專利名稱:一種漆酶催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酶制劑 和天然產(chǎn)物修飾領域，尤其涉及一種漆酶催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法。
背景技術：
漆酶(Laccase，ECl. 10. 3. 2)，是一類可降解木質素的含銅多酚氧化酶，具有特征性吸收光譜，早在1883年，由日本學者Yoshida首先在漆樹中發(fā)現(xiàn)。研究表明，漆酶的催化氧化反應需要氧氣作為中間物，漆酶在有氧條件下催化氧化底物，同時分子氧被還原為水。漆酶是一種作用底物廣泛的酶，可催化多種具有芳香環(huán)化合物的生物轉化，據(jù)初步統(tǒng)計，可被漆酶催化氧化的底物類型已達250個，而且還有增加的趨勢。根據(jù)底物的結構，可將底物歸納為六類(I)酚及其衍生物約占漆酶底物總數(shù)一半，主要是鄰、對苯二酚等多元酚及其衍生物；(2)芳胺及其衍生物其結構特點與酚類底物相似，主要是多氨基苯及其衍生物；(3)羧酸及其衍生物一般指在芳香酸底物中，芳環(huán)羧基的鄰、對位連有羥基、烷氧基或氨基；在非芳香羧酸中，碳鏈上連有酚或芳胺類基團。如對香豆酸、咖啡酸等；(4)留體激素和生物色素在有機溶劑和磷酸鹽緩沖液中，真菌漆酶可催化氧化雌留二醇、雌激素三醇等；(5)金屬有機化合物如二茂鐵(Fc-H)及其衍生物FcR(R = CH2OH, COO-, CH2Fc等)；
(6)其他非酚底物除了早期發(fā)現(xiàn)的亞鐵氰化鉀、抗壞血酸等外，近年來還發(fā)現(xiàn)了 I-苯基-2-(3，4- 二甲氧基苯基)己二醇和吲哚的衍生物等。
由于漆酶的氧化還原電勢較低，在催化過程中僅能直接氧化降解一些低氧化還原電勢的底物，因此常在漆酶反應體系中加入一些介體，這些介體是一些低氧化還原電勢的化合物，在漆酶催化氧化過程中作為電子傳遞的載體。介體在酶的作用下會形成活性高且有一定穩(wěn)定性的中間體，這些中間體能從氧分子中獲得電子傳遞給底物，從而達到氧化底物的目的。
白樣脂醇(betulin,lup-20 (29) _ene_3 β , 28-diol)和白樣脂酸(betulinicacid, 3 β -hydroxy-lup-20 (29) -en-28-oic acid)屬羽扇燒型三職類化合物，在天然界中廣泛存在，尤其是白樺樹(Betula spp.)中。近年科學研究發(fā)現(xiàn)，白樺脂醇和白樺脂酸表現(xiàn)出極高的藥理活性，特別是在抗HIV和癌癥治療等方面表現(xiàn)出巨大的潛能，并顯示出與以往藥物不同的作用機制。因此，對白樺脂醇和白樺脂酸及其衍生物的研究已成為近年來天然有機藥物研究的熱點。尤其是白樺脂酸，具有寬范圍的生物學以及藥理學活性，具有抗瘧性、抗炎性和抗腫瘤活性，在抗艾滋病活性及抗各種腫瘤細胞系細胞毒性方面可與一些臨床用藥相比，已被視為最有潛力的新型藥物制劑。在我國，白樺樹分布范圍廣，植物資源豐富，但研究開發(fā)甚少。
白樺脂酸在實際生產(chǎn)中的來源主要有兩類一類是從天然植物中提取；另一類是化學合成。白樺脂酸廣泛分布于多種植物中，如五加科(刺五加)、樺木科(白樺外皮)、鼠李科(酸棗仁)、柿科(白黑柿葉)等。因此，早期的白樺脂酸提取大多采用直接提取法。然而，白樺脂酸在植物中的含量極低，據(jù)文獻報道白樺樹皮中白樺脂酸的含量僅為O. 025%。直接提取法原料消耗量大，成本高，所得到的白樺脂酸雜質含量比較高，且不易除去，無法滿足商業(yè)需要。目前，以白樺脂醇為前體，經(jīng)過化學合成法制備白樺脂酸較多地應用于生產(chǎn)實踐中，雖然合成效果較好，但存在操作復雜、污染大、合成成本高、安全性低等問題，限制了其在實際中的應用。
近年來利用生物轉化法合成白樺脂酸逐漸引起重視，發(fā)明專利CN200810163820. 7中公開了一種微生物細胞生物轉化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，相比化學合成法具有操作簡便、易于控制、成本低廉、安全可靠等特點，但該方法利用微生物全細胞通過直接生長法或靜息細胞法或微乳液體系法對白樺脂醇底物進行催化轉化，操作過程中需要預培養(yǎng)菌體或制備靜息細胞等，步驟較繁瑣，且轉化周期較長。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種漆酶催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，利用漆酶將白樺脂醇底物生物轉化成白樺脂酸，該方法操作簡便，轉化周期短，轉化效率高。
一種漆酶催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，包括
將白樺脂醇溶液與漆酶加入緩沖溶液中，混合均勻得到反應液，于25 30°C條件下反應8 28h后經(jīng)分離純化得到白樺脂酸。
所述的白樺脂醇可以為市售商品或自制產(chǎn)品，純度為90%。公開號CN101328201A中國專利公開了純度90 %左右的白樺脂醇提取物的制備方法，采用此方法自制白樺脂醇作為本發(fā)明的底物更具現(xiàn)實意義，可以降低生產(chǎn)成本和綜合利用資源。
所述的白樺脂醇溶液為白樺脂醇的二甲基亞砜溶液，即該溶液的溶劑為二甲基亞砜。二甲基亞砜是重要的極性非質子溶劑，它可與許多有機溶劑及水互溶，對某些反應具有加速、催化、提高收率、改革產(chǎn)品性能等作用，本發(fā)明采用二甲基亞砜作為白樺脂醇底物的溶劑，更有利于底物與酶的接觸。
所述的白樺脂醇溶液中白樺脂醇濃度為7 9mg/mL，優(yōu)選8mg/mL ；白樺脂醇溶液的加入量以每升反應液計為I 20mL，優(yōu)選10mL。選擇該添加濃度既能保證漆酶對底物的充分催化，又能有效減少二甲基亞砜和白樺脂醇對水相反應液中漆酶催化活性的負面影響。
所述的漆酶為市售商品,來源于白腐真菌屬變色栓菌(Trametesversicolor)。酶活的定義25°C條件下，pH 3.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，每分鐘使Iymol 2，2’ -聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)氧化所需要的酶量為一個酶活單位。本發(fā)明中漆酶的加入量以每升反應液計為7. 667U 23U，優(yōu)選15. 33U。
所述的緩沖溶液為pH 2. O 5. O的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，優(yōu)選pH3. O的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液。反應體系pH值對漆酶酶活有較顯著影響，本發(fā)明在所選緩沖液條件下，漆酶催化活性最高。所述的pH 2. O 5. O的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液采用本領域常規(guī)的配制方法進行配制即可。
介體是一些低氧化還原電勢的化合物，可在漆酶催化氧化過程中作為電子傳遞的載體。理想的介體必須是漆酶的良好底物，它的氧化態(tài)和還原態(tài)必須是穩(wěn)定的，而且又不影響漆酶的反應；另外，介體氧化還原的轉化必須是循環(huán)的。常用的介體是一些酚型化合物和雜環(huán)，如卟啉類化合物等。這些介體物質有的來源于真菌次生代謝產(chǎn)物或木素降解產(chǎn)物，如紫丁香醛、乙酰香草酮和乙酰丁香酮等；有的來自于人工合成化合物，如2，2’ -聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽、I-羥基苯并三唑、紫尿酸、N-羥基-N-乙酰基苯胺、N-羥基丁酰苯胺等。本發(fā)明中，在反應液中添加介體，所述的介體選自2，2’ -聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，紫脲酸，2-乙酰胺基苯酚和I-羥基苯并三唑中的一種或多種，可直接采用市售產(chǎn)品，如Sigma公司生產(chǎn)的相關產(chǎn)品。每升反應液中介體的加入量為O. 015 O. 067mmol ο
所述的介體優(yōu)選紫脲酸，紫脲酸的加入量以每升反應液計優(yōu)選O. 067mmol，此條件下最有利于漆酶催化白樺脂醇合成白樺脂酸。
所述的反應溫度優(yōu)選為28°C ;所述的反應時間優(yōu)選為8h。所述的反應液置于旋轉式搖床中反應，搖床轉速為60 180rpm，優(yōu)選120rpm，便于反應過程中底物，漆酶和介體三者的充分混合。
所述的分離純化過程包括將反應后的反應液進行離心處理，取上清液，用乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)濃縮得到白樺脂酸。采用萃取的方法對產(chǎn)物進行分離純化，操作簡單方便，并且能從反應液中有效分離出所合成的白樺脂酸產(chǎn)物，便于后續(xù)定量分析。
本發(fā)明方法中白樺脂醇和白樺脂酸的檢測方法參照發(fā)明專利CN200810163820. 7中公開的相關部分。白樺脂酸得率(％)=生成的白樺脂酸質量(mg)/加入的白樺脂醇質量(mg) X 100%。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明方法利用漆酶催化白樺脂醇合成白樺脂酸，具有合成效率高、操作簡單、便于控制、周期短、安全可靠等優(yōu)點，為工業(yè)化生產(chǎn)白樺脂酸提供了理論依據(jù)和技術前提，同時也為五環(huán)三萜類天然活性物質的結構修飾提供了一條新思路。
具體實施方式
實施例1-4不同介體條件下白樺脂酸得率比較
向30mL，pH為3. O的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中依次加入300 μ L白樺脂醇的二甲基亞砜溶液(濃度為8mg/mL，白樺脂醇純度為90% )，50yL漆酶溶液(Sigma公司生產(chǎn)，來源于白腐真菌屬變色栓菌(Trametesversicolor),下同，濃度為4. 6U/mL)和200 μ L不同種類的介體溶液(濃度為5mmol/L)，其中所用介體分別為2，2’ -聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，紫脲酸，2-乙酰胺基苯酚或I-羥基苯并三唑，混合均勻得到反應液。反應液于28°C，轉速120rpm旋轉式搖床上反應8h，反應后的反應液經(jīng)3000rpm冷凍離心30分鐘，取上清液，用乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮得到白樺脂酸。采用RP-HPLC法對所得樣品中白樺脂醇和白樺脂酸的含量進行定量同步檢測，結果見表I。
表I不同介體條件下白樺脂酸得率比較
權利要求
1.一種漆酶催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，包括 將白樺脂醇溶液與漆酶加入緩沖溶液中，混合均勻得到反應液，于25 30°C條件下反應8 28h后經(jīng)分離純化得到白樺脂酸； 其中，所述的白樺脂醇溶液為白樺脂醇濃度達7 9mg/mL的二甲基亞砜溶液；以每升反應液計，白樺脂醇溶液的加入量為I 20mL ； 所述的漆酶的加入量以每升反應液計為7. 667U 23U ； 所述的緩沖溶液為PH2. O 5. O的Na2HPO4+梓檬酸緩沖液； 所述的反應液置于搖床中反應，搖床轉速為60 180rpm。
2.根據(jù)權利要求
I所述的方法，其特征在于所述的漆酶的加入量以每升反應液計為15. 33U。
3.根據(jù)權利要求
I所述的方法，其特征在于將白樺脂醇溶液、漆酶和介體加入緩沖溶液中，混合均勻得到反應液，于25 30°C條件下反應8 28h后經(jīng)分離純化得到白樺脂酸； 其中，所述的介體為2，2’-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，紫脲酸，2-乙酰氨基苯酚和I-羥基苯并三唑中的一種或多種。
4.根據(jù)權利要求
3所述的方法，其特征在于所述的介體的加入量以每升反應液計為O.015 O. 067mmolο
5.根據(jù)權利要求
3所述的方法，其特征在于所述的介體為紫脲酸。
6.根據(jù)權利要求
I所述的方法，其特征在于所述的分離純化包括將反應后的反應液進行離心處理，取上清液，用乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)濃縮得到白樺脂酸。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種漆酶催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，將白樺脂醇溶液、漆酶和介體加入pH 2.0～5.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，混合均勻得到反應液，于25～30℃，轉速60～180rpm搖床上反應8～28h后經(jīng)分離純化得到白樺脂酸；其中，白樺脂醇溶液加入量以每升反應液計為1～20mL，漆酶加入量以每升反應液計為7.667U～23U，所述的介體選自2，2’-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，紫脲酸，2-乙酰胺基苯酚和1-羥基苯并三唑中的一種或多種，每升反應液中介體的加入量為0.015～0.067mmol。采用本方法催化白樺脂醇合成白樺脂酸，具有合成效率高、操作簡單、便于控制、周期短、安全可靠等特點。
文檔編號C12P33/00GKCN102226213 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 201110100746
公開日2013年1月2日 申請日期2011年4月21日
發(fā)明者陳啟和, 劉婧, 傅明亮, 劉曉杰, 何國慶, 董亞晨, 馮宇 申請人:浙江大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan