一種超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，步驟如下：1)乳豬肝預(yù)處理；2)均質(zhì)；3)超聲處理：將乳豬肝勻漿置于超聲波處理機(jī)內(nèi)利用超聲波在冰浴中處理得到超聲勻漿；4)胃蛋白酶的制備；5)酶解：超聲勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加鹽酸溶液至pH值為2.5-3.5，再加入胃蛋白酶攪拌后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于水浴鍋中水解得到酶解物料；6)滅活；7)離心；8)粗濾：將中性離心液先后經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置和截留分子量為10KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行過(guò)濾得到粗濾液；9)超濾：粗濾液經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液。
【專利說(shuō)明】一種超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素是一種刺激新生的人和動(dòng)物肝細(xì)胞DNA合成的藥物，可促進(jìn)肝細(xì)胞再生，加速肝臟組織的修復(fù)，恢復(fù)肝功能，改善肝臟枯否細(xì)胞的吞噬功能，防止來(lái)自腸道的毒素對(duì)肝細(xì)胞的損害，促進(jìn)肝壞死后的修復(fù)，而且對(duì)肝細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，對(duì)肝衰竭有明顯的提高存活力的作用。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素目前已經(jīng)有產(chǎn)品上市，以乳?；蛘呷樨i的新鮮肝臟器官為原料，經(jīng)生化加工制備得到。但現(xiàn)有的制備方法產(chǎn)率低、活性低、蛋白質(zhì)分子大、安全性不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]基本【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，采用超聲處理、酶解和超濾工藝，工藝簡(jiǎn)單溫和，而且節(jié)能環(huán)保，提取率高；所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的活性較高，并且分子量小于6000D，安全性高，對(duì)人的過(guò)敏反應(yīng)基本消除。
[0004]本發(fā)明提出的一種超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，包括如下步驟:
[0005]S1、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀，再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l_3mm的乳豬肝顆粒；
[0006]S2、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3300-3500rpm的轉(zhuǎn)速研磨l-2min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為11-12:11-12加入攪拌機(jī)中，以350-380rpm的轉(zhuǎn)速攪拌10_13min得到乳豬肝勻漿；
[0007]S3、超聲處理:將S2得到的乳豬肝勻漿置于超聲波處理機(jī)內(nèi)利用超聲波在冰浴中處理得到超聲勻漿，超聲波功率為570-600W，超聲波頻率為52-55kHz，超聲波處理時(shí)間為50_55s ；
[0008]S4、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，力口入1.4-1.7wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為25-28:26-29，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于45-48°C的水浴鍋中浸提70-73min得到浸提液，將浸提液以6500-6800rpm的轉(zhuǎn)速離心18_21min，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶；
[0009]S5、酶解:將S3得到的超聲勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加l_3mol/L鹽酸溶液至pH值為2.5-3.5，再加入S4得到的胃蛋白酶以230-245rpm的轉(zhuǎn)速攪拌30_33min后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于37-40°C的水浴鍋中水解6.5-7.5h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為99-101:1-1.4 ；
[0010]S6、滅活:將S5得到的酶解物料水浴加熱至81-82°c，保溫14_17min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；
[0011]S7、離心:將S6得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4700-5000rpm的轉(zhuǎn)速離心
8-llmin后，將上清液取出滴加l-3mol/L氫氧化鈉溶液至pH為6.8-7.2得到中性離心液；
[0012]S8、粗濾:將S7得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.06-0.09MPa ；
[0013]S9、超濾:將S8得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.12-0.15MPa，回流壓力為0.06-0.09MPa。
[0014]優(yōu)選地，S2中，將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3350-3450rpm的轉(zhuǎn)速研磨1.4-1.6min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為11.3-11.5:11.4-11.6加入攪拌機(jī)中，以360-370rpm的轉(zhuǎn)速攪拌ll_12min得到乳豬肝勻漿。
[0015]優(yōu)選地，S3中，將S2得到的乳豬肝勻漿置于超聲波處理機(jī)內(nèi)利用超聲波在冰浴中處理得到超聲勻漿，超聲波功率為580-590W，超聲波頻率為53-54kHz，超聲波處理時(shí)間為52-54s0
[0016]優(yōu)選地，S4中，取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.5-1.6wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為26-27:27-28，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于46-47 V的水浴鍋中浸提71-72min得到浸提液，將浸提液以6600-6700rpm的轉(zhuǎn)速離心19_20min，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶。
[0017]優(yōu)選地，S5中，將S3得到的超聲勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加1.6-2.3mol/L鹽酸溶液至PH值為2.8-3.2，再加入S4得到的胃蛋白酶以235-240rpm的轉(zhuǎn)速攪拌31_32min后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于38-39°C的水浴鍋中水解6.7-7.3h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為25:0.3。
[0018]優(yōu)選地，S7中，將S6得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4800-4900rpm的轉(zhuǎn)速離心
9-10min后，將上清液取出滴加1.6-2.2mol/L氫氧化鈉溶液至pH為6.9-7.1得到中性離心液。
[0019]優(yōu)選地，S9中，將S8得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.13-0.14MPa，回流壓力為0.07-0.08MPa。
[0020]上文中的KD為千道爾頓，D為道爾頓。
[0021]本發(fā)明將乳豬肝研磨成乳豬肝糜，促使部分肝細(xì)胞的細(xì)胞膜破碎，再通過(guò)加水?dāng)嚢瑁垢渭?xì)胞中的蛋白質(zhì)溶出；將乳豬肝勻漿進(jìn)行冰浴超聲處理，利用超聲波的空泡效應(yīng)，進(jìn)一步將肝細(xì)胞的細(xì)胞膜破碎，更加有利于肝細(xì)胞中的蛋白質(zhì)溶出，而冰浴的低溫不僅使肝細(xì)胞的細(xì)胞膜在熱脹冷縮的效應(yīng)下失去彈性，更易破碎，還能防止微生物的生長(zhǎng)繁殖，避免蛋白質(zhì)被消耗；將豬胃粘膜研磨后，加入1.4-1.7wt%鹽酸溶液消化豬胃粘膜細(xì)胞，再通過(guò)45-48°C時(shí)的浸提、離心封層和低溫干燥得到高活性的胃蛋白酶，而且胃蛋白酶產(chǎn)率高；向超聲勻漿中滴加鹽酸溶液一方面可以促使更多肝細(xì)胞破碎，加速蛋白質(zhì)溶出，另一方面還可以為下一步胃蛋白酶促進(jìn)蛋白質(zhì)水解營(yíng)造適宜的反應(yīng)環(huán)境，接著加入胃蛋白酶并攪拌，促使胃蛋白酶在酸性條件下與超聲勻漿充分接觸，在37-40°C的水浴鍋中水解6.5-7.5h，充分水解大分子蛋白質(zhì)，使之降解為小分子多肽鏈和小分子蛋白質(zhì)；而將酶解物料水浴加熱至81-82 °C，保溫14-17min，使胃蛋白酶和剩余的大分子蛋白質(zhì)變性，有效的殺死可能存在的病毒和細(xì)菌，同時(shí)保證小分子多肽鏈和小分子蛋白質(zhì)的生物活性；將滅活勻漿離心得到上清液使大分子蛋白質(zhì)沉淀，而小分子多肽鏈和小分子蛋白質(zhì)仍溶于溶液中；接著將中性離心液分別通過(guò)截留分子量為10KD的中空纖維超濾裝置和截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置，形成分級(jí)過(guò)濾，提高中性離心液的過(guò)濾效率，并得到分子量小于1KD的多肽和蛋白質(zhì)，同時(shí)控制回流壓力為0.06-0.09MPa，既提高了過(guò)濾效率，又能避免某些大分子在高壓下通過(guò)中空纖維超濾裝置；再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾，同時(shí)進(jìn)液壓力為0.12-0.15MPa和回流壓力為0.06-0.09MPa，使本發(fā)明所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中的分子小于6000D，大大提高了有效組分含量濃度，而且安全性高。
[0022]本發(fā)明采用超聲處理、酶解和超濾工藝，工藝簡(jiǎn)單溫和，而且節(jié)能環(huán)保，提取率高；所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的活性較高，并且分子量小于6000D，安全性高，對(duì)人的過(guò)敏反應(yīng)基本消除。

【具體實(shí)施方式】
[0023]下面，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0024]實(shí)施例1
[0025]本發(fā)明提出的一種超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，包括如下步驟:
[0026]S1、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀，再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l_3mm的乳豬肝顆粒；
[0027]S2、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3300rpm的轉(zhuǎn)速研磨2min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為11:12加入攪拌機(jī)中，以350rpm的轉(zhuǎn)速攪拌13min得到乳豬肝勻漿；
[0028]S3、超聲處理:將S2得到的乳豬肝勻漿置于超聲波處理機(jī)內(nèi)利用超聲波在冰浴中處理得到超聲勻漿，超聲波功率為570W，超聲波頻率為55kHz，超聲波處理時(shí)間為50s ；
[0029]S4、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.7wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為25:29，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于45°C的水浴鍋中浸提73min得到浸提液，將浸提液以6500rpm的轉(zhuǎn)速離心21min，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶；
[0030]S5、酶解:將S3得到的超聲勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加lmol/L鹽酸溶液至pH值為3.5，再加入S4得到的胃蛋白酶以230rpm的轉(zhuǎn)速攪拌33min后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于37°C的水浴鍋中水解7.5h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為99:1.4 ；
[0031]S6、滅活:將S5得到的酶解物料水浴加熱至82V，保溫14min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；
[0032]S7、離心:將S6得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心8min后，將上清液取出滴加3mol/L氫氧化鈉溶液至pH為6.8得到中性離心液；
[0033]S8、粗濾:將S7得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.06MPa ；
[0034]S9、超濾:將S8得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.15MPa，回流壓力為0.06MPa。
[0035]實(shí)施例2
[0036]本發(fā)明提出的一種超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，包括如下步驟:
[0037]S1、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀，再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l_3mm的乳豬肝顆粒；
[0038]S2、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3450rpm的轉(zhuǎn)速研磨1.4min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為11.5:11.4加入攪拌機(jī)中，以370rpm的轉(zhuǎn)速攪拌Ilmin得到乳豬肝勻漿；
[0039]S3、超聲處理:將S2得到的乳豬肝勻漿置于超聲波處理機(jī)內(nèi)利用超聲波在冰浴中處理得到超聲勻漿，超聲波功率為590W，超聲波頻率為53kHz，超聲波處理時(shí)間為54s ；
[0040]S4、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入
1.5wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為1:1，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于47°C的水浴鍋中浸提71min得到浸提液，將浸提液以6700rpm的轉(zhuǎn)速離心19min，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶；
[0041]S5、酶解:將S3得到的超聲勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加2.3mol/L鹽酸溶液至pH值為2.8，再加入S4得到的胃蛋白酶以240rpm的轉(zhuǎn)速攪拌3Imin后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于38°C的水浴鍋中水解7.3h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為25:0.3 ；
[0042]S6、滅活:將S5得到的酶解物料水浴加熱至81°C，保溫16min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；
[0043]S7、離心:將S6得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4800rpm的轉(zhuǎn)速離心1min后，將上清液取出滴加1.6mol/L氫氧化鈉溶液至pH為7.1得到中性離心液；
[0044]S8、粗濾:將S7得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.0SMPa ；
[0045]S9、超濾:將S8得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.13MPa，回流壓力為0.08MPa。
[0046]實(shí)施例3
[0047]本發(fā)明提出的一種超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，包括如下步驟:
[0048]S1、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀，再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l_3mm的乳豬肝顆粒；
[0049]S2、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3350rpm的轉(zhuǎn)速研磨1.6min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為11.3:11.6加入攪拌機(jī)中，以360rpm的轉(zhuǎn)速攪拌12min得到乳豬肝勻漿；
[0050]S3、超聲處理:將S2得到的乳豬肝勻漿置于超聲波處理機(jī)內(nèi)利用超聲波在冰浴中處理得到超聲勻漿，超聲波功率為580W，超聲波頻率為54kHz，超聲波處理時(shí)間為52s ；
[0051]S4、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.6wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為13:14，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于46°C的水浴鍋中浸提72min得到浸提液，將浸提液以6600rpm的轉(zhuǎn)速離心20min，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶；
[0052]S5、酶解:將S3得到的超聲勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加1.6mol/L鹽酸溶液至pH值為3.2，再加入S4得到的胃蛋白酶以235rpm的轉(zhuǎn)速攪拌32min后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于38°C的水浴鍋中水解7.3h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為25:0.3 ；
[0053]S6、滅活:將S5得到的酶解物料水浴加熱至81.2V，保溫15min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；
[0054]S7、離心:將S6得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4900rpm的轉(zhuǎn)速離心9min后，將上清液取出滴加2.2mol/L氫氧化鈉溶液至pH為6.9得到中性離心液；
[0055]S8、粗濾:將S7得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.07MPa ；
[0056]S9、超濾:將S8得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.14MPa，回流壓力為0.07MPa。
[0057]實(shí)施例4
[0058]本發(fā)明提出的一種超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，包括如下步驟:
[0059]S1、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀，再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l_3mm的乳豬肝顆粒；
[0060]S2、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3500rpm的轉(zhuǎn)速研磨Imin得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為12:11加入攪拌機(jī)中，以380rpm的轉(zhuǎn)速攪拌1min得到乳豬肝勻漿；
[0061]S3、超聲處理:將S2得到的乳豬肝勻漿置于超聲波處理機(jī)內(nèi)利用超聲波在冰浴中處理得到超聲勻漿，超聲波功率為600W，超聲波頻率為52kHz，超聲波處理時(shí)間為55s ；
[0062]S4、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.4wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為28:26，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于48°C的水浴鍋中浸提70min得到浸提液，將浸提液以6800rpm的轉(zhuǎn)速離心18min，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶；
[0063]S5、酶解:將S3得到的超聲勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加3mol/L鹽酸溶液至pH值為2.5，再加入S4得到的胃蛋白酶以245rpm的轉(zhuǎn)速攪拌30min后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于40°C的水浴鍋中水解6.5h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為101:1 ；
[0064]S6、滅活:將S5得到的酶解物料水浴加熱至81.5°C，保溫17min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；
[0065]S7、離心:將S6得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4700rpm的轉(zhuǎn)速離心Ilmin后，將上清液取出滴加lmol/L氫氧化鈉溶液至pH為7.2得到中性離心液；
[0066]S8、粗濾:將S7得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.09MPa ；
[0067]S9、超濾:將S8得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.12MPa，回流壓力為0.09MPa。
[0068]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 31、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5(^111的小塊或細(xì)條狀，再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為1-3皿的乳豬肝顆粒； 32、均質(zhì):將51得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3300-350011)111的轉(zhuǎn)速研磨1-2-=得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為11-12:11-12加入攪拌機(jī)中，以350-380^111的轉(zhuǎn)速攪拌10-130111得到乳豬肝勻漿； 33、超聲處理:將52得到的乳豬肝勻漿置于超聲波處理機(jī)內(nèi)利用超聲波在冰浴中處理得到超聲勻漿，超聲波功率為570-6001，超聲波頻率為52-55紐2，超聲波處理時(shí)間為50-553 ； 34、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.4-1.7被％鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(8/01)為25-28:26-29，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于45-481的水浴鍋中浸提70-73-=得到浸提液，將浸提液以6500-6800^111的轉(zhuǎn)速離心18-21-11,取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶； 35、酶解:將83得到的超聲勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加1-311101/1鹽酸溶液至邱值為2.5-3.5，再加入34得到的胃蛋白酶以230-24511)111的轉(zhuǎn)速攪拌30-33-11后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于37-401的水浴鍋中水解6.5-7.5卜得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為99-101:1-1.4 ； 36、滅活:將85得到的酶解物料水浴加熱至81-821，保溫14-17-11后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿； 37、離心:將36得到的滅活勻衆(zhòng)加入離心瓶中，以4700-500011)111的轉(zhuǎn)速離心8-110111后，將上清液取出滴加1-311101/1氫氧化鈉溶液至邱為6.8-7.2得到中性離心液； 38、粗濾:將37得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為1001(0的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為10X0的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.06-0.091？^ ； 39、超濾:將58得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為60000的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.12-0.151？3？回流壓力為0.06-0.09腿
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，其特征在于，52中，將31得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3350-345011)111的轉(zhuǎn)速研磨1.4-1.6111111得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為11.3-11.5:11.4-11.6加入攪拌機(jī)中，以360-370^111的轉(zhuǎn)速攪拌11-12-11得到乳豬肝勻漿。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，其特征在于，33中，將32得到的乳豬肝勻漿置于超聲波處理機(jī)內(nèi)利用超聲波在冰浴中處理得到超聲勻漿，超聲波功率為580-5901，超聲波頻率為53-54紐2，超聲波處理時(shí)間為52-548。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，其特征在于，34中，取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.5-1.6被％鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(8/01)為26-27:27-28，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于46-471的水浴鍋中浸提71-72-11得到浸提液，將浸提液以6600-6700印111的轉(zhuǎn)速離心19-2001??！，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，其特征在于，85中，將33得到的超聲勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加1.6-2.311101/1鹽酸溶液至邱值為2.8-3.2，再加入34得到的胃蛋白酶以235-24011)111的轉(zhuǎn)速攪拌31-32-11后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于38-391的水浴鍋中水解6.7-7.3卜得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為25:0.3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，其特征在于，37中，將36得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4800-490011)111的轉(zhuǎn)速離心9-100111后，將上清液取出滴加1.6-2.211101/1氫氧化鈉溶液至邱為6.9-7.1得到中性離心液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述超聲酶解促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的高效制備方法，其特征在于，39中，將38得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為60000的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.13-0.141？^回流壓力為0.07-0.081？3。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK104313100SQ201410586379
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】王康林, 陳玉海, 茍希霞 申請(qǐng)人:合肥平光制藥有限公司