專利名稱：大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其抗體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單克隆抗體，特別涉及分別分泌抗大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單克隆抗體,細(xì) 胞株保藏編號分別為CGMCC5121、CGMCC5122及CGMCC5123，還涉及各自分泌的單克隆抗體在利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)檢測大豆脂肪氧化酶同功酶當(dāng)中的應(yīng)用，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大豆中含有三種脂肪氧化酶(Lipoxygenase,簡稱Lox)同功酶即Loxl、Lox2和Lox3,它們能專一催化具有cis, cis-1, 4-戍二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸通過分子加氧，形成具有共軛雙鍵的氫過氧化衍生物，即醛、酮等具有揮發(fā)性的異味物質(zhì)，使大豆具有豆腥味，從而降低了豆制品的耐儲性、食用性和營養(yǎng)價值。通常在大豆加工過程中人們通過加熱、微波照射、改變介質(zhì)的PH值、有機(jī)溶劑萃取和醛水解酶等方法消除豆腥味，但這些方法都會不同程度地降低豆制品的營養(yǎng)價值，并且使得成本增高。培育脂肪氧化酶缺失品種可以從根本上解決上述問題。但在脂肪氧化酶缺失材料的選育過程中，Lox在田間不存在指示性狀，從種子外觀和農(nóng)藝性狀上無法鑒別，并且田間脂肪氧化酶缺失材料選擇工作量大，因此急需一種快速、簡便、成本低、一次可以同時檢測出三種脂肪氧化酶的檢測方法。目前脂肪氧化酶的常用的檢測方法是薄層等電聚焦電泳(IEF)檢測方法，這種方法主要是通過酶染法和蛋白染色方法結(jié)合使Lox同功酶帶顯色，雖然能同時檢測出三種脂肪氧化酶，但檢測中常常會因Lox的缺失而發(fā)生其它Lox等電點(diǎn)正極漂移現(xiàn)象；另外該方法所需設(shè)備、試劑昂貴，操作要求嚴(yán)格，一般育種、倉儲單位和加工質(zhì)檢部門不便操作。另外據(jù)日本Suzuki, Y 等 1992 年報道(Prodution and use ofmonolional antibodies against rice embryo lipoxygenase-3, Biosci Biotech.Biochem. 56:678-679):用單克隆抗體可以檢測水稻中的Lox3,這種方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但檢測過程中除需要做封閉外，還需要過夜包被酶標(biāo)板，因此耗時，操作起來不方便。申請?zhí)?0112539. 7的專利公開了一種作物脂肪氧化酶同功酶的檢測方法，該方法具有操作簡便、結(jié)果直觀等特點(diǎn)。但由于它是利用脂肪氧化酶的偶聯(lián)氧化還原指示劑顯色反應(yīng)的原理來進(jìn)行測定的，所以它的靈敏度和特異性受到一定的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免上述方法的缺陷，建立能分別分泌抗大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2、Lox3的特異性單克隆抗體的3個雜交瘤細(xì)胞株,利用這些細(xì)胞株分泌的特異性單克隆抗體來組裝可以用于同時檢測大豆中三種脂肪氧化酶同功酶的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(DAS-ELISA)檢測試劑盒 。該試劑盒適用于對大豆中三種脂肪氧化酶的定性和定
量測定。本發(fā)明所解決的第一個技術(shù)問題是提供了一組抗大豆脂肪氧化酶同功酶的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于所述的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株包括抗大豆脂肪氧化酶Loxl的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞融合產(chǎn)生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC5121 ;及抗大豆脂肪氧化酶Lox2的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞融合產(chǎn)生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC5122 ;及抗大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞融合產(chǎn)生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC5123。所述的抗大豆脂肪氧化酶Loxl、Lox2、Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立方法如下①免疫抗原制備分別取單缺Loxl的大豆種子(記為Lox-1)、單缺Lox2的大豆種子五星2號(記為Lox-2)、單缺Lox3的大豆種子(記為Lox_3) (Lox_l、Lox_3可以通過國家種質(zhì)庫獲得，五星2號(Lox-2)可以從市場上買到)，用鋼銼磨成豆粉，以及Sigma公司產(chǎn)品Soybean Lox typel_B (同時含有3種大豆脂肪氧化酶,幾乎不含其它大豆蛋白),分別與8 15倍體積的的pH為8. 0的Tris — CaCl2緩沖液混勻，浸提0. 5-1小時，4°C 12000rpm離心IOmin,,取上清備用，分別為Lox-1上清液、Lox_2上清液、Lox_3上清液、Soybean Loxtype1-B上清液；②小鼠免疫選擇4 6周齡的行動敏捷的純系BALB/C雌小鼠，分別稱量各小鼠體重并標(biāo)記；取步驟①中制備的Lox-1、Lox-2、Lox-3上清液，用生理鹽水將其稀釋到蛋白含量4mg/ml，加入等體積弗氏完全佐劑混合后，采取皮下多點(diǎn)注射首次免疫小鼠，各上清液分別免疫5只小鼠并做標(biāo)記,每只小鼠的免疫劑量為0. 4 0. 6mg ；③注射環(huán)磷酰胺溶液(CY):將步驟②中首次免疫的小鼠分別于免疫10min、24h、48h后，按照90mg/kg的量分別對小鼠進(jìn)行頸背部多點(diǎn)注射濃度20mg/ml的環(huán)磷酰胺溶液(CY)進(jìn)行消減；④效價測定及再次免疫首次免疫I周后用步驟①中制備的Soybean Loxtypel-B上清液作抗原對步驟③中的小鼠按照步驟②方法再次進(jìn)行免疫，第二次免疫一周后進(jìn)行第三次免疫，第三次免疫后第四天從小鼠尾部分別取血2-3滴，離心取上清，用間接酶聯(lián)免疫吸附法測定其效價(效價測定利用Soybean Lox typel_B包被),如果效價小于
1:1600,1周后對各小鼠用Soybean Lox typel-B按照步驟②方法再次進(jìn)行免疫,并進(jìn)行效價測定，直至血清效價達(dá)到或高于1:1600為止；⑤加強(qiáng)免疫3種免疫小鼠中，每種均選擇血清效價最高的小鼠在細(xì)胞融合前3天按步驟④加強(qiáng)免疫I次；⑥細(xì)胞融合分別取步驟⑤中的不同小鼠的脾細(xì)胞與復(fù)蘇的SP2/0細(xì)胞混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)板HAT培養(yǎng)基上分別篩選陽性雜交瘤細(xì)胞；⑦特異性陽性細(xì)胞株篩選細(xì)胞融合7 15天后，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法，利用Soybean Lox typel_B作為檢測抗原進(jìn)行陽性篩選，同時利用單缺Loxl的大豆種子(Lox-1)的豆粉上清液作為檢測抗原進(jìn)行交叉檢測，上清液的0D450值與空白對照孔的0D450值之比大于2.1的即判斷為陽性孔，并且與Lox-1反應(yīng)表現(xiàn)為陰性的孔，其中的雜交瘤細(xì)胞稱為陽性細(xì)胞株，該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體為特異性抗Loxl的。用同樣的方法，均利用Soybean Lox typel_B作為檢測抗原進(jìn)行陽性篩選,利用五星2號豆粉上清液對分泌抗Lox2的單克隆抗體進(jìn)行交叉檢測,利用Lox-3豆粉上清液對分泌抗Lox3的單克隆抗體進(jìn)行交叉檢測；⑧亞克隆采用有限稀釋法對步驟⑦中篩選到的3種陽性細(xì)胞株分別進(jìn)行亞克隆，連續(xù)兩次亞克隆之后剔除掉假陽性細(xì)胞株，在檢測過程中均按照⑦中的方法同時進(jìn)行 陽性和交叉檢測，最終可以獲得分別分泌抗Loxl、Lox2、Lox3的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明所解決的第二個技術(shù)問題是提供由權(quán)利要求1所述的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體包括由抗大豆脂肪氧化酶Loxl的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分泌的特異性抗Loxl的單克隆抗體 '及由抗大豆脂肪氧化酶Lox2的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分泌的特異性抗Lox2的單克隆抗體 '及由抗大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分泌的特異性抗Lox3的單克隆抗體。上述的單克隆抗體是通過以下方法得到的將上述步驟⑧中得到的分泌Loxl、Lox2、Lox3單克隆抗體細(xì)胞株分別以(I 2) X IO6個細(xì)胞/只的量接種到經(jīng)過石蠟油預(yù)處理過的不同BALB/C小鼠腹腔，誘導(dǎo)腹水產(chǎn)生抗體，經(jīng)過6 8天后即可采集腹水或血清，分別得到Loxl、Lox2、Lox3單克隆抗體。本發(fā)明所解決的第三個技術(shù)問題是提供所述的單克隆抗體在檢測大豆脂肪氧化酶同功酶中的應(yīng)用。本發(fā)明所解決的第四個技術(shù)問題是提供所述的單克隆抗體在制備檢測大豆脂肪氧化酶同功酶試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明所解決的第五個技術(shù)問題是提供一種檢測大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，其特征在于包含以下步驟A、將本發(fā)明的分別抗大豆脂肪氧化酶Loxl、Lox2、Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株所分泌的各單克隆抗體分離純化；B、采用辣根酶標(biāo)記步驟A純化后的單克隆抗體，分別獲得辣根酶標(biāo)記的抗大豆LoxU Lox2和Lox3的單克隆抗體，作為檢測抗體，酶標(biāo)后分別命名為L_1，L_2，L-3 ；C、利用大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2、Lox3的多克隆抗體作為固相抗體包被酶標(biāo)板，B中得到的L-l，L-2，L-3作為檢測抗體，利用抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，通過顯色與否及深淺來檢測大豆種子當(dāng)中Loxl、Lox2、Lox3這3種脂肪氧化酶的缺失類型和含量。所述的步驟A中所得到的各單克隆抗體采用辛酸-硫酸銨法進(jìn)行分離純化，步驟如下
①用0. 06M醋酸緩沖液將所采集的腹水或血清稀釋3-4倍，用NaOH調(diào)pH為4. 5，并記下液體體積；②在振蕩下滴加辛酸(每毫升稀釋的腹水或血清中加25ul辛酸)，室溫下攪拌30min,4°C, IOOOOrpm離心30min,棄沉淀，留上清；(加辛酸必須一滴一滴加)③過濾上清液，加入0.1M pH7. 4的PBS (每10份上清液加I份PBS)，用NaOH調(diào)pH 為 7.4，4°C放置 30min ；④研磨硫酸銨，每毫升混合液加0. 28g硫酸銨,攪拌30min, IOOOOrpm離心20min ；⑤取沉淀溶于原腹水或血清1/10體積的0. OlM PBS中，用50倍體積的0. OlMPBS緩沖液透析過夜，換液2-3次；⑥將液體從透析袋取出，4°C, IOOOOrpm離心20min,去沉淀，即為純化的單克隆抗體，濃縮后_20°C保存?zhèn)溆谩?所述的步驟B中將抗大豆Loxl、Lox2和Lox3的單克隆抗體進(jìn)行酶標(biāo)制備檢測抗體的步驟如下①稱取2mg的HRP酶，溶于三蒸水中，加入新近配制的過碘酸鈉溶液，混勻后置40C，30min,加入乙醇溶液,室溫，30min,加入Img純化抗體,混勻,調(diào)pH值至9. 0,4°C過夜；②加入硼氫化鈉，混勻，置4°C 2h ;③將酶標(biāo)抗體混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4°C 30min后離心，用pH7. 4磷酸鹽緩沖液透析過夜，即可。所述步驟C中大豆脂肪氧化酶多克隆抗體制備的步驟如下①免疫動物選擇與初次免疫選擇重量在2 3kg之間的純種新西蘭大白兔，將Soybean Lox typel_B蛋白稀釋成8mg/ml作為抗原，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化后，采取背部皮下多點(diǎn)注射免疫兔子，每只兔子免疫劑量為1. 6mg ；②再次免疫間隔10 14天后利用不完全付氏佐劑和濃度為8mg/ml的SoybeanLox typel-B蛋白等體積混合后按照步驟①進(jìn)行再次免疫，如此進(jìn)行第三次免疫；③效價測定第三次免疫后第11天從上述步驟②中免疫的大白兔耳緣靜脈取血檢測其效價，如果效價小于1:10000時，則對步驟②中大白兔再次按照步驟②免疫，如此反復(fù)免疫直至所測效價高于1:10000為止；④多克隆抗體的制備3天后對步驟③效價最高的大白兔采用頸動脈放血法采血，分離血清，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法測定分離血清與Loxl、Lox2、Lox3及大豆中其它蛋白的交叉，證明該血清與Loxl、Lox2、Lox3均有交叉而與大豆中其它蛋白無交叉后即得到多克隆抗體血清。所述步驟C中檢測大豆種子當(dāng)中Lox-l、Lox-2、Lox_3這3種脂肪氧化酶的缺失類型和含量包括如下操作步驟①待測大豆中Lox提取液的制備將待測大豆的種子磨成豆粉，加入8 15倍體積的pH為8. 0的Tris - CaCl2緩沖液，混勻后離心取上清備用；②洗板用Tween20 — NaCl緩沖液將多克隆抗體包被的酶標(biāo)板反復(fù)洗3 4次，每次2 3min，拍干，目的洗去未結(jié)合到板子上的多克隆抗體；③-1加樣將步驟①中制備的Lox提取液加到步驟②備好的酶標(biāo)板中，同時做陽性和陰性對照，25°C 37°C放置30 90min后按照步驟②洗板；
③-2加樣將sigma公司Soybean Lox typel-B產(chǎn)品稀釋成80萬活力單位/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，用了￥661120 —恥(1緩沖液按10、30、90、270、810、2430、7290、21870、65610、196830、590490,0共12個稀釋濃度進(jìn)行倍比稀釋，同時將步驟①中制備的Lox提取液稀釋成10、50,100,200共4幾個濃度梯度，然后將不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和Lox提取液按每個濃度100 μ L/孔分別加到步驟②備好的酶標(biāo)板中，均設(shè)3次重復(fù)，37°C放置45min-60min后按照步驟②洗板；④-1加入大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3單克隆抗體試劑(L_1、L_2、L-3):將大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3單克隆抗體試劑(L_l、L_2、L-3)分別加入到步驟③-1已加入待測樣品的酶標(biāo)板孔內(nèi)，25°C 37°C放置30-90min后按照步驟②洗板；④-2加入大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3單克隆抗體試劑(L_1、L_2、L-3):將大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3單克隆抗體試劑(L_l、L_2、L-3)分別 加入到步驟③-2已加入待測樣品的酶標(biāo)板孔內(nèi)，25°C 37°C放置30-90min后按照步驟②洗板；⑤顯色及終止將含有20%的3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺的無水乙醇底物液和pH為5. O磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物液等體積混合，加入到所有孔中，避光放置15 20min，顯色的樣品中含有與所加單克隆抗體相對應(yīng)的Lox，不顯色的樣品中則不含有與所加單克隆抗體相對應(yīng)的Lox ;加入底物液體積1/2的2M H2SO4終止液終止顯色；⑥酶標(biāo)儀讀數(shù)設(shè)置參數(shù)450nm，外部振搖3秒；⑦標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按步驟③-2中標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋度的log值為橫坐標(biāo)，以步驟⑦中得到的OD值為縱坐標(biāo)，繪制“S”形標(biāo)準(zhǔn)曲線；⑧利用“S”形標(biāo)準(zhǔn)曲線中間呈線性關(guān)系的一段，利用該線段的回歸方程以及待測樣品系列稀釋度的OD值計算出Lox的活力單位數(shù)。本發(fā)明所解決的第六個技術(shù)問題是根據(jù)上述的檢測方法提供一種檢測大豆脂肪氧化酶同功酶的試劑盒，該試劑盒包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和存放在盒體內(nèi)的試劑，其特征在于盒內(nèi)存放的瓶裝檢測試劑由以下試劑組成pH為8. O的Tris - CaCl2緩沖液；陽性對照試劑；陰性對照試劑；Tween20 - NaCl溶液緩沖液；由抗大豆脂肪氧化酶Loxl、LOX2、LOX3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株所分泌的各單克隆抗體分別經(jīng)辣根酶標(biāo)記后得到的抗大豆脂肪氧化酶同功酶L0X1、L0X2和Lox3單克隆抗體試劑；含有20%的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺的無水乙醇底物液；pH為5. O磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物液；2M H2SO4終止液；用雙蒸水將sigma公司Soybean Lox typel_B產(chǎn)品稀釋成80萬活力單位/ml得到的標(biāo)準(zhǔn)液；其中，所述的陽性對照為從普通大豆種子中提取的總蛋白。其中，所述的陰性對照為從脂肪氧化酶全缺失大豆中提取的總蛋白。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、利用Sigma公司的Soybean Lox typel-B產(chǎn)品作為免疫抗原誘發(fā)哺乳動物產(chǎn)生多克隆抗體，后將多抗隆抗體結(jié)合到酶標(biāo)板上；同時在不純化大豆Lox蛋白的前提下，利用大豆脂肪氧化酶近等基因系century材料通過消減免疫法首先使用環(huán)磷酰胺將大豆中其它蛋白在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)屏蔽掉，再用含有目的大豆Lox蛋白的混合樣品免疫實(shí)驗(yàn)小鼠，誘發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生對Loxl、Lox2和Lox3專一的抗體,制備特異雜交瘤細(xì)胞,避開了蛋白純化這一難題；2、通過篩選陽性細(xì)胞株與交叉檢測同時進(jìn)行，極大程度上降低了篩選到分別抗大豆Loxl、Lox2和Lox3的強(qiáng)特異性單克隆抗體的工作量；3、檢測時多克隆抗體已被結(jié)合到酶標(biāo)板上，檢測過程中不需做封閉和過夜包被酶標(biāo)板，因此省時，操作方便；4、利用抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，通過顯色檢測酶的存在和酶的含量，檢測時形成“多抗+樣品+單抗”雙抗體夾心，準(zhǔn)確可靠、特異性強(qiáng)； 5、樣品處理簡單，一次可以同時檢測出三種脂肪氧化酶，并且一次可以同時檢測多個樣品，適用于育種單位、倉儲單位和加工質(zhì)檢部門，最適用于育種中大量品種(系)的篩選。


圖1為30個近等基因系高代材料檢測結(jié)果圖；圖2為“S”形標(biāo)準(zhǔn)曲線。涉及的菌種保藏抗大豆脂肪氧化酶Loxl的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株(Loxl-E1),為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC5121，保藏日期為2011年7月26日；抗大豆脂肪氧化酶Lox2的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株(LoX2-G5)，為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC5122，保藏日期為2011年7月26日；抗大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株(LoX3-H8)，為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC5123，保藏日期為2011年7月26日。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1:抗大豆脂肪氧化酶同功酶的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立1.1實(shí)驗(yàn)材料大豆脂肪氧化酶全缺失材料“中特I號”購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所；美國Century近等基因系材料國家資源庫保存號分別為Lox_l =WDDO 1483,Lox-3 :WDDO1485 ；缺Lox-2酶大豆品種“五星2號”，審定號國審豆2004005 ；BALB/C小鼠和小鼠SP2/0細(xì)胞購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心(北京)；新西蘭大白兔購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心；
96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板購自廈門市云鵬科技發(fā)展有限公司。1. 2化學(xué)試劑HAT培養(yǎng)基、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、Soybean Lox typel-B均為Sigma公司產(chǎn)品；辣根酶(HRP)購買自北京華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司；其它所用化學(xué)試劑均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
1. 3試驗(yàn)方法①免疫抗原制備取單缺Loxl的大豆種子、單缺Lox2五星2號大豆種子、單缺Lox-3的大豆種子(可以通過國家種質(zhì)庫獲得)，用鋼銼磨成豆粉(分別磨10g)，Sigma公司產(chǎn)品Soybean Lox typel-B10g (同時含有3種大豆脂肪氧化酶,不含其它大豆蛋白),上述材料用8 15倍體積的pH為8. O的Tris — CaCl2緩沖液混勻，浸提I小時，4°C 12000rpm離心IOmin,取上清備用；②小鼠免疫選擇4 6周齡的行動敏捷的純系BALB/C雌小鼠15只，分成3組(命名為a、b、c組)，每組5只，分別編號為1、2、3、4、5號，分別稱量各小鼠體重并標(biāo)記(如表I);取步驟①中制備的單缺Loxl的大豆種子、單缺Lox2五星2號大豆種子、單缺Lox-3的大豆種子的上清液分別用生理鹽水將其稀釋到蛋白含量4mg/ml，加入等體積弗氏完全佐劑混合后，分別采取皮下多點(diǎn)注射首次免疫小鼠，每只小鼠的免疫劑量為O. 6mg，注射單缺Loxl的大豆種子(Lox-1)上清液的為a組，注射單缺Lox2的大豆種子(Lox-2)上清液的為b組，注射單缺Lox3的大豆種子(Lox-3)上清液的為c組；表1:各組小鼠體重統(tǒng)計表
權(quán)利要求
1.抗大豆脂肪氧化酶LOX3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于所述的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株為小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞融合產(chǎn)生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC5123。
2.由權(quán)利要求1所述的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在檢測大豆脂肪氧化酶Lox3中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測大豆脂肪氧化酶Lox3試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，保藏編號為CGMCC5123，本發(fā)明還公開了由該雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體及其在檢測大豆脂肪氧化酶Lox3中的應(yīng)用。
文檔編號G01N33/577GK102994454SQ20121055490
公開日2013年3月27日 申請日期2011年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月2日
發(fā)明者張孟臣, 馬志民, 秦君, 閆龍, 李亞璞, 蔣春志, 邸銳, 唐曉東 申請人:河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所