāo)是蛋白酶體激活性的肽水解產(chǎn)物,富含生物活性肽,所述生物活性肽有小于6kDa的分子量,包含3到5個(gè)氨基酸,每種生物活性肽包含至少一個(gè)天冬氨酸殘基、一個(gè)半胱氨酸殘基和一個(gè)精氨酸殘基。本發(fā)明的第二個(gè)目標(biāo)是化妝品組合物,其包含所述富集的肽水解產(chǎn)物作為活性成分。此外,本發(fā)明的第三個(gè)目標(biāo)是包含所述肽水解產(chǎn)物的化妝品組合物的用途,其用于改善蛋白酶體對(duì)損壞的蛋白的降解并由此對(duì)皮膚和/或上皮附屬物進(jìn)行脫色素,以及預(yù)防和/或治療色素沉著過多的瑕疵。最后,本發(fā)明的第四個(gè)目標(biāo)是對(duì)于要使用所述富含肽水解產(chǎn)物的組合物進(jìn)行治療的皮膚或上皮附屬物的化妝治療方法。附
圖1顯示了通過HPLC獲得的色譜圖的例子,展示出相應(yīng)于玉米水解產(chǎn)物中的生物活性肽的峰。附圖2顯示了通過HPLC獲得的色譜圖的例子,展示出相應(yīng)于豌豆水解產(chǎn)物中的生物活性肽的峰。
附圖3顯示了通過HPLC獲得的色譜圖的例子,展示出相應(yīng)于水稻水解產(chǎn)物中的生物活性肽的峰。附圖4顯示了通過HPLC獲得的色譜圖的例子,展示出相應(yīng)于釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)水解產(chǎn)物中的生物活性肽的峰。本發(fā)明的首個(gè)目標(biāo)是蛋白酶體激活性的肽水解產(chǎn)物,富含多種生物活性肽,所述生物活性肽有小于6kDa的分子量,包含3到5個(gè)氨基酸,每種生物活性肽包含至少一個(gè)天冬氨酸殘基、一個(gè)半胱氨酸殘基和一個(gè)精氨酸殘基。“肽水解產(chǎn)物”理解為是指主要由肽或寡肽所代表的化合物的混合物。“生物活性肽”理解為是指由經(jīng)修飾或未修飾的肽鍵互相連接的至少3個(gè)氨基酸的連接所組成的蛋白片段,并且其呈現(xiàn)出作為蛋白酶體激活劑的活性。其以非活性形式存在于蛋白中,并在蛋白水解后變成有活性。本發(fā)明的所述富集的肽水解產(chǎn)物特征在于,其是蛋白酶體激活劑。“蛋白酶體激活性”肽水解產(chǎn)物(和/或生物活性肽)理解為是指任何具有生物學(xué)活性的肽水解產(chǎn)物或肽或衍生物,其能夠提高蛋白酶體的活性,這是通過增加蛋白酶體亞基的蛋白合成(通過直接或間接調(diào)控基因表達(dá)),或者是通過其它生物過程如使得構(gòu)成蛋白酶體的亞基穩(wěn)定或者使RNA信使轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定。本發(fā)明富集的肽水解產(chǎn)物特征在于,其激活蛋白酶體對(duì)損壞的蛋白的降解?!皳p壞的蛋白”理解為是指因活性氧(自由基)而經(jīng)氧化反應(yīng)的蛋白、由脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生的產(chǎn)物所糖化或偶聯(lián)的蛋白等。優(yōu)選地,肽水解產(chǎn)物富集了具有通式(I)的生物活性肽
X1- [Asp, Cys, Arg] -X2其中X1是天冬酰胺、賴氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、精氨酸或不存在X2是組氨酸、賴氨酸、精氨酸或不存在優(yōu)選地,肽水解產(chǎn)物富含具有下式的生物活性肽(SEQ ID No. 1)Arg-Asp-Cys-Arg-Arg(SEQ ID No. 2)Asn-Asp-Cys-Arg-Lys(SEQ ID No. 3)Asp-Cys-Arg-His(SEQ ID No. 4)Val-Asp-Cys-Arg(SEQ ID No. 5)Asp-Cys-Arg事實(shí)上,這些肽已被鑒定為特別具有作為蛋白酶體激活劑的活性,并由此作為增亮劑而受到特別關(guān)注。本發(fā)明的富集的肽水解產(chǎn)物可從各種蛋白來源獲得,不論動(dòng)物或植物來源。根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案,富集的肽水解產(chǎn)物來自于植物的水解,所述植物選自玉米(Zea mayz L.)、豌豆(Pisum sativum)、或水稻(Oryza sativa L.)。優(yōu)選所使用的植物此前未經(jīng)發(fā)酵。在第二個(gè)實(shí)施方案中,富集的肽水解產(chǎn)物來自酵母屬(Saccharomyces)酵母的水解,更具體地是來自釀酒酵母種的水解。因此,本發(fā)明可通過使用來自玉蜀黍?qū)俚亩喾N植物中的一種的種子來進(jìn)行,優(yōu)選玉米。依照本發(fā)明,所使用的植物原料是種子,并且優(yōu)選種子的外殼已經(jīng)通過去殼步驟而去除。本發(fā)明也可通過使用豌豆科(豆科Fabaceae)的許多植物中的一種來進(jìn)行。例如,可使用豌豆種的植物豌豆(Pisum sativum L)。術(shù)語豌豆也表示種子,其自身富含蛋白 (25% )。來自水稻科(禾本科Poaceae)、特別是來自稻屬(Oryza)、更優(yōu)選的是水稻(Oryza sativa L)種的植物可被使用來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的水解產(chǎn)物。所使用的植物原料是種子,并且優(yōu)選種子的外殼已經(jīng)通過去殼步驟而去除。最后,本發(fā)明也可通過使用酵母屬的酵母來進(jìn)行,并優(yōu)選地是釀酒酵母種的酵母。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于提取或純化的方法,均可被使用以制備本發(fā)明的水解產(chǎn)物。在第一個(gè)步驟中,使用植物研磨機(jī)將種子或植物的特定部分(葉、塊莖、根等)研磨。由此獲得的粉末可隨后使用常規(guī)的有機(jī)溶劑(例如酒精、己烷或丙酮)而進(jìn)行去脂化。對(duì)酵母,在第一個(gè)步驟中,將酵母在適合于其發(fā)育的培養(yǎng)基中以常規(guī)方式培養(yǎng),優(yōu)選是有乳糖存在。酵母通過離心收獲,并接著懸浮于緩沖液中,優(yōu)選磷酸鹽緩沖液。在第二個(gè)步驟中,用弗氏細(xì)胞壓碎器(French press)或球型研磨器來使細(xì)胞破裂,大部分不可溶的膜組分通過離心或過濾而除去。然后,依照修改過的常規(guī)方法(Osborne,1924)來提取蛋白;將植物研磨過的原料或酵母溶解產(chǎn)物懸浮于含有不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)類型(0.01-20%)吸附產(chǎn)物的堿性溶液中;事實(shí)上,發(fā)現(xiàn)此方法可以促進(jìn)隨后的水解和純化操作。特別是與蛋白相互作用的苯酚型物質(zhì)的濃度顯著降低。在離心和過濾步驟之后,收集含有蛋白、碳水化合物和可能的脂類的可溶性部分。 隨后將此粗溶液在受控條件下水解以產(chǎn)生可溶性肽。水解被定義為涉及通過水切割分子的化學(xué)反應(yīng),此反應(yīng)可在中性、酸性或堿性介質(zhì)中完成。依照本發(fā)明,水解是通過化學(xué)方式和/ 或有利地使用蛋白水解酶來進(jìn)行。可引用的有使用植物來源的內(nèi)切蛋白酶(木瓜蛋白酶、 波羅蛋白酶、無花果蛋白酶)和微生物(曲霉Aspergillus、根霉lihizopus、桿菌kicillus 等)。選擇水解條件,以促進(jìn)生物活性肽的富集?;谏鲜鐾瑯拥脑?,即消除多酚類物質(zhì),將一定量的聚乙烯聚吡咯烷酮在此受控的水解步驟中加入到反應(yīng)介質(zhì)中。過濾后,將酶和多聚物除去,獲得首份濾液。此階段獲得的水解產(chǎn)物可再次純化以選擇低分子量的部分,優(yōu)選小于6kDa的部分,且肽依其性質(zhì)而產(chǎn)生。為了特異地富集水解產(chǎn)物中的生物活性肽,可以通過在孔隙率遞減的過濾器中經(jīng)連續(xù)的超濾步驟而有利地進(jìn)行純化,這是通過保留每一步的濾液和/或通過色譜類型的方法。然后本發(fā)明在水中或任何含有水的混合物中的進(jìn)行稀釋階段,并隨后通過超濾滅菌以獲得富集的肽水解產(chǎn)物,其特征在于蛋白含量為0. 5至5. 5g/l。此富集的肽水解產(chǎn)物相應(yīng)于本發(fā)明活性成分最純化的形式。依照本發(fā)明獲得的肽水解產(chǎn)物在高效液相色譜(HPLC)中進(jìn)行定量和定性分析, 使得能夠分析分子量為0.2至25kDa的蛋白(依照合適的溶劑梯度)。隨后分析能被分離的不同肽部分的生物效能。接著通過質(zhì)譜分析這些不同的部分,以特異地從每個(gè)峰鑒定肽的氨基酸含量。也進(jìn)行了序列分析,以確定生物活性肽的肽序列。
最后,所獲得的富集的肽水解產(chǎn)物由分子量小于6kDa的肽組成,并富含具有3到 5個(gè)氨基酸的生物活性肽,包含至少一個(gè)天冬氨酸殘基、一個(gè)半胱氨酸殘基和一個(gè)精氨酸殘基。依照本發(fā)明的此肽水解產(chǎn)物,富含生物活性肽,也可被用作藥物。本發(fā)明的第二個(gè)目標(biāo)涉及化妝組合物,其包含如前所述的富含生物活性肽的肽水解產(chǎn)物作為活性成分。優(yōu)選地,本發(fā)明的組合物以包含化妝可接受介質(zhì)的適于局部使用的形式存在?!盎瘖y可接受”理解為是指介質(zhì)適用于與皮膚或人的上皮附屬物接觸,沒有毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、過敏反應(yīng)或其它副作用的風(fēng)險(xiǎn)。優(yōu)選所述肽水解產(chǎn)物在組合物中以占組合物總重量0. 0001%到20 %的量存在,優(yōu)選以占組合物總重量0. 05 %到5 %的量存在。在本發(fā)明的組合物中,將富含生物活性肽的肽水解產(chǎn)物溶解于一種或多種溶劑中,如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一縮二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、環(huán)多元醇、白凡士林、植物油、或這些溶劑的任意混合物。按照另一有利的實(shí)施方案,將本發(fā)明的肽水解產(chǎn)物溶解在化妝或藥物載體如脂質(zhì)體中,或?qū)⑵湮街练勰钣袡C(jī)多聚物、礦物質(zhì)支持物如華視和皂粘土上,而更常見的是溶解于或固定至任何生理可接受的載體。要應(yīng)用于皮膚的組合物可以如下形式存在,水或水醇溶液、油包水乳劑或水包油乳劑、微乳劑、含水或無水凝膠、漿液、囊泡分散物、貼片、乳霜、噴霧、軟膏、潤(rùn)發(fā)油、洗劑、膠體、溶液、懸浮液或其它形式。組合物也可以洗發(fā)劑、染發(fā)劑或要用刷子或梳子應(yīng)用的睫毛膏的形式而應(yīng)用于上皮附屬物,尤其是睫毛、眉毛或毛發(fā)上,或指甲的處理如指甲油。在特定實(shí)施方案中,本發(fā)明的組合物還含有促進(jìn)所述富集的肽水解產(chǎn)物作用的至少一種其它活性成分??梢苑窍拗菩缘姆绞揭玫挠校谠隽羷┓矫嬲宫F(xiàn)出活性的成分類別如脫屑劑(desquamant agent);撫慰劑,有機(jī)或無機(jī)的光保護(hù)劑;增濕劑;其它脫色素劑;酪氨酸酶抑制劑;刺激皮膚或表皮大分子合成和/或預(yù)防其降解的物質(zhì);刺激成纖維細(xì)胞和/或角化細(xì)胞增殖或刺激角化細(xì)胞分化的物質(zhì);作用于細(xì)胞能量代謝的物質(zhì);其它脫色素肽、植物水解產(chǎn)物、抗老化劑,以及它們的混合物。此外,還可將添加劑加入到組合物中,如增稠劑、乳化劑、濕潤(rùn)劑、潤(rùn)滑劑、芳香劑、抗氧化劑、成膜劑、螯合劑、多價(jià)螯合劑、調(diào)節(jié)劑等。在所有情況下,本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)挑選這些佐劑以及它們的比例,以確保不會(huì)損害本發(fā)明組合物所期待的優(yōu)勢(shì)特性。例如,這些佐劑可占組合物總重量的0. 01%到20%。 當(dāng)本發(fā)明的組合物是乳劑時(shí),脂相可占組合物總重量的5%到80%,優(yōu)選占組合物總重量的5%到50%。組合物中使用的乳化劑和輔-乳化劑可選自本領(lǐng)域中常規(guī)使用的那些。例如,它們可以組合物總重量的0. 3%到30%來使用。最后,所述的組合物使得能增加蛋白酶體活性以及改善蛋白酶體對(duì)涉及黑素生成的損壞蛋白的降解。本發(fā)明的第三個(gè)目標(biāo)涉及包含所述富集的肽水解產(chǎn)物和化妝可接受介質(zhì)的化妝組合物的用途,其用于對(duì)皮膚進(jìn)行脫色素、增亮和/或增白。本發(fā)明的組合物還預(yù)防和/或治療色素沉著過多的瑕疵諸如黑斑病、黃褐斑、光化性雀斑樣痣、日光性雀斑樣痣、雀斑、意外性色素沉著過多瑕疵和瘢痕形成后色素沉著過多瑕疵。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)涉及含所述肽化合物的組合物的用途,其用于治療和/或預(yù)防因光老化而引起的色素沉著性質(zhì)的皮膚跡象?!肮饫匣崩斫鉃槭侵敢蜷L(zhǎng)期的和累積的陽光照射而引起的皮膚過早老化。最后,本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是本發(fā)明的化妝組合物的用途,其用于增加蛋白酶體的活性,并改善蛋白酶體對(duì)涉及黑素生成的受損蛋白的降解。本發(fā)明最后的目標(biāo)涉及化妝治療的方法,其特征在于將含有有效量的本發(fā)明肽水解產(chǎn)物的組合物局部應(yīng)用于要進(jìn)行治療的皮膚或上皮附屬物,以對(duì)皮膚或上皮附屬物進(jìn)行脫色素、增亮和/或增白。此外,此化妝治療方法也會(huì)預(yù)防和/或治療因光老化而引起的色素沉著過多性質(zhì)的皮膚跡象。以下實(shí)施例描述并證明了本發(fā)明所述的肽化合物的有效性,但不應(yīng)被理解為是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 從玉米胚餅(Zea mays L.)中制備肽水解產(chǎn)物將玉米胚餅(Zea mays L.)在存在2 % P0LYCLAR 10 (聚乙烯吡咯烷酮-PCPP-不可溶)的情況下于10體積的水中置入溶液。使用IM氫氧化鈉水溶液將混合物PH至6-8 之間。調(diào)節(jié)pH后,將2%的木瓜蛋白酶加到反應(yīng)介質(zhì)中。在55°C攪拌2小時(shí)后獲得水解。 隨后通過加熱溶液到80°C,2小時(shí)而將酶滅活。離心后,回收上清的水溶液,相當(dāng)于玉米粗水解產(chǎn)物。選擇特定的水解條件,使得能夠富集含有3到5個(gè)氨基酸包含至少一個(gè)天冬氨酸殘基、一個(gè)半胱氨酸殘基和一個(gè)精氨酸殘基的生物活性肽。粗水解產(chǎn)物純化的過程始于使用孔隙率遞降(到0. 2 μ m)的kitz-Orion過濾板的成功過濾,以獲得透明和澄清的黃色溶液,稱為水解產(chǎn)物1。在這一步,玉米水解產(chǎn)物1的特征在于固體殘余物測(cè)定在20到30g/kg,蛋白水平為20到25g/l和糖水平為2-5g/l。水解產(chǎn)物1的蛋白性質(zhì)在預(yù)置聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen) 電泳分析后被展示。玉米蛋白水解產(chǎn)物在NuPAGE LDS樣品制備緩沖液的還原變性條件下被加熱到70°C,10分鐘。蛋白遷移在NuPAGE MES遷移緩沖液中使用標(biāo)準(zhǔn)的keBlue Plus2作為分子量標(biāo)記完成。蛋白染色通過使用Coomassie Blue R-250完成。在這些條件下,觀察到獲得的蛋白具有小于6kDa的分子量。水解產(chǎn)物1隨后通過使用Pellicon 2 Biomax 5kDa盒超濾去除高分子量蛋白而進(jìn)行純化,以僅保留小于5kDa的肽性質(zhì)的化合物。在此終純化后,完成稀釋階段以獲得肽水解產(chǎn)物,其特征在于蛋白水平在3. 5到 5. 5g/l間。此富含生物活性肽的肽水解產(chǎn)物相應(yīng)于本發(fā)明的活性成分。此肽水解產(chǎn)物隨后通過使用Chen^tation軟件運(yùn)行HP 1100部件的高效液相色譜 (HPLC)來進(jìn)行分析。水解產(chǎn)物洗脫期間使用的柱子是Nucleosil 300-5 C4 MPN(125x4mm) 柱,能使分子量在0. 2到25kDa間的蛋白在以下條件下被色譜分析-甲醇梯度-Uptisphere OPB 125x3mm 柱-溶劑A含有0. 1 %七氟丁酸(HFBA)的HPLC級(jí)水)的HPLC級(jí)甲醇-梯度35分鐘內(nèi)溶劑A從100%到15%。通過HPLC(高效液相色譜)獲得的色譜圖的例子,具有相當(dāng)于生物活性肽峰的展示,在附圖1中給出。這些不同的部分隨后通過質(zhì)譜被分析,以特異地鑒定每個(gè)峰的肽的氨基酸含量。 也完成了序列分析以確定生物活性肽的肽序列。實(shí)施例2:從豌豆(Pisum sativum L.)中制備富含牛物活件肽的肽水解產(chǎn)物肽水解產(chǎn)物從豌豆種的植物提取物中獲得。顯然,提取物可以從至少任何一種屬于豌豆屬的眾多品種和物種的植物中制備。在第一步中,Ikg去殼的豌豆通過有機(jī)溶劑己烷的作用而被去脂。如此獲得的豌豆粉被置于10體積的含2 % POLYCLAR 10 (聚乙烯吡咯烷酮-PCPP-不可溶)的水中?;旌衔锸褂肐M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)PH至6到7間。調(diào)節(jié)pH后,2%的flavourzym 被加到反應(yīng)介質(zhì)中。在50°C攪拌2小時(shí)后獲得水解。隨后通過加熱溶液到80°C,2小時(shí)而將酶滅活。如此獲得的反應(yīng)混合物相當(dāng)于豌豆提取物。選擇特定的水解條件,以使得能富集含有3到5個(gè)氨基酸包含至少一個(gè)天冬氨酸殘基、一個(gè)半胱氨酸殘基和一個(gè)精氨酸殘基的生物活性肽。純化過程始于使用孔隙率遞降(到0. 2 μ m)的kitz-Orion過濾板的成功過濾, 以獲得透明和澄清的溶液。在這一步,豌豆水解產(chǎn)物的特征在于固體殘余物測(cè)定在70-80g/ kg,蛋白水平為55-65g/l,糖水平為2-5g/l和多酚水平為l_3g/l。此水解產(chǎn)物的蛋白性質(zhì)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳而展示。對(duì)于此分析,使用 NuPAGE Bis-Tris預(yù)置膠(Invitrogen)。豌豆蛋白水解產(chǎn)物在NuPAGE LDS樣品制備緩沖液的還原變性條件下被加熱到70°C,10分鐘。蛋白遷移通過在NuPAGE MES遷移緩沖液中使用標(biāo)準(zhǔn)的keBlue Plus2作為分子量標(biāo)記而完成。蛋白染色通過使用Coomassie Blue R-250完成。在這些條件下,2個(gè)大的蛋白家族被觀察到第一家族相當(dāng)于分子量從 20到25kDa的蛋白,后一家族是分子量小于5kDa的蛋白。此溶液隨后通過使用正切流動(dòng)過濾,排除分子量大于5kDa的蛋白而進(jìn)行純化。為此,豌豆水解產(chǎn)物在壓力下被泵入裝備有Pellicon 2Biomax30kDa盒的Pellicon 支持物。此第一濾液被回收以隨后通過另一 Pellicon 2BiomaX 5kDa盒來過濾。純化后,獲得透明和澄清的米黃色豌豆肽水解產(chǎn)物。其特征在于固體殘余物為50到55g/kg,蛋白含量為 50 到 52g/l。此溶液隨后通過使用Chen^tation軟件運(yùn)行HP 1100部件的高效液相色譜(HPLC) 來分析。豌豆提取物洗脫期間使用的柱子是Nucleosil 300-5 C4MPN(125x4mm)柱。此柱能使分子量為0. 2到25kDa的蛋白被色譜分析(依照合適的溶劑梯度,與實(shí)施例1 一致)。 在這些層析分析條件下,幾個(gè)肽部分能被分離。這些不同的部分隨后通過質(zhì)譜來分析,以特異地鑒定每個(gè)峰的肽的氨基酸含量。 還完成了序列分析以確定生物活性肽的肽序列。通過HPLC(高效液相色譜)獲得的色譜圖的例子,具有相應(yīng)于生物活性肽峰的展示,在附圖2中給出。還完成了本發(fā)明的活性成分的氨基酸組成的確定。它在酸水解后被實(shí)現(xiàn)并通過使用PICT(異硫氰酸苯酯)前衍生化的高效液相色譜來鑒定。
10
實(shí)施例3 從釀酒酵母中制備富含牛物活件肽的肽水解產(chǎn)物肽水解產(chǎn)物可從釀酒酵母種的酵母提取物中獲得。酵母被培養(yǎng)在適合它們生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中,優(yōu)選存在乳酸,并隨后被離心,以回收生物質(zhì)。酵母生物質(zhì)被置于10體積的含 2% P0LYCLAR 10 (聚乙烯吡咯烷酮-PCPP-不可溶)和0. 2%活性炭的水中。混合物使用 IM氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至6到7. 5間。調(diào)節(jié)PH后,將2 %的木瓜蛋白酶加到反應(yīng)介質(zhì)中。在55 °C攪拌2小時(shí)后獲得水解。 隨后通過加熱溶液到80°C,2小時(shí)而將酶滅活。離心后,隨后獲得反應(yīng)混合物,相當(dāng)于酵母提取物。選擇特定的水解條件,以使得能富集含有3到5個(gè)氨基酸包含至少一個(gè)天冬氨酸殘基、一個(gè)半胱氨酸殘基和一個(gè)精氨酸殘基的生物活性肽。純化過程始于使用孔隙率遞降(到0. 2 μ m)的kitz-Orion過濾板的成功過濾, 以獲得透明和澄清的溶液。在這一步,酵母提取物的特征在于固體殘余物為25到35g/kg, 蛋白水平10到15g/l和糖水平5-10g/l。此提取物的蛋白性質(zhì)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳來展示。對(duì)于此分析,使用 NuPAGE Bis-Tris預(yù)置膠(Invitrogen)。肽水解產(chǎn)物在NuPAGE LDS樣品制備緩沖液的還原變性條件下被加熱到70V,10分鐘。NuPAGE 抗氧化劑溶液被加到內(nèi)室(負(fù)極), 以預(yù)防電泳期間還原蛋白的再氧化。蛋白遷移通過在NuPAGE MES遷移緩沖液中使用標(biāo)準(zhǔn)的keBlue Plus2作為分子量標(biāo)記而完成。蛋白染色通過使用Coomassie Blue R_250 完成。在這些條件下,3個(gè)大的蛋白家族被觀察到第一家族相當(dāng)于分子量大于75kDa的蛋白,第二家族相當(dāng)于分子量從20到25kDa的蛋白,最后一家族是分子量小于5kDa的蛋白。此溶液隨后使用正切流動(dòng)過濾,排除分子量大于5kDa的蛋白而進(jìn)行純化。為此, 酵母肽水解產(chǎn)物在壓力下被泵入裝備有Pellicon 2Biomax 50kDa盒的Pellicon 支持物。此第一濾液被回收以隨后通過另一 PelliCon 2Biomax IOkDa盒過濾。第二濾液隨后被回收,其再次通過最后的Pellicon 2 Biomax 5kDa盒洗脫。在純化結(jié)束后,獲得米色、透明和澄清的酵母植物提取物。其特征在于固體殘余物為35到45g/kg,蛋白含量30到 40g/l。此溶液隨后通過使用Chen^tation軟件運(yùn)行HP 1100部件的高效液相色譜(HPLC) 來分析。酵母水解產(chǎn)物洗脫期間使用的柱子是NucleOsil 300-5C4 MPN(125x4mm)柱。此柱能使分子量為0. 2到25kDa的蛋白被色譜分析(依照使合適的溶劑梯度,與實(shí)施例1 一致)。在這些層析分析條件下,幾個(gè)肽部分能被分離。這些不同的部分隨后通過質(zhì)譜來分析,以特異地鑒定每個(gè)峰的肽的氨基酸含量。 還完成了序列分析以確定生物活性肽的肽序列。通過HPLC(高效液相色譜)獲得的色譜圖的例子,具有相當(dāng)于生物活性肽峰的展示,在附圖4中給出。還完成了本發(fā)明的活性成分的氨基酸組成的確定。它在酸水解后被實(shí)現(xiàn)并通過使用PICT(異硫氰酸苯酯)前衍生化的高效液相色譜而鑒定。實(shí)施例4 通過體外測(cè)試,證明富含生物活性肽的酵母肽水解產(chǎn)物的脫餼素作用依照本發(fā)明完成的富含生物活性肽酵母水解產(chǎn)物的脫色素活性在皮膚樣品上被證明。6mm直徑的活組織樣品取自人的皮膚樣品。這些活組織樣品于體外被維持于6孔板中存在特異培養(yǎng)基(DMEM lg/L,HAMF 12,SVF和抗生素)的插入物中?;罱M織樣品隨后被預(yù)處理M小時(shí),用3%濃度的肽水解產(chǎn)物以每天2次的頻率應(yīng)用。其它皮膚樣品不用相同的水解產(chǎn)物來預(yù)處理,并用作對(duì)照條件。隨后,活組織被以lOOmJ/cm2的量暴露于中波UV輻射。預(yù)處理過的活組織再次使用3%濃度的肽水解產(chǎn)物以每天2次的頻率應(yīng)用處理M小時(shí)。 在此2次處理后,皮膚樣品中表皮中存在的黑色素量的定量評(píng)估在依照Rmtana-Masson方法染色后,用光學(xué)顯微鏡而組織學(xué)地完成。為此,將皮膚活組織包埋在石蠟中,制作了 4μπι厚度的組織學(xué)切片。這些切片隨后通過Rmtana-Masson技術(shù)染色將石蠟從切片上除去,將切片水化并隨后使用氫氧化銨銀溶液處理。在微波爐中經(jīng)過兩分鐘后,清洗切片,使用硫代硫酸鈉處理,在脫水并用蓋玻片封片之前,再次清洗并用蘇木精復(fù)染,從而使在表皮中存在的黑色素通過光學(xué)顯微鏡被看到。結(jié)果在中波UV輻射前,未處理過的皮膚對(duì)比使用酵母肽水解產(chǎn)物處理過的皮膚表現(xiàn)出更高的色素沉著水平。在中波UV輻射后,用所述水解產(chǎn)物處理過的皮膚對(duì)比來自對(duì)照條件下的未處理的皮膚表現(xiàn)出明顯更低的色素沉著水平。因此,這些結(jié)果使我們能推斷,不存在中波UV輻射時(shí),富含生物活性肽的酵母肽水解產(chǎn)物對(duì)比未處理過的皮膚樣品,降低了黑色素水平。此外,當(dāng)皮膚樣品被我們的活性成分預(yù)處理過時(shí),通過中波UV輻射誘導(dǎo)的黑色素合成,非常明顯地降低了。因此,依照本發(fā)明的肽水解產(chǎn)物能使皮膚的色素沉著顯著地降低并抑制黑色素合成。實(shí)施例5 含遮光劑的脫餼素化妝組合物
權(quán)利要求
1.蛋白酶體激活性肽水解產(chǎn)物,特征在于所述水解產(chǎn)物富含多種生物活性肽,所述生物活性肽有小于6kDa的分子量,包含3至5個(gè)氨基酸,每種生物活性肽包含至少一個(gè)天冬氨酸殘基、一個(gè)半胱氨酸殘基和一個(gè)精氨酸殘基。
2.權(quán)利要求1的富集的肽水解產(chǎn)物,特征在于所述生物活性肽是通式(I) X1-[Asp,Cys,Arg]-X2其中,X1是天冬酰胺、賴氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、精氨酸或不存在; X2是組氨酸、賴氨酸、精氨酸或不存在。
3.前述權(quán)利要求的富集的肽水解產(chǎn)物,特征在于所述生物活性肽相應(yīng)于下式中的一種(SEQ ID No. 1)Arg-Asp-Cys-Arg-Arg (SEQ ID No. 2)Asn-Asp-Cys-Arg-Lys (SEQ ID No. 3)Asp-Cys-Arg-His (SEQ ID No. 4)Val-Asp-Cys-Arg (SEQ ID No. 5)Asp-Cys-Arg
4.權(quán)利要求1至3之一的富集的肽水解產(chǎn)物,特征在于其來自植物的水解,所述植物選自玉米(Zea may ζ L)、豌豆(Pisum sativum)、或水禾§ (Oryza sativa L)。
5.權(quán)利要求1至3之一的富集的肽水解產(chǎn)物,特征在于其來自于酵母屬的酵母的水解, 更特別地是釀酒酵母的水解。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肽水解產(chǎn)物,特征在于所述肽水解產(chǎn)物含有0.5至5. 5g/l 的肽性質(zhì)的化合物。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的富集的肽化合物,特征在于所述肽被用作藥物。
8.一種化妝組合物,其包含權(quán)利要求1至6之一的富集的肽水解產(chǎn)物作為活性成分。
9.權(quán)利要求8的化妝組合物,特征在于所述組合物以包含化妝可接受介質(zhì)的適于局部應(yīng)用的形式存在。
10.權(quán)利要求8或9之一的組合物,特征在于所述富集的肽水解產(chǎn)物在組合物中以占組合物總重量的0. 0001%到20 %的量存在,并優(yōu)選以占組合物總重量0. 05 %到5 %的量存在。
11.權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)的組合物,特征在于所述水解產(chǎn)物被溶解于一種或多種溶劑中,諸如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一縮二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、環(huán)多元醇、白凡士林、植物油或這些溶劑的任意混合物。
12.權(quán)利要求8至11任一項(xiàng)的組合物,特征在于所述組合物還含有促進(jìn)所述富集的肽水解產(chǎn)物作用的至少一種其它活性成分。
13.權(quán)利要求12的組合物,特征在于所述活性成分是在增亮劑方面展現(xiàn)出活性的物質(zhì)如脫屑劑;撫慰劑,有機(jī)或無機(jī)的光保護(hù)劑,增濕劑;其它脫色素劑,酪氨酸酶抑制劑;刺激皮膚或表皮大分子合成和/或預(yù)防其降解的物質(zhì);刺激成纖維細(xì)胞和/或角化細(xì)胞增殖或刺激角化細(xì)胞分化的物質(zhì);作用于細(xì)胞能量代謝的物質(zhì);脫色素肽,植物水解產(chǎn)物,抗老化齊U,以及其混合物。
14.包含權(quán)利要求1至6之一所定義的所述富集的肽水解產(chǎn)物和化妝可接受介質(zhì)的化妝組合物的用途,其用于增加蛋白酶體活性和改善蛋白酶體對(duì)涉及黑素生成的損壞蛋白的降解。
15.包含權(quán)利要求1到6之一所定義的所述富集的肽水解產(chǎn)物和化妝可接受介質(zhì)的化妝組合物的用途,其用于對(duì)皮膚進(jìn)行脫色素、增亮和/或增白。
16.權(quán)利要求15的組合物的用途,其用于預(yù)防和/或治療色素沉著過多的瑕疵諸如黑斑病、黃褐斑、光化性雀斑樣痣、日光性雀斑樣痣、雀斑、意外性色素沉著瑕疵、瘢痕形成后色素沉著瑕疵。
17.權(quán)利要求15的用途,其用于治療和/或預(yù)防由光老化引起的色素沉著過多性質(zhì)的皮膚跡象。
18.—種化妝治療方法,特征在于將包含有效量權(quán)利要求1至6之一所定義的富集的肽水解產(chǎn)物的組合物局部應(yīng)用于要進(jìn)行治療的皮膚或上皮附屬物,以對(duì)皮膚或上皮附屬物進(jìn)行脫色素、增亮和/或增白。
全文摘要
本發(fā)明涉及富含生物活性肽的肽水解產(chǎn)物,所述水解產(chǎn)物是蛋白酶體激活劑。此外,本發(fā)明在一方面涉及在生理可接受介質(zhì)中包含所述水解產(chǎn)物的化妝或制藥組合物,在另一方面,涉及其用于除色素、增亮和/或增白皮膚和預(yù)防或治療色素沉著瑕疵和因光老化而產(chǎn)生的皮膚跡象的用途。最后,本發(fā)明適用于使用所述肽水解產(chǎn)物的化妝治療方法。
文檔編號(hào)C07K5/08GK102459309SQ201080028497
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月23日
發(fā)明者C·達(dá)爾法拉, J-M·博托, N·東洛熱 申請(qǐng)人:Isp投資公司