一種油菜及其近緣植物干種子基因組dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種油菜及其近緣植物干種子基因組DNA提取方法，該方法包括以下步驟：⑴油菜及其近緣植物干種子加石英砂研成粉末后加提取液，研磨成勻漿；⑵勻漿裝入離心管，并水浴保溫以充分裂解；⑶離心管冰浴冷卻后加氯仿-異戊醇，混勻至不分層，離心得到上清液A；⑷上清液A中加NaCl，搖勻后加預(yù)冷無水乙醇，冰浴靜置，然后離心得到沉淀物A；⑸沉淀物A中加NaCl，待沉淀物溶解后再加氯仿-異戊醇，輕輕混勻至不分層，然后離心，得到上清液B；⑹上清液B中加NaCl和預(yù)冷無水乙醇，冰浴靜置，然后離心得到沉淀物B；⑺沉淀物B中加乙醇，洗滌沉淀后自然風(fēng)干，加入TE緩沖液進(jìn)行充分溶解，即得DNA提取液。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、實(shí)用，易于實(shí)施。
【專利說明】-種油菜及其近緣植物干種子基因組DNA提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)研究的【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種油菜及其近緣植物干 種子基因組DNA提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 甘肅河西地區(qū)氣候?qū)俑咴浒霛駶?rùn)氣候，晝夜溫差大，日照充足，有利于油菜脂 肪的形成和積累，油菜籽出油率達(dá)42%以上。民樂、山丹兩縣是河西油菜主產(chǎn)區(qū)，也是甘肅 最大的油菜連片種植示范基地，種植面積最大時(shí)達(dá)44萬多畝，是發(fā)展優(yōu)質(zhì)油菜的理想地 帶。該地區(qū)油菜在增加當(dāng)?shù)厝嗣袷杖敕矫嫫鸬搅朔e極作用。
[0003] 目前，存在的主要問題是：①隨著油菜品種數(shù)量日益增加，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，使 得完全根據(jù)形態(tài)性狀進(jìn)行油菜品種的鑒別越來越困難，給種子生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)、管理和維權(quán)等環(huán) 節(jié)帶來不同程度的困難，導(dǎo)致油菜品種多、亂、雜的現(xiàn)象日益突出，對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán) 重的影響。②至今，用于油菜品種純度鑒定，遺傳多樣性分析的技術(shù)主要是SSR和RAH)標(biāo)記 技術(shù)，而應(yīng)用這兩大技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是基因組DNA的有效提取。多數(shù)研究者以幼嫩的組織 如新鮮葉片提取基因組DNA，但在實(shí)際操作中，為得到幼嫩組織，必須在實(shí)驗(yàn)室條件下播種 或者田間取材，播種油菜或田間取材耗費(fèi)大量的人力物力和時(shí)間。③三大類型油菜籽、蕓芥 籽、白芥籽中均貯藏較多的蛋白質(zhì)和淀粉，采用一般的方法，如CTAB法、SDS法，提取的DNA 往往內(nèi)含雜質(zhì)（蛋白質(zhì)、多糖)，影響后續(xù)的種子純度鑒定或遺傳多樣分析等工作。同時(shí)，油 菜籽中還含有小分子次生物質(zhì)，如黃酮、香豆素、鞣質(zhì)等，其中含有酚羥基的化合物，氧化后 要與DNA結(jié)合，引起DNA降解。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡(jiǎn)便實(shí)用的油菜及其近緣植物干種子基 因組DNA提取方法。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種油菜及其近緣植物干種子基因組DNA提取方 法，包括以下步驟： ⑴將油菜及其近緣植物干種子〇. 5 ~lg置于研缽中，用研棒壓破，加幾顆石英砂后用力 粗研成粉末，然后再加入50(T700 PL提取液，迅速用力研磨成勻漿；所述提取液是按下述 方法制得： ① 將1.2114 g Tris加蒸饋水溶解，并定容至100 mL，即得0.1mol/L三輕甲基氨基甲 烷溶液； ② 吸取濃度為1(T14 mol/L分析純鹽酸0.85 mL，加水至IOOmL,混勻后用0.1 mol/L 標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，即得〇. lmol/L鹽酸； ③ 將50 mL所述0· lmol/L三羥甲基氨基甲烷溶液與29. 2mL所述0· lmol/L鹽酸混勻 后，加水稀釋至100 mL，即得pH =8. 0的0· 05mol/L Tris-HCl緩沖液； ④ 將14. 61g EDTA和4g氫氧化鈉加水溶解，并定容至100 mL，即得0. 5 mol/L乙二胺 四乙酸溶液； ⑤分別將l(T20g十六烷基三乙基溴化銨、f 3g二硫蘇糖醇、f 2g PEG8000用水溶解， 然后將該三種溶液混合，得到混合液； ⑦在所述混合液中依次加入9(Tl00 mL所述0.05mol/L Tris-HCl緩沖液、4(T50mL所 述0. 5 mol/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500mL即得； ⑵所述勻楽裝入2 mL的離心管中，并置于65 °C水浴中保溫15~20 min,每間隔5 min 輕輕搖動(dòng)離心管1次，以充分裂解； ⑶將所述步驟⑵所得的離心管采用冰浴冷卻后，加入50(Γ700 PL氯仿-異戊醇，混勻 至不分層，以1000(Tl2000 r/min的速率離心5 min，得到上清液A ; ⑷在300?400 μ?所述上清液A中加入150?200 PL、3mol/L的NaCl，搖勻后加入 70(Γ800 PL預(yù)冷無水乙醇，冰浴靜置5?10 min，然后在溫度為4°C的條件下以1000(Γ12000 r/min的速率離心5~8 min，得到沉淀物A ; (5) 在所述沉淀物A中加入30(Γ40〇μ?、I mol/L的NaCl，待所述沉淀物溶解后再加入 30(Γ400 PL氯仿-異戊醇，輕輕混勻至不分層，然后在溫度為4°C的條件下以1000(Γ12000 r/min的速率離心5 min,得到上清液B ; (6) 在30(Γ40〇μ?所述上清液B中依次加入3(Γ4〇μ?、1 mol/L的NaCl和800?900 μ?預(yù) 冷無水乙醇，冰浴靜置5?10 min，然后在溫度為4°C的條件下以1000(Tl2000 r/min的速率 離心5 min，得到沉淀物B ; ⑴所述沉淀物B中加入體積濃度為7(Γ75%的乙醇30(Γ400 μ?，洗滌沉淀2?3次后自 然風(fēng)干該沉淀物Β，然后加入5(Γ100 μ L、ρΗ=8的TE緩沖液進(jìn)行充分溶解，即得DNA提取 液。
[0006] 所述步驟⑴中油菜及其近緣植物干種子是指甘藍(lán)型油菜種子、白菜型油菜種子、 芥菜型油菜種子、青海白芥種子以及和田蕓芥種子中的任意一種。
[0007] 所述步驟⑶和所述步驟(5)中的氯仿-異戊醇是指將氯仿與異戊醇按24mL :1 mL的 體積比混合而成的混合物。
[0008] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明直接以油菜及其近緣植物干種子為材料進(jìn)行DNA提取，相比現(xiàn)有常用方法中 以葉片為材料的提取方法，不僅能獲得高質(zhì)量的DNA，而且簡(jiǎn)單快速，省去了育苗過程，在降 低實(shí)驗(yàn)成本的同時(shí)大大降低了工作效率。
[0009] 2、本發(fā)明所采用的提取液中EDTA的濃度為50 mmol/L，能保護(hù)DNA不被內(nèi)源核酸 酶降解，保證得到完整性較好的DNA。
[0010] 3、本發(fā)明種子和CTAB提取液之間的質(zhì)量體積比為0. 5?1 :70(Γ800 (g/μυ，不僅降 低了多糖對(duì)提取DNA的干擾作用，而且CTAB與核酸復(fù)合物沉淀容易產(chǎn)生，得到的DNA不宜 降解。
[0011] 4、本發(fā)明采用2~3XCTAB提取液，且在用乙醇沉淀DNA時(shí)采用高鹽法，使多糖保留 在溶液中，有效除去種子中的多糖，使2.0 < A260/A230 < 2. 5,從而獲得無多糖污染的DNA 樣品。
[0012] 5、本發(fā)明在提取液中加入廣3%的二硫蘇糖醇和廣2%的PEG，不但起到防止酚類氧 化的作用，還可防止酚類與DNA的結(jié)合，完全保護(hù)DNA的完整性。
[0013] 6、本發(fā)明通過氯仿-異戊醇混合液對(duì)先后得到的上清液進(jìn)行兩次抽提，然后用預(yù) 冷乙醇對(duì)上清液中的DNA進(jìn)行兩次沉淀，能有效除去種子中貯藏的蛋白質(zhì)，獲得無蛋白質(zhì) 污染的DNA樣品。
[0014] 7、本發(fā)明在適量提取液中研樣，不需液氮中冷凍研樣，也能防止DNA的降解，解決 了河西走廊油菜主產(chǎn)地區(qū)制造液氮及提供液氮的場(chǎng)地較少的問題。
[0015] 8、本發(fā)明材料易得，操作簡(jiǎn)便、實(shí)用，易于實(shí)施，在保證DNA提取量的前提下能夠 快速提取純度較高、完整性較好的基因組DNA，滿足油菜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和種子純 度檢測(cè)的需要，利于后續(xù)PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。
[0016] 9、對(duì)本發(fā)明所獲得的基因組DNA進(jìn)行測(cè)試。
[0017] ⑴所獲得的基因組DNA采用Nanaphotometer核酸蛋白分析儀測(cè)定各種DNA提取 樣品的 A260/A280, A260/A230, A320 值和濃度。
[0018] DNA純度檢測(cè)：若所測(cè)DNA樣品的A260/A280 ^ 1. 8，說明所提取的DNA樣品純度 較高，無蛋白質(zhì)污染。較純凈的核酸其A260/A230的比值大于2.0。若比值小于2.0,表明 樣品被糖類污染。A320為檢測(cè)溶液樣品的濁度和其他干擾因子，該值應(yīng)該接近0. 0。
[0019] 將總DNA在1?2%瓊脂糖凝膠（1?I. 5%Gold View I型核酸染色劑沖電泳，I X TAE 為電泳緩沖液，按5V/cm電泳3(T40 min。電泳結(jié)束后，在凝膠成相系統(tǒng)上觀察，記錄，并照 相。
[0020] (2) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)： 使用美國伯樂公司生產(chǎn)的MycyclerTM thermal cycler擴(kuò)增儀，對(duì)三大類型油菜 及其近緣植物的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25μ?，包括18. 5PL ddH20,2PL IOXbuffer (主要含 Mg2+)，2 μ? dNTPs，WL 引物，0·5μ? TaqDNA 聚合酶，WL 模板；反應(yīng) 條件為94°C預(yù)變性4min，然后進(jìn)行94°C50s，37°C退火Imin 20s，72°C延伸2min，35個(gè)循 環(huán)后，在72°C延伸lOmin。
[0021] ⑶實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見表1和圖廣6,通過表1可以看出，油菜及其近緣植物干種子基因 組DNA提取方法和傳統(tǒng)CTAB方法比較，從3種類型油菜和2種油菜近緣植物干種子中所提 取的基因組DNA的A260/A230, A320，A260/A280值都較理想。
[0022] 表1油菜及其近緣植物干種子基因組DNA提取方法和傳統(tǒng)CTAB方法的提取效果 比較

【權(quán)利要求】
1. 一種油菜及其近緣植物干種子基因組DNA提取方法，包括以下步驟： ⑴將油菜及其近緣植物干種子〇. 5 ~lg置于研缽中，用研棒壓破，加幾顆石英砂后用力 粗研成粉末，然后再加入50(T700 ML提取液，迅速用力研磨成勻漿；所述提取液是按下述 方法制得： @將1.2114 8!'1^8加蒸饋水溶解，并定容至10〇1111，即得0.11]1〇1凡三輕甲基氨基甲 烷溶液； ② 吸取濃度為1(T14 mol/L分析純鹽酸0? 85 mL，加水至100mL，混勻后用0? 1 mol/L 標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，即得〇. lmol/L鹽酸； ③ 將50 mL所述0? lmol/L三羥甲基氨基甲烷溶液與29. 2mL所述0? lmol/L鹽酸混勻 后，加水稀釋至100 mL，即得pH =8. 0的0? 05mol/L Tris-HCl緩沖液； ④ 將14. 61g EDTA和4g氫氧化鈉加水溶解，并定容至100 mL，即得0. 5 mol/L乙二胺 四乙酸溶液； ⑤ 分別將l(T20g十六烷基三乙基溴化銨、f 3g二硫蘇糖醇、f 2g PEG8000用水溶解， 然后將該三種溶液混合，得到混合液； ⑦在所述混合液中依次加入9(Tl00 mL所述0.05mol/L Tris-HCl緩沖液、4(T50mL所 述0. 5 mol/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500mL即得； ⑵所述勻楽裝入2 mL的離心管中，并置于65 °C水浴中保溫15~20 min,每間隔5 min 輕輕搖動(dòng)離心管1次，以充分裂解； ⑶將所述步驟⑵所得的離心管采用冰浴冷卻后，加入50(T700 ML氯仿-異戊醇，混勻 至不分層，以1000(Tl2000 r/min的速率離心5 min，得到上清液A ; ⑷在300?400 ML所述上清液A中加入150?200 ML、3mol/L的NaCl，搖勻后加入 70(T800 ML預(yù)冷無水乙醇，冰浴靜置5?10 min，然后在溫度為4°C的條件下以1000(Tl2000 r/min的速率離心5~8 min，得到沉淀物A ; (5) 在所述沉淀物A中加入30(T400ML、1 mol/L的NaCl，待所述沉淀物溶解后再加入 30(T400 ML氯仿-異戊醇，輕輕混勻至不分層，然后在溫度為4°C的條件下以1000(T12000 r/min的速率離心5 min,得到上清液B ; (6) 在30(T400ML所述上清液B中依次加入30?40ML、1 mol/L的NaCl和800?900 ML預(yù) 冷無水乙醇，冰浴靜置5?10 min，然后在溫度為4°C的條件下以1000(Tl2000 r/min的速率 離心5 min，得到沉淀物B ; (7) 所述沉淀物B中加入體積濃度為70?75%的乙醇30(T400 ML，洗滌沉淀2?3次后自 然風(fēng)干該沉淀物B，然后加入5(Tl00 y L、pH=8的TE緩沖液進(jìn)行充分溶解，即得DNA提取 液。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種油菜及其近緣植物干種子基因組DNA提取方法，其特征在 于：所述步驟⑴中油菜及其近緣植物干種子是指甘藍(lán)型油菜種子、白菜型油菜種子、芥菜型 油菜種子、青海白芥種子以及和田蕓芥種子中的任意一種。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種油菜及其近緣植物干種子基因組DNA提取方法，其特征在 于：所述步驟⑶和所述步驟(5)中的氯仿-異戊醇是指將氯仿與異戊醇按24mL :1 mL的體積 比混合而成的混合物。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104371995SQ201410586586
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】范惠玲 申請(qǐng)人:范惠玲