專利名稱:一種用復(fù)合酶水解牡蠣蛋白制備活性肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牡蠣活性肽的制備方法，特別是一種用復(fù)合酶水解牡蠣蛋白制備活性肽的方法，屬于海洋天然產(chǎn)物與醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
牡蠣(Oyster)是一種海產(chǎn)貝類。牡蠣在分類上屬于軟體動物門，瓣鰓綱，異柱目，牡蠣超科，牡蠣科，它是一種食藥兩用的雙殼貝海產(chǎn)品。在我國南北沿海均有養(yǎng)殖，特別是廣東省近幾年來發(fā)展較快，牡蠣肉質(zhì)乳白、細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富，除含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和糖類外，還含有人體必需的十多種氨基酸、礦物質(zhì)營養(yǎng)成分等。
近代研究表明牡蠣含18種氨基酸、肝糖元、B族維生素、?；撬岷外}、磷、鐵、鋅等營養(yǎng)成分，常吃可以提高機體免疫力，其所含?；撬峥山笛?、降血壓。臨床上，牡蠣在治療失眠、慢性中耳炎、小兒多汗癥、子宮肌瘤以及小兒遺尿等方面均有突出的療效(中醫(yī)藥信息，2011，28 (I) : 114-116.)。牡蠣提取物有抗菌作用，對脊髓灰質(zhì)炎病毒和流感病毒有抑制作用，其水溶性成分尚可提高動物機體免疫力等等。
從牡蠣中提取活性物質(zhì)的研究過去有報道，并且具有顯著醫(yī)療保健作用的牡蠣保健食品已經(jīng)有銷售。如深圳海王集團在牡蠣相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)研究中，已經(jīng)取得了顯著的經(jīng)濟效益和社會效益，為進一步推動該項目的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，正在努力研發(fā)高效的牡蠣保健食品和藥品。目前，活性肽的主要生產(chǎn)方法通過酶法制備。中國專利公開號CN 1680578A公開了一種牡蠣活性肽的制備方法，以太平洋牡蠣為原料，利用蛋白酶水解牡蠣蛋白，再用納濾技術(shù)脫鹽濃縮，可得到牡蠣活性肽。該方法中使用的為蛋白酶，而酶的選擇是生產(chǎn)活性肽的關(guān)鍵，酶的水解能力具有專一性，若想獲得具有獨特活性的多肽，單用一種酶效果不佳。且該方法屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域：
，并未涉及到醫(yī)藥領(lǐng)域。
從海洋動植物中篩選抗免疫調(diào)節(jié)促進劑、免疫調(diào)節(jié)抑制劑、促進或抑制血管形成、抗腫瘤作用等活性物質(zhì)是藥物研發(fā)的一個重要領(lǐng)域，但有關(guān)從海洋生物活性肽篩選具有免疫調(diào)節(jié)作用研究仍未得到足夠重視。中國專利公開號CN 101037468A公開了一種牡蠣活性肽的制備方法，以牡蠣為原料，利用酶法水解牡蠣蛋白及利用柱層析技術(shù)分離純化獲得高純度的牡蠣活性多肽，該法所得到的牡蠣活性多肽雖然可以作為藥品成分加以開發(fā)利用，但因其成本昂貴，難以實現(xiàn)大量生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述方法提出的不足，提供了一種能實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)免疫活性肽的方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種用復(fù)合酶水解牡蠣蛋白制備活性肽的方法，按照以下步驟制備
1.將牡蠣去殼，搗碎，按照 1:1的重量比例加入蒸餾水，在室溫下勻漿，得到牡蠣漿液；[0010]2.向牡蠣漿液加入牡蠣蛋白重量O. 5-2. 0%。的植物蛋白水解復(fù)合酶，在40_60°C下進行酶解反應(yīng)3-5h ；
3.將酶解反應(yīng)完成后的牡蠣漿液置于90-100°C下滅酶10-15min。
4.酶滅活后的牡蠣漿液保持70°C，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3-5 ；
5.牡蠣漿液調(diào)節(jié)pH值后，加入活性炭溶液進行脫色，脫色時間35min。
6.將脫色后的牡蠣漿液用MWC03000超濾膜，在真空減壓下抽濾，得到濾液。
7.將濾液冷凍干燥，即可獲得分子量小于3000Da,蛋白質(zhì)含量為85. 2%,氮含量為12. 7%的牡蠣蛋白多肽。
所述酶解反應(yīng)所用酶為南寧龐博生物工程有限公司的發(fā)明專利植物蛋白水解復(fù)合酶，它包含有內(nèi)切酶和外切酶、風(fēng)味酶。
內(nèi)切酶在木瓜蛋白酶或菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶中選用，或者選用這些內(nèi)切酶的混合物。其制備方法為以木瓜蛋白酶制備為例，從木瓜樹或果實取下新鮮木瓜漿，先用蒸餾水或去離子水沖稀或溶解木瓜膠乳，加入無機酸使雜質(zhì)沉淀，離心、過濾，經(jīng)微濾和超濾、濃縮、真空冷凍干燥、粉碎、密封保存?zhèn)溆?；菠蘿蛋白酶也按照此方法制備；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶的制備，用已知方法經(jīng)發(fā)酵提取得到；
外切酶在米曲霉或米根霉、黑曲霉等發(fā)酵物提取中選用，或者選用這些外切酶的混合物。其制備方法為以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30-50 V，濕度70-90 %的密閉容器中發(fā)酵2-5天，提取、再干燥，密封保存?zhèn)溆谩?br>風(fēng)味酶在乳酸菌或酵母菌等發(fā)酵物提取中選用，或者選用這些風(fēng)味酶的混合物。其制備方法為以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，先滅菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌種，在常溫下發(fā)酵1-4天，提取、分離、超濾等方法取得溶液，然后凍干，粉碎得到風(fēng)味酶，保存?zhèn)溆谩?br>優(yōu)選的酶解反應(yīng)溫度為60°C，反應(yīng)時間為4h。
優(yōu)選的滅酶溫度為95°C，時間為lOmin。
優(yōu)選將滅酶后的牡蠣漿液調(diào)節(jié)pH值至4. 5。
所述活性炭溶液的制備方法是將活性炭預(yù)熱200°C，活化lh，用蒸餾水將所得沉淀配成質(zhì)量濃度為5%的溶液。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
1.本發(fā)明采用南寧龐博生物工程有限公司的發(fā)明專利植物蛋白水解復(fù)合酶，可制備優(yōu)質(zhì)的具有獨特活性的多肽。
2.本發(fā)明利用超濾膜進行活性肽的篩分，通過膜的選擇性，以膜兩側(cè)存在的一定量能量差作為推動力，溶液中各組分透過膜的遷移速率的不同而實現(xiàn)非均相物系的分離。由于超濾膜具有不對稱微孔結(jié)構(gòu)，且采用薄層流道和湍流促進結(jié)構(gòu)，減少膜的污染，在分離過程中，使得大分子溶質(zhì)和微粒(如膠體或淀粉等)隨溶液切向流經(jīng)膜表面，而小分子物質(zhì)和溶劑則在壓力驅(qū)動下穿過致密層上的微孔而進入膜的另一側(cè)，因而超濾膜可以長期連續(xù)使用并保持較恒定的產(chǎn)量和分離效果。與傳統(tǒng)工藝相比較，不僅可以提高產(chǎn)品的純度、節(jié)約溶劑或試劑的耗用量，環(huán)境污染小，能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)化分離純化，縮短生產(chǎn)周期，可實現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。[0027]3.本發(fā)明產(chǎn)品牡蠣活性多肽可抑制小鼠淋巴細(xì)胞和人T細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat細(xì)胞增殖能力，即能降低抗體免疫反應(yīng)，是一種潛在的免疫抑制劑。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式并不局限于實施例表示的范圍(其中復(fù)合酶以南寧龐博生物工程有限公司的發(fā)明專利植物蛋白水解復(fù)合酶的部分實施例為原料)。
實施例1 :
內(nèi)切酶的制備以木瓜蛋白酶制備為例，從木瓜樹或果實取下新鮮木瓜漿，先用蒸餾水或去離子水沖稀或溶解木瓜膠乳，加入無機酸使雜質(zhì)沉淀，離心、過濾，經(jīng)微濾與超濾、濃縮、真空冷凍干燥、粉碎、得木瓜蛋白酶，密封保存?zhèn)溆谩?br>外切酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30°C，濕度90%的密閉容器中發(fā)酵3天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存?zhèn)溆谩?br>風(fēng)味酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，先滅菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌種，在常溫下發(fā)酵2天，提取、分離、超濾等方法取得溶液，然后凍干，粉碎得到風(fēng)味酶，保存?zhèn)溆谩?br>將上述的內(nèi)切酶、外切酶、風(fēng)味酶按質(zhì)量份數(shù)64 30 5的比例，并加入I份焦
亞硫酸鈉，混合，得到植物蛋白水解復(fù)合酶，置于10°c的冰箱保存。
將牡蠣去殼，搗碎，按照1:1的重量比例加入蒸餾水，在室溫下勻漿，得到牡蠣漿液；向牡蠣漿液加入牡蠣蛋白重量O. 5%%。的植物蛋白水解復(fù)合酶，在40°C下進行酶解反應(yīng)3h ;將酶解反應(yīng)完成后的牡蠣漿液置于90°C下滅酶IOmin ;采用甲醛滴定法測定氨基氮總量，凱氏定氮法測定總氮；酶滅活后的牡蠣漿液保持70°C，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3 ；牡蠣漿液調(diào)節(jié)PH值后，加入活性炭溶液進行脫色，脫色時間35min ;將脫色后的牡蠣漿液用MWC03000超濾膜，在真空減壓下抽濾，得到濾液；將濾液冷凍干燥，即可獲得分子量小于3000Da的牡蠣蛋白多肽。
將小鼠淋巴細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞調(diào)到濃度為IxlO5個/ml后加入96孔板，每孔100μ 1，用無小牛血清的PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA濃度配制為濃度為Img ^r1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA母液稀釋濃度為I μ g .mr1,然后用該培養(yǎng)基把分子量小于3000的牡蠣活性肽凍干粉配成需要的濃度1000 μ g · πιΓ1，每孔加該溶液lOOul，加到孔板后PHA的終濃度為O. 5 μ g · πιΓ1，牡蠣蛋白多肽終濃度500 μ g · πιΓ1,每孔液體終體積200 μ I。每組各做3個復(fù)孔，所設(shè)的3個空白孔為IOOul細(xì)胞懸液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培養(yǎng)基。將加好樣品的96孔板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)條件為37°C、5% C02。于培養(yǎng)結(jié)束前4小時加入511^*1111-現(xiàn)1'1'，每孔2(^1。培養(yǎng)結(jié)束后用低溫孔板離心機(3000r mirTSfC )離心，IOmin ;棄上清,力口 O. 4mol · L—1的鹽酸化異丙醇，每孔100 μ I ;待結(jié)晶物溶解后，用酶標(biāo)儀于492nm處測定吸光度。按下列公式計算抑制率生長抑制率=(1-用藥平均A值/對照平均A值)X100%。結(jié)果表明，牡蠣蛋白多肽對小鼠淋巴細(xì)胞生長和Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，呈現(xiàn)良好的濃度依賴性。濃度為125ug · πιΓ1時無論是對小鼠淋巴細(xì)胞還是Jurkat細(xì)胞，抑制率都達到了 40%以上。[0036]實施例2
內(nèi)切酶的制備取新鮮菠蘿及皮，打碎取汁，加入無機酸使雜質(zhì)沉淀，離心、過濾，經(jīng)微濾與超濾、濃縮、真空冷凍干燥、粉碎、得菠蘿蛋白酶，密封保存?zhèn)溆谩?br>外切酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在35°C，濕度80%的密閉容器中發(fā)酵5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存?zhèn)溆谩?br>風(fēng)味酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，先滅菌，再加入乳酸菌、酵母 菌等菌種，在常溫下發(fā)酵3天，提取、分離、超濾等方法取得溶液，然后凍干，粉碎得到風(fēng)味酶，保存?zhèn)溆谩?br>將上述的內(nèi)切酶、外切酶、風(fēng)味酶按質(zhì)量份數(shù)40 49 10的比例，并加入I份L-半胱氨酸，混合，得到植物蛋白水解復(fù)合酶，置于10°C的冰箱保存。
將牡蠣去殼，搗碎，按照1:1的重量比例加入蒸餾水，在室溫下勻漿，得到牡蠣漿液；向牡蠣漿液加入牡蠣蛋白重量1. 0%。的植物蛋白水解復(fù)合酶，在50°C下進行酶解反應(yīng)4h ;將酶解反應(yīng)完成后的牡蠣漿液置于95°C下滅酶IOmin ;采用甲醛滴定法測定氨基氮總量，凱氏定氮法測定總氮；酶滅活后的牡蠣漿液保持70°C，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3. 5 ；牡蠣漿液調(diào)節(jié)PH值后，加入活性炭溶液進行脫色，脫色時間35min ;將脫色后的牡蠣漿液用MWC03000超濾膜，在真空減壓下抽濾，得到濾液；將濾液冷凍干燥，即可獲得分子量小于3000Da的牡蠣蛋白多肽。
將小鼠淋巴細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞調(diào)到濃度為IxlO5個/ml后加入96孔板，每孔100μ 1，用無小牛血清的PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA濃度配制為濃度為Img ^r1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA母液稀釋濃度為I μ g · ml—1，然后用該培養(yǎng)基把分子量小于3000的牡蠣活性肽凍干粉配成需要的濃度500 μ g -πιΓ1,每孔加該溶液lOOul，加到孔板后PHA的終濃度為O. 5 μ g · πιΓ1，牡蠣蛋白多肽終濃度250 μ g · πιΓ1,每孔液體終體積200 μ I。每組各做3個復(fù)孔，所設(shè)的3個空白孔為IOOul細(xì)胞懸液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培養(yǎng)基。將加好樣品的96孔板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)條件為37°C、5% C02。于培養(yǎng)結(jié)束前4小時加入511^*1111-現(xiàn)1'1'，每孔2(^1。培養(yǎng)結(jié)束后用低溫孔板離心機(3000r mirTSfC )離心，IOmin ;棄上清,力口 O. 4mol · L—1的鹽酸化異丙醇，每孔100 μ I ;待結(jié)晶物溶解后，用酶標(biāo)儀于492nm處測定吸光度。按下列公式計算抑制率生長抑制率=(1-用藥平均A值/對照平均A值)X100%。結(jié)果表明，牡蠣蛋白多肽對小鼠淋巴細(xì)胞生長和Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，呈現(xiàn)良好的濃度依賴性。
實施例3
內(nèi)切酶的制備以木瓜蛋白酶制各為例，從木瓜樹或果實取下新鮮木瓜漿，先用蒸餾水或去離子水沖稀或溶解木瓜膠乳，加入無機酸使雜質(zhì)沉淀，離心、過濾，經(jīng)微濾與超濾、濃縮、真空冷凍干燥、粉碎、得木瓜蛋白酶，密封保存?zhèn)溆谩?br>外切酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在50°C，濕度70%的密閉容器中發(fā)酵2天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存?zhèn)溆谩?br>風(fēng)味酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，先滅菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌種，在常溫下發(fā)酵4天，提取、分離、超濾等方法取得溶液，然后凍干，粉碎得到風(fēng)味酶，保存?zhèn)溆谩?br>將上述的內(nèi)切酶、外切酶、風(fēng)味酶按質(zhì)量份數(shù)20 70 9的比例，并加入I份
L-半胱氨酸酸鹽，混合，得到植物蛋白水解復(fù)合酶，置于10°C的冰箱保存。
將牡蠣去殼，搗碎，按照1:1的重量比例加入蒸餾水，在室溫下勻漿，得到牡蠣漿液；向牡蠣漿液加入牡蠣蛋白重量1. 0%。的植物蛋白水解復(fù)合酶，在60°C下進行酶解反應(yīng)5h ;將酶解反應(yīng)完成后的牡蠣漿液置于100°C下滅酶15min ;采用甲醛滴定法測定氨基氮總量，凱氏定氮法測定總氮；酶滅活后的牡蠣漿液保持70°C，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4 ;牡蠣漿液調(diào)節(jié)PH值后，加入活性炭溶液進行脫色，脫色時間35min ;將脫色后的牡蠣漿液用MWC03000超濾膜，在真空減壓下抽濾，得到濾液；將濾液冷凍干燥，即可獲得分子量小于3000Da的牡蠣蛋白多肽。
將小鼠淋巴細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞調(diào)到濃度為IxlO5個/ml后加入96孔板，每孔100μ 1，用無小牛血清的PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA濃度配制為濃度為Img ^r1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA母液稀釋濃度為I μ g · ml—1，然后用該培養(yǎng)基把分子量小于3000的牡蠣活性肽凍干粉配成需要的濃度250 μ g πιΓ1，每孔加該溶液lOOul，加到孔板后PHA的終濃度為O. 5 μ g · πιΓ1，牡蠣蛋白多肽終濃度125 μ g · πιΓ1,每孔液體終體積200 μ I。每組各做3個復(fù)孔，所設(shè)的3個空白孔為IOOul細(xì)胞懸液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培養(yǎng)基。將加好樣品的96孔板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)條件為37°C、5% C02。于培養(yǎng)結(jié)束前4小時加入511^*1111-現(xiàn)1'1'，每孔2(^1。培養(yǎng)結(jié)束后用低溫孔板離心機(3000r mirTSfC )離心，IOmin ;棄上清,力口 O. 4mol · L—1的鹽酸化異丙醇，每孔100 μ I ;待結(jié)晶物溶解后，用酶標(biāo)儀于492nm處測定吸光度。按下列公式計算抑制率生長抑制率=(1-用藥平均A值/對照平均A值)X100%。結(jié)果表明，牡蠣蛋白多肽對小鼠淋巴細(xì)胞生長和Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，呈現(xiàn)良好的濃度依賴性。
實施例4
內(nèi)切酶的制備中性蛋白酶的制備，用已知方法經(jīng)發(fā)酵提取得到，密封保存?zhèn)溆谩?br>外切酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，加入米曲霉或米根雷、黑曲霉在30°C，濕度90%的密閉容器中發(fā)酵4. 5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存?zhèn)溆谩?br>風(fēng)味酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥蘇粉碎，先滅菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌種，在常溫下發(fā)酵3. 5天，提取、分離、超濾等方法取得溶液，然后陳干，粉碎得到風(fēng)味酶，保存?zhèn)溆谩?br>將上述的內(nèi)切酶、外切酶、風(fēng)味酶按質(zhì)量份數(shù)10 59 30的比例，并加入I份焦
亞硫酸鈉，混合，得到植物蛋白水解復(fù)合酶，置于10°c的冰箱保存。
將牡蠣去殼，搗碎，按照1:1的重量比例加入蒸餾水，在室溫下勻漿，得到牡蠣漿液；向牡蠣漿液加入牡蠣蛋白重量1. 5%。的植物蛋白水解復(fù)合酶，在45°C下進行酶解反應(yīng)3. 5h ;將酶解反應(yīng)完成后的牡蠣漿液置于95°C下滅酶15min ;采用甲醛滴定法測定氨基氮總量，凱氏定氮法測定總氮；酶滅活后的牡蠣漿液保持70°C，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4. 5 ；牡蠣漿液調(diào)節(jié)PH值后，加入活性炭溶液進行脫色，脫色時間35min ;將脫色后的牡蠣漿液用MWC03000超濾膜，在真空減壓下抽濾，得到濾液；將濾液冷凍干燥，即可獲得分子量小于3000Da的牡蠣蛋白多肽。[0056]將小鼠淋巴細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞調(diào)到濃度為IxlO5個/ml后加入96孔板，每孔100 μ 1，用無小牛血清的PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA濃度配制為濃度為Img ^r1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA母液稀釋濃度為I μ g · ml—1，然后用該培養(yǎng)基把分子量小于3000的牡蠣活性肽凍干粉配成需要的濃度125 μ g πιΓ1，每孔加該溶液lOOul，加到孔板后PHA的終濃度為O. 5 μ g πιΓ1，牡蠣蛋白多肽終濃度62. 5 μ g-πιΓ1,每孔液體終體積200 μ I。每組各做3個復(fù)孔，所設(shè)的3個空白孔為IOOul細(xì)胞懸液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培養(yǎng)基。將加好樣品的96孔板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)條件為37°C、5% C02。于培養(yǎng)結(jié)束前4小時加入511^*1111-現(xiàn)1'1'，每孔2(^1。培養(yǎng)結(jié)束后用低溫孔板離心機(3000r mirTSfC )離心，IOmin ;棄上清,力口 O. 4mol · L—1的鹽酸化異丙醇，每孔100 μ I ;待結(jié)晶物溶解后，用酶標(biāo)儀于492nm處測定吸光度。按下列公式計算抑制率生長抑制率=(1-用藥平均A值/對照平均A值)X100%。結(jié)果表明，牡蠣蛋白多肽對小鼠淋巴細(xì)胞生長和Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，呈現(xiàn)良好的濃度依賴性。濃度為125ug · πιΓ1時無論是對小鼠淋巴細(xì)胞還是Jurkat細(xì)胞，抑制率都達到了 40%以上。
實施例5
內(nèi)切酶的制備堿性蛋白酶制備，用已知方法經(jīng)發(fā)酵提取得到，密封保存?zhèn)溆谩?br>外切酶的制備以大豆或豆柏、麥款為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30°C，濕度88%的密閉容器中發(fā)酵2. 5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存?zhèn)溆谩?br>風(fēng)味酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，先滅菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌種，在常溫下發(fā)酵2. 5天，提取、分離、超濾等方法取得溶液，然后凍干， 粉碎得到風(fēng)味酶，保存?zhèn)溆谩?br>將上述的內(nèi)切酶、外切酶、風(fēng)味酶按質(zhì)量份數(shù)75 10 14的比例，并加入I份焦亞硫酸鈉，混合，得到植物蛋白水解復(fù)合酶，置于10°c的冰箱保存。
將牡蠣去殼，搗碎，按照1:1的重量比例加入蒸餾水，在室溫下勻漿，得到牡蠣漿液；向牡蠣漿液加入牡蠣蛋白重量2. 0%。的植物蛋白水解復(fù)合酶，在55°C下進行酶解反應(yīng)4. 5h ;將酶解反應(yīng)完成后的牡蠣漿液置于95°C下滅酶IOmin ;采用甲醛滴定法測定氨基氮總量，凱氏定氮法測定總氮；酶滅活后的牡蠣漿液保持70°C，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5 ;牡蠣漿液調(diào)節(jié)PH值后，加入活性炭溶液進行脫色，脫色時間35min ;將脫色后的牡蠣漿液用MWC03000超濾膜，在真空減壓下抽濾，得到濾液；將濾液冷凍干燥，即可獲得分子量小于3000Da的牡蠣蛋白多肽。
將小鼠淋巴細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞調(diào)到濃度為IxlO5個/ml后加入96孔板，每孔100 μ 1，用無小牛血清的PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA濃度配制為濃度為Img ^r1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA母液稀釋濃度為I μ g .mr1,然后用該培養(yǎng)基把分子量小于3000的牡蠣活性肽凍干粉配成需要的濃度62. 5μ g · πιΓ1，每孔加該溶液lOOul，加到孔板后PHA的終濃度為O. 5μ g · πιΓ1，牡蠣蛋白多肽終濃度31. 25 μ g · πιΓ1，每孔液體終體積200 μ I。每組各做3個復(fù)孔，所設(shè)的3個空白孔為IOOul細(xì)胞懸液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培養(yǎng)基。將加好樣品的96孔板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)條件為37°C、5% C02。于培養(yǎng)結(jié)束前4小時加入511^*1111-現(xiàn)1'1'，每孔2(^1。培養(yǎng)結(jié)束后用低溫孔板離心機(3000r mirTSfC )離心，IOmin ;棄上清,力口 O. 4mol · L—1的鹽酸化異丙醇，每孔100 μ I ;待結(jié)晶物溶解后，用酶標(biāo)儀于492nm處測定吸光度。按下列公式計算抑制率生長抑制率=(1-用藥平均A值/對照平均A值)X100%。結(jié)果表明，牡蠣蛋白多肽對小鼠淋巴細(xì)胞生長和Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，呈現(xiàn)良好的濃度依賴性。
實施例6
內(nèi)切酶的制備以木瓜蛋白酶制備為例，從木瓜樹或果實取下新鮮木瓜漿，先用蒸餾水或去離子水沖稀或溶解木瓜膠乳，加入無機酸使雜質(zhì)沉淀，離心、過濾，經(jīng)微濾與超濾、濃縮、真空冷凍干燥、粉碎、得木瓜蛋白酶，密封保存?zhèn)溆谩?br>外切酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30°C，濕度85%的密閉容器中發(fā)酵3. 5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存?zhèn)溆谩?br>風(fēng)味酶的制各以大豆或豆柏、麥款為原料，按常規(guī)的方法，格大豆或豆柏、麥款粉碎，先滅菌，再加入乳酸菌、酵母茵等菌種，在常溫下發(fā)酵1. 5天，提取、分離、超濾等方法取得溶液，然后凍干，粉碎得到風(fēng)味酶，保存?zhèn)溆谩?br>將上述的內(nèi)切酶、外切酶、風(fēng)味酶按質(zhì)量份數(shù)50 34 15的比例，并加入I份焦亞硫酸鈉，即稱取50kg木瓜蛋白酶,34kg外切酶，15kg風(fēng)味酶及Ikg焦亞硫酸鈉,混合,得IOOkg植物蛋白水解復(fù)合酶， 置于10°C的冰箱保存。
將牡蠣去殼，搗碎，按照1:1的重量比例加入蒸餾水，在室溫下勻漿，得到牡蠣漿液；向牡蠣漿液加入牡蠣蛋白重量1. 5%。的植物蛋白水解復(fù)合酶，在60°C下進行酶解反應(yīng)4h ;將酶解反應(yīng)完成后的牡蠣漿液置于95°C下滅酶IOmin ;采用甲醛滴定法測定氨基氮總量，凱氏定氮法測定總氮；酶滅活后的牡蠣漿液保持70°C，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4. 5;牡蠣漿液調(diào)節(jié)PH值后，加入活性炭溶液進行脫色，脫色時間35min ;將脫色后的牡蠣漿液用MWC03000超濾膜，在真空減壓下抽濾，得到濾液；將濾液冷凍干燥，即可獲得分子量小于3000Da的牡蠣蛋白多肽。
將小鼠淋巴細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞調(diào)到濃度為IxlO5個/ml后加入96孔板，每孔100 μ 1，用無小牛血清的PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA濃度配制為濃度為Img ^r1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA母液稀釋濃度為I μ g .mr1,然后用該培養(yǎng)基把分子量小于3000的牡蠣活性肽凍干粉配成需要的濃度31. 25 Ug -πιΓ1,每孔加該溶液lOOul，加到孔板后PHA的終濃度為O. 5μ g πιΓ1，牡蠣蛋白多肽終濃度15. 625 Ug πιΓ1，每孔液體終體積200 μ I。每組各做3個復(fù)孔，所設(shè)的3個空白孔為IOOul細(xì)胞懸液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培養(yǎng)基。將加好樣品的96孔板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)條件為37°C、5% C02。于培養(yǎng)結(jié)束前4小時加入511^*1111-現(xiàn)1'1'，每孔2(^1。培養(yǎng)結(jié)束后用低溫孔板離心機(3000r mirTSfC )離心，IOmin ;棄上清,力口 O. 4mol · L—1的鹽酸化異丙醇，每孔100 μ I ;待結(jié)晶物溶解后，用酶標(biāo)儀于492nm處測定吸光度。按下列公式計算抑制率生長抑制率=(1-用藥平均A值/對照平均A值)X100%。結(jié)果表明，牡蠣蛋白多肽對小鼠淋巴細(xì)胞生長和Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，呈現(xiàn)良好的濃度依賴性。
實施例7:
內(nèi)切酶的制備堿性蛋白酶制備，用已知方法經(jīng)發(fā)酵提取得到，密封保存?zhèn)溆谩?br>外切酶的制備以大豆或豆柏、麥款為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30°C，濕度88%的密閉容器中發(fā)酵2. 5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存?zhèn)溆谩?br>風(fēng)味酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規(guī)的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，先滅菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌種，在常溫下發(fā)酵2. 5天，提取、分離、超濾等方法取得溶液，然后凍干，粉碎得到風(fēng)味酶，保存?zhèn)溆谩?br>將上述的內(nèi)切酶、外切酶、風(fēng)味酶按質(zhì)量份數(shù)75 10 14的比例，并加入I份焦
亞硫酸鈉，混合，得到植物蛋白水解復(fù)合酶，置于10°c的冰箱保存。
將牡蠣去殼，搗碎，按照1:1的重量比例加入蒸餾水，在室溫下勻漿，得到牡蠣漿液；向牡蠣漿液加入牡蠣蛋白重量2. 0%。的植物蛋白水解復(fù)合酶，在50°C下進行酶解反應(yīng)5h ;將酶解反應(yīng)完成后的牡蠣漿液置于90°C下滅酶15min ;采用甲醛滴定法測定氨基氮總量，凱氏定氮法測定總氮；酶滅活后的牡蠣漿液保持70°C，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4. 5;牡蠣漿液調(diào)節(jié)PH值后，加入活性炭溶液進行脫色，脫色時間35min ;將脫色后的牡蠣漿液用MWC03000超濾膜，在真空減壓下抽濾，得到濾液；將濾液冷凍干燥，即可獲得分子量小于3000Da的牡蠣蛋白多肽。
將小鼠淋巴細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞調(diào)到濃度為IxlO5個/ml后加入96孔板，每孔100 μ 1，用無小牛血清的PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA濃度配制為濃度為Img ·πι1-1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培養(yǎng)基將PHA母液稀釋濃度為I μ g ·πι1-1，然后用該培養(yǎng)基把分子量小于3000的牡蠣活性肽凍干粉配成需要的濃度15. 625μ g · ml_l，每孔加該溶液lOOul，加到孔板后PHA的終濃度為O. 5μ g ·πι1-1，牡蠣蛋白多肽終濃度7. 8125yg*ml-l,每孔液體終體積200 μ I。每組各做3個 復(fù)孔，所設(shè)的3個空白孔為IOOul細(xì)胞懸液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培養(yǎng)基。將加好樣品的96孔板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)條件為37°C、5% C02。于培養(yǎng)結(jié)束前4小時加入5mg ·ι 1-1ΜΤΤ，每孔20 μ I。培養(yǎng)結(jié)束后用低溫孔板離心機(3000r · min-1,4。。)離心，IOmin ;棄上清,力口 O. 4mol · L-1的鹽酸化異丙醇，每孔100 μ I ;待結(jié)晶物溶解后，用酶標(biāo)儀于492nm處測定吸光度。按下列公式計算抑制率生長抑制率=(1-用藥平均A值/對照平均A值)X100%。結(jié)果表明，牡蠣蛋白多肽對小鼠淋巴細(xì)胞生長和Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，呈現(xiàn)良好的濃度依賴性。
權(quán)利要求
1.一種用復(fù)合酶水解牡蠣蛋白制備活性肽的方法，其特征是，按照以下步驟制備①將牡蠣去殼、搗碎，按照1:1的重量比例加入蒸餾水，勻漿，得到牡蠣漿液；②將牡蠣漿液進行酶解反應(yīng)，所述酶解反應(yīng)所用酶為植物蛋白水解復(fù)合酶；所述植物蛋白水解復(fù)合酶加入量為牡蠣蛋白重量的O. 5-2.0%;所述酶解反應(yīng)溫度為40-60°C，反應(yīng)時間3-5h ；③酶解反應(yīng)結(jié)束后給牡蠣漿液滅酶；④滅酶后的牡蠣漿液用鹽酸調(diào)節(jié)PH值；將滅酶后的牡蠣漿液調(diào)節(jié)pH值至3-5；⑤將調(diào)節(jié)PH值后的牡蠣漿液進行脫色；⑥將脫色后的牡蠣漿液用抽濾膜進行抽濾，得到濾液；所述抽濾膜規(guī)格為MWC03000；⑦將所得濾液冷凍干燥，即可獲得分子量小于3000Da的牡蠣蛋白多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用復(fù)合酶水解牡蠣蛋白制備活性肽的方法，其特征是，所述勻漿在室溫下進行。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用復(fù)合酶水解牡蠣蛋白制備活性肽的方法，其特征是，所述滅酶溫度為90-100°C，時間10-15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用復(fù)合酶水解牡蠣蛋白制備活性肽的方法，其特征是，所述脫色采用的脫色劑為活性炭溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的用復(fù)合酶水解牡蠣蛋白制備活性肽的方法，其特征是，所述抽濾是在真空減壓條件下進行的。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種用復(fù)合酶水解牡蠣蛋白制備活性肽的方法。該方法是將牡蠣去殼，搗碎，加蒸餾水，勻漿，酶解，滅酶，調(diào)節(jié)pH值，真空減壓抽濾及冷凍干燥后，獲得一種分子量小于3000Da的活性肽。本發(fā)明制備出的牡蠣活性多肽純度高，能降低抗體免疫反應(yīng)，是一種潛在的免疫抑制劑。
文檔編號C12P21/06GKCN102250997 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201110127482
公開日2013年4月10日 申請日期2011年5月17日
發(fā)明者李超柱, 陳艷輝, 黎丹戎 申請人:欽州學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (4), 非專利引用 (2),