專利名稱：生產(chǎn)活的四倍體牡蠣的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方式涉及以高效率生產(chǎn)活的四倍體牡蠣的方法。
背景技術(shù)：
大多數(shù)有性繁殖的動(dòng)物具有兩組染色體，它們被稱為二倍體。減數(shù)分裂是一種使染色體數(shù)量減半的過程，以避免各代的染色體數(shù)量加倍。這種過程有兩個(gè)步驟，通過所述步驟，一個(gè)二倍體細(xì)胞變?yōu)樗膫€(gè)單倍體細(xì)胞，每個(gè)單倍體細(xì)胞具有一組染色體。一個(gè)或所有四個(gè)單倍體細(xì)胞可以成熟為有功能的卵子或精子，其被稱為配子。四倍體牡蠣對于實(shí)現(xiàn)多種目的是重要的，包括三倍體、雜交和其它育種方案。已知的是，在二倍體牡蠣的正常繁殖期期間，與二倍體牡蠣相比，三倍體牡蠣具有更好的口味和更高的生長速度的商業(yè)優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前，已經(jīng)利用特別的染色體組改變技術(shù)從正常的二倍體牡蠣生產(chǎn)三倍體牡蠣，其中卵母細(xì)胞中的減數(shù)分裂被改變，從而在第二次減數(shù)分裂期間在卵母細(xì)胞中保留第二極體，而不是從卵母細(xì)胞中排出。細(xì)胞松弛素B (CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)已知作為在受精卵的減數(shù)分裂期間防止第一極體(PBl)從細(xì)胞中排出的化合物。然而，即使根據(jù)上述常規(guī)技術(shù)，已知還沒有利用細(xì)胞松弛素B(CB)和6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)的組合生產(chǎn)四倍體牡蠣的方法。

發(fā)明內(nèi)容
因而，本發(fā)明的目的是提供以高效率生產(chǎn)活的四倍體牡蠣的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)活的四倍體牡蠣的方法， 包括步驟用二倍體雄性牡蠣的精子使三倍體雌性牡蠣的卵受精；阻止第一極體從所述受精卵中排出；以及通過培養(yǎng)所述受精卵來生產(chǎn)活的四倍體牡蠣，其中阻止第一極體從所述受精卵中排出的步驟包括使所述受精卵接觸細(xì)胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤 (DMAP)。所述方法包括用二倍體雄性牡蠣的精子使三倍體牡蠣的卵受精的步驟。三倍體雌性牡蠣可以是商業(yè)上可獲得的(Allen, Jr. , S. K. (1988) ；Oceanus 31,58-63) 可以利用特別的染色體組改變技術(shù)從二倍體牡蠣生產(chǎn)三倍體牡蠣，其中卵母細(xì)胞中的減數(shù)分裂被改變，從而在第二次減數(shù)分裂期間在卵母細(xì)胞中保留第二極體，而不是從卵母細(xì)胞中排出?？梢栽诋a(chǎn)卵之前利用流式細(xì)胞計(jì)驗(yàn)證三倍體牡蠣的倍性。三倍體牡蠣的卵可以通過切開三倍體雌性牡蠣(剝離產(chǎn)卵(strip spawning))來采集。采集的卵可以用海水清洗并保持在合適的篩網(wǎng)上，例如25μπι篩網(wǎng)。本發(fā)明的實(shí)施方式中使用的三倍體牡蠣可以通過將它們置于高溫和富含飼料的環(huán)境中來調(diào)節(jié)。這種調(diào)節(jié)優(yōu)選地在緊接著冬眠之后的配子發(fā)生的初始期開始。接下來，用獲自正常的二倍體雄性牡蠣的精子使所述卵受精。用于受精的精子可以包括每個(gè)卵約10個(gè)或多于10個(gè)精細(xì)胞。受精可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法來進(jìn)行，例如，在海水中使卵和精子接觸。所述方法包括阻止第一極體從受精卵中排出的步驟。這個(gè)步驟可以包括使受精卵接觸細(xì)胞松弛素B (CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。所述接觸可以在受精卵排出第一極體的時(shí)間的30% 90%的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行。 此外，所述接觸可以在卵受精之后進(jìn)行5 15分鐘。阻止第一極體從受精卵中排出的步驟可以包括使受精卵同時(shí)接觸細(xì)胞松弛素 B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。此外，阻止第一極體從受精卵中排出的步驟可以包括使受精卵相繼接觸細(xì)胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。例如，阻止第一極體從受精卵中排出的步驟可以包括使受精卵接觸細(xì)胞松弛素B(CB)以及然后使受精卵接觸 6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。例如，阻止第一極體從受精卵中排出的步驟可以包括在受精卵排出第一極體的時(shí)間的30% 90%的時(shí)間范圍內(nèi)使受精卵接觸細(xì)胞松弛素B(CB)，然后在受精卵排出第一極體的時(shí)間的50% 90%的時(shí)間范圍內(nèi)使受精卵接觸6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。更具體地，阻止第一極體從受精卵中排出的步驟可以包括在卵受精之后使受精卵接觸細(xì)胞松弛素B (CB) 5 15分鐘，然后在卵受精之后使受精卵接觸6- 二甲基氨基嘌呤 (DMAP) 8. 3 15 分鐘。此外，阻止第一極體從受精卵中排出的步驟可以包括將受精卵加入到二甲亞砜 (DMSO)中0. 25 1. Oppm濃度的細(xì)胞松弛素B (CB)以及二甲亞砜(DMSO)中0. 25 1. Oppm 濃度的6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)之中。例如，阻止第一極體從受精卵中排出的步驟可以包括將受精卵加入到二甲亞砜(DMSO)中0.25 0.75 111濃度的細(xì)胞松弛素8(08)以及二甲亞砜(DMSO)中0. 25 0. 75ppm濃度的6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)之中。所述方法進(jìn)一步包括通過培養(yǎng)所述受精卵來生產(chǎn)活的四倍體牡蠣的步驟。所述培養(yǎng)可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何受精卵培養(yǎng)方法來進(jìn)行。例如，培養(yǎng)可以在 18°C 30°C，優(yōu)選23°C 的溫度條件下進(jìn)行。此外，培養(yǎng)可以在17ppt 33ppt，優(yōu)選約20ppt 22ppt的鹽度條件下進(jìn)行。在所述方法中，使用的牡蠣可以屬于巨蠣(crassostrea)屬。巨蠣屬的牡蠣可 [=| ix^i^lj (crassostrea gigas) > crassostrea sikamai> τ Γ^Jg (crassostrea
revularis)和美洲牡蠣(crassostrea virginica)中之一。此外，使用的牡蠣可以屬于珠母貝(pinctada)屬。例如，牡蠣可以是黑蝶珠母貝(pinctada mar gar it if era)。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以生產(chǎn)四倍體牡蠣，其可以在天然培育正常二倍體牡蠣的自然環(huán)境下生長和成熟，以及可以通過四倍體牡蠣和二倍體牡蠣之間的雜交生產(chǎn)三倍體牡蠣。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，可以以高效率從三倍體牡蠣和二倍體牡蠣生產(chǎn)四倍體牡蠣。
具體實(shí)施例方式在下文中將詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。然而要理解的是，以說明性的方式、 而不是以限制性的方式來提供這個(gè)實(shí)施方式，以解釋本發(fā)明的精神。這個(gè)實(shí)施方式利用第二年的三倍體太平洋牡蠣，其是通過阻止第二極體(PB2)排出來生產(chǎn)的。在產(chǎn)卵之前通過流式細(xì)胞計(jì)分別驗(yàn)證三倍體牡蠣。通過剝離產(chǎn)卵的方式采集它們的配子。使卵通過85μπι的篩網(wǎng)來除去大的組織碎片，在25μπι篩網(wǎng)上清洗。受精和處理全部在由2 μ m篩網(wǎng)過濾的25°C 的海水中進(jìn)行。這個(gè)實(shí)施方式中使用的海水的鹽度是約20ppt 22ppt。用來自二倍體牡蠣的單倍體精子使來自三倍體牡蠣的卵受精。將受精卵分成對照組、比較組和實(shí)驗(yàn)組。對照組的受精卵不用化學(xué)物質(zhì)處理來培養(yǎng)。比較組1和2的受精卵用細(xì)胞松弛素 B(CB)處理以阻止第一極體的排出。將CB溶解在二甲亞砜(DMSO)中，在CB終濃度0. 25mg/ 1、含有0. 5% DMSO的情況下(比較組1)以及在CB終濃度0. 5mg/l、含有0. 5% DMSO的情況下(比較組2)加入受精卵。比較組3和4的受精卵用6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)處理以阻止第一極體的排出。將DMAP溶解在二甲亞砜(DMSO)中，在DMAP終濃度0. 25mg/l、含有0. 5% DMSO的情況下(比較組幻以及在DMAP終濃度0. 5mg/l、含有0. 5% DMSO的情況下(比較組4)加入受精卵。實(shí)驗(yàn)組1和2的受精卵用CB和DMAP處理以阻止第一極體的排出。將CB和DMAP 溶解在DMSO中，在終濃度0. 25mg CB/1和0. 25mg DMAP/1、含有0. 5% DMSO的情況下(實(shí)驗(yàn)組1)以及在終濃度0. 5mg CB/1和0. 5mgDMAP/l、含有0. 5% DMSO的情況下(實(shí)驗(yàn)組2) 加入受精卵。在對照組、比較組1和2以及實(shí)驗(yàn)組1和2中，處理從受精后五分鐘開始持續(xù)15 分鐘。在處理之后，受精卵用DMSO-海水清洗，以65個(gè)卵/ml的密度培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組3的受精卵用CB和DMAP處理來阻止第一極體的排出。將CB和DMAP溶解在DMSO中，在終濃度0. 25mg CB/1、含有0. 5% DMSO的情況下加入受精卵，在受精后五分鐘開始處理。在受精后經(jīng)過10分鐘，在終濃度為0.25mg DMAP/1的情況下加入受精卵，受精后連續(xù)處理15分鐘(實(shí)驗(yàn)組3)。實(shí)驗(yàn)組4的受精卵用CB和DMAP處理以阻止第一極體的排出。將CB和DMAP溶解在DMSO中，在終濃度0. 5mg CB/1、含有0. 5% DMSO的情況下加入受精卵，在受精后五分鐘開始處理。在受精后經(jīng)過10分鐘，在終濃度為0. 5mg DMAP/1的情況下加入受精卵，受精后連續(xù)處理15分鐘(實(shí)驗(yàn)組4)。在實(shí)驗(yàn)組3和4中，在處理之后，受精卵用1 % DMSA-海水清洗，以65個(gè)卵/ml的密度培養(yǎng)。[表1]
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)活的四倍體牡蠣的方法，包括步驟用二倍體雄性牡蠣的精子使三倍體雌性牡蠣的卵受精；阻止第一極體從所述受精卵中排出；和通過培養(yǎng)所述受精卵來生產(chǎn)活的四倍體牡蠣，其中阻止第一極體從所述受精卵中排出的步驟包括使所述受精卵接觸細(xì)胞松弛素 B(CB)和6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，阻止第一極體從所述受精卵中排出的步驟包括使所述受精卵同時(shí)接觸細(xì)胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，阻止第一極體從所述受精卵中排出的步驟包括使所述受精卵相繼接觸細(xì)胞松弛素B (CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，阻止第一極體從所述受精卵中排出的步驟包括使所述受精卵接觸細(xì)胞松弛素B(CB)，然后使所述受精卵接觸6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，阻止第一極體從所述受精卵中排出的步驟包括在受精卵排出第一極體的時(shí)間的30% 90%的時(shí)間范圍內(nèi)使受精卵接觸細(xì)胞松弛素B(CB)，然后在受精卵排出第一極體的時(shí)間的50% 90%的時(shí)間范圍內(nèi)使受精卵接觸6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，阻止第一極體從受精卵中排出的步驟包括在卵受精之后使受精卵接觸細(xì)胞松弛素B (CB) 5 15分鐘，然后在卵受精之后使受精卵接觸6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)8. 3 15分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，阻止第一極體從受精卵中排出的步驟包括將受精卵加入到二甲亞砜(DMSO)中0. 25 1. Oppm濃度的細(xì)胞松弛素B (CB)以及二甲亞砜(DMSO) 中0. 25 1. Oppm濃度的6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)之中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中，阻止第一極體從受精卵中排出的步驟包括將受精卵加入到二甲亞砜(DMSO)中0. 25 0. 75 111濃度的細(xì)胞松弛素8(08)以及二甲亞砜(DMSO) 中0. 25 0. 75ppm濃度的6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)之中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述接觸在受精卵排出第一極體的時(shí)間的30% 90%的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述接觸在卵受精后進(jìn)行5 15分鐘。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述培養(yǎng)在18°C 30°C的溫度以及17ppt 33ppt 的鹽度的條件下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明的一個(gè)詳細(xì)的實(shí)施例提供了利用細(xì)胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)的組合有效地生產(chǎn)四倍體牡蠣的方法。
文檔編號C12N15/01GK102573453SQ201080046057
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日
發(fā)明者鄭承勛 申請人:西亞益維株式會社